Name: ヌクレオソームヒストンのインビトロユビキチン化とデュービキチン化アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: 学ぶヌクレオソームヒストンのインビトロユビキチン化とデュービキチン化アッセイ。精製した成分を用いて、細胞内の翻訳後修飾メカニズムと疾患関連酵素変異の影響を解明する方法です。

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私たちは、技術支援のためにダイアナ・アジャウドに感謝します。この研究は、カナダ自然科学工学研究評議会(2015-2020)、ゲノムケベック(2016-2019)、ゲノムカナダ(2016-2019)からE.B.A.E.B.A.への助成金によって支援されました。L.M.とN.S.K.はFRQ-Sから博士号を取得しています。H.Bは、高等教育省とチュニジアの科学研究とコール財団から博士号を取得しました。

1. GSH-アガロース親和性浄化 GST-RING1B(1-159)-BMI1(1-109) E3ユビキチン・リガセ・コンプレックス
<ol><li>pGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 aa) - BMI1(1-109aa)細菌発現構築物を使用してBL21(DE3)細菌を形質転換する(材料の表を参照)23。この構成により、pGEX-6P-2バックボーンにGSTタグを持つBMI1ドメイン1-109に融合したマウスリング1Bドメイン1-159の発現が可能になります。</li>
	<li>100 μg/mLアンピシリンおよび50 μg/mLクロラムフェニコールの存在下でLBブロス培地の20mLでGST-RING1B(1-159 aa)-BMI1(1-109 aa)を発現するRIL-細菌を接種して一晩スターター培養を行う。一晩37°Cで振ってインキュベートします。翌日、500mLの新鮮なLBブロス培地(1/26希釈)を含む1Lフラスコにスターター培養をアンピシリンで加え、シェーカーで培養を2~4時間37°Cでインキュベートします。</li>
	<li>
インキュベーション時間中に、分光光度計で600nmでODを測定します。細菌培養が600nmで0.6 OD単位に達した場合、非誘導サンプルとして1,5mLチューブに1mLのアリコートを取ります。1L培養物にイソプロピルβ-D-1-チオガラクピラノシド(IPTG)の400μMを添加し、タンパク質発現を誘導する。バクテリアを25°Cで6時間から一晩インキュベートします。
	<ol>
<li>1 mLアリコートを14,000 x gで30sで遠心分離し、上清を廃棄し、Laemmliサンプルバッファーの200μLでペレットを再懸濁し、SDS-PAGEおよびコマシーブルーのタンパク質誘導分析のために保ちます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>誘導細菌培養をフラスコからクリーン遠心ボトルに移し、3,500 x gで15分間4°Cでスピンダウンします。上清を廃棄し、40 mLの冷たいPBSでペレットを再懸濁し、4°Cで15分間3,500 x gでスピンダウンします。</li>
	<li>上清を捨て、-80°Cでペレットを凍結するか、次のステップに進みます。タンパク質が期待される分子量で誘導される場合は、次のステップに進みます。</li>
	<li>冷たいリシスバッファーA(50 mMトリス-HCl pH 7.5、25mLの細菌ペレットを再ステーペンド、 100 mM NaCl、 1 mM EDTA、1% NP40、1 mM PMSF、0.5 mM DTT、および AEBSF、アプロチニン、ベスタチン、E-64、ルペプチン、ペプスタチン A を含む 1/100 抗プロテアーゼカクテル) すべての細菌ペレットが再懸濁していることを確認します。PMSFおよび抗プロテアーゼカクテルは、細菌リシスの時にのみ、ライシスバッファーに新たに添加する必要があります。 注意:常に氷の上にサンプルを保管してください。 注:100 μg/mLのリソザイムを添加して細菌のライシスを増強することができます。</li>
	<li>15分間氷の上で細菌を吸収し、プローブ超音波装置と超音波処理器を30s(4-5x)の70%の出力振幅で使用し、その後4°Cで20分間21,000 x gで遠心分離機を使用します。 注意:超音波処理中は、常に氷の上にサンプルを保管してください。</li>
	<li>遠心分離の間、15 mLチューブに500 μLパックされたGSH-アガロースビーズ(50%スラリー)を取り、PMSFおよび抗プロテアーゼなしでバッファAの10 mLを追加します。短く混ぜ、4°Cで3分間2,500gで回転させ、この洗浄工程をもう2回繰り返し、ビーズを氷の上に置きます。</li>
	<li>細菌リサート遠心分離に続いて、上清を収集し、50 mL円錐形チューブに移します。総リサートとして100 μLのアリコートを取り、SDS-PAGEおよびクーマッシーブルー分析用に2x Laemmliサンプルバッファーの100 μLを追加します。</li>
	<li>0.45 μmの細孔シリンジフィルターを通してリサートを濾過し、GSHビーズと混ぜます。4 °Cで4°Cでインキュベートし、5時間振ってビーズを2,500 x gで3分間スピンダウンし、取り出し、流れとして上清を保存します。タンパク質-GSH結合ビーズを6回(各5mL)、抗プロテアーゼカクテルおよびPMSFを含むバッファーAで洗浄する。</li>
	<li>最後の洗浄後、10mLのバッファーとともにビーズを空のクロマトグラフィーカラムに移し、25mMグルタチオンを含む1.5mLバッファーAを追加し、重力による溶出を1.5mLマイクロチューブに集めます。溶出手順を4回繰り返します。 注:グルタチオンストック溶液は、50 mMトリス-HCl、pH 7.5で200mM濃度で調製</li>
	<li>4つの溶出液のそれぞれから10 μLのアリコートを取り、2x Laemmliサンプルバッファーの10 μLを追加します。これらのサンプルは、精製タンパク質の存在と純度を決定するために、SDS-PAGEおよびクーマッシーブルー分析に使用されます。 注:最後の溶出に続いて、リサイクルと将来の使用のために4°Cでビーズをバッファに保管してください。</li>
	<li>さらなる分析のために精製タンパク質の合理的な量を示すeluted画分を選択してください。準備の小さなアリコートを作ります。精製したタンパク質を-80°Cに保存します。通常、タンパク質濃度はμL当たり0.5μgから2μgの範囲であり、サンプルはこの状態で保存することができます。</li>
	<li>
オプション:10K遠心フィルターユニットを使用してサンプルまたは変更バッファを濃縮</li>
</ol>2. BAP1/DEUBAD(ASXL2)デュビキチナゼ複合体の精製
<ol><li>pET30a+-His-BAP138およびpDEST-MBP-DEUBAD(ASXL2)35の細菌発現構造を使用して、HIS-BAP1およびMBP-DEUBADの生産のためにBL21(DE3)RIL細菌をそれぞれ変換します。</li>
	<li>50 μg/mLクロラムフェニコルを含むアンピシリン培地のLBブロスの20mLで細菌を発現するHis-BAP1およびMBP-DEUBAD(ASXL2)をインキュベートすることにより、2つの別々の一晩スターター培養を行い、各プラスミド、100 μg/それぞれ100μg/mLのカナマイシンまたは100μg/mLのmL。37°Cでシェーカーに置きます。</li>
	<li>手順 1.3 ~ 1.6 を実行します。</li>
	<li>
冷たいリシスバッファーB(50 mMトリスpH 7.3、500 mM NaCl、3 mM β-メルカプトエタノール、0.2%トリトンX-100、1mM PMSFおよび1/100抗プロテアーゼカクテル)の25mLで細菌ペレットを再中断します。HIS-BAP1の同量をMBP-DEUBADと混合し、氷上で15分間インキュベートし、プロトコル1に示すようにライサテを遠心分離します(ステップ9)。
	<ol>
<li>遠心分離の間、PMSFおよび抗プロテアーゼカクテルなしでバッファーBでそれらを3回洗浄することにより、500 μLパックされたNi-NTAアガロースビーズ(50%スラリー)を調製します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>細菌リサート遠心分離に続いて、上清を収集し、50 mL円錐形チューブに移します。総リサートとして100 μLのアリコートを取り、SDS-PAGEおよびクーマッシーブルー分析用に2x Laemmliサンプルバッファーの100 μLを追加します。</li>
	<li>
0.45 μmの細孔シリンジフィルターを通してリサートを濾過し、Ni-NTAビーズと混ぜます。4°Cで4°Cでインキュベートし、5時間振ってビーズを2,500 x gで3分間スピンダウンし、取り出し、流れとして上清を保存します。
	<ol>
<li>20 mM 1,3-Diaza-2,4-シクロペンタジエン(イミダゾール)を含むバッファーBでビーズを6回(各5mL)洗います。 注:pH 7.3で2Mイミダゾールのストック溶液を作ります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>最後の洗浄後、10 mLのバッファーを持つビーズを空のクロマトグラフィーカラムに移し、200mMイミダゾールを含む1mLバッファーBを追加し、10 μL DTT(500mM)と2μL EDTA(500mM)を含む1.5mLマイクロチューブに重力による溶出を収集します。,pH:8)溶出手順を4回繰り返す。各溶出率の10 μLを取り、SDS-PAGEおよびCoomassieブルー分析用に2x Laemmliサンプルバッファーの10 μLを追加します。目的の eluted 分数をプールします。 注:リサイクルと将来の使用のために4 °Cでビーズをバッファに保管してください。</li>
	<li>
アミロセドースビーズをインキュベーションする前に、緩衝C(50 mMトリスpH 7.3、300 mM NaCl、1%トリトンX-100、5mM DTT、1mM EDTA、1mM PMSF、および1/100プロテアーゼ阻害剤カクテル)で3回希釈した複合体を希釈する。
	<ol>
<li>アミロースアガロースビーズ(500μLパック)をPMSFと抗プロテアーゼカクテルを加えずにバッファーCで2回洗浄して調製します。希釈溶出にビーズを加え、4°Cで一晩インキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>遠心分離機 2,500 x gで 3 分間、流れを維持します。タンパク質結合ビーズを5 mLのバッファーC(5~6倍)で洗浄します。 </li>
	<li>アミロスアガロースビーズの精製されたHIS-BAP1/MBP-DEUBAD複合体をバッファーD(50 mM HEPES pH 8.0、50 mM NaCl、10%グリセロール、1mM DTT)に保ち、-80°Cに保管してください。 ビーズ画分の20 μL(50%ビーズ溶液)を取り、SDS-PAGEおよびクーマッシーブルー分析用に2x Laemmliサンプルバッファーの20 μLを追加します。</li>
</ol>3. HEK293T細胞からの核生成
<ol><li>完全なダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)における培養HEK293T細胞は、5%の新生児子牛血清(NBS)、2mM L-グルタミン、および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した。</li>
	<li>プレートは12 x 106 HEK293T細胞を15cm培養皿当たり20mLの完全培養物で15cm培養皿の1日前(10皿使用)した。トランスフェクションの前に、細胞培地を12mLの無血清培地に変更し、1mg/mL36で63 μlのポリエチレンニミン(PEI)を用いて21μgのpCDNA-Flag-H2Aで細胞をトランスフェクトする。12時間後に完了する媒体に変更します。</li>
	<li>トランスフェクション後3日間、15mLの氷冷PBS(2回)で細胞を洗浄し、セルスクレーパーを使用して3mLの氷冷PBSで収穫します。4 °Cで8分間2,100 x gの遠心分離機。PBSを廃棄し、-80°Cで細胞ペレットを凍結またはリシス工程に進みます。</li>
	<li>約10体のバッファーE(50mMトリス-HCl pH 7.3、420mM NaCl、1%NP-40、1mM MgCl 2、1mM PMSF、1/100プロテアーゼ阻害剤カクテル、および20mMMのN-メチルマライミド(NEM)およびインクリプトを添加する。N-メチルマライミド(NEM)は、ヌクレオソームと共に精製するDUBを阻害するために重要です。</li>
	<li>
3,000 x gで5分間遠心分離した後、上清を廃棄し、クロマチンペレットを10巻のバッファーE.ミックスで5分間3,000 x gで再懸濁する。
	<ol>
<li>バッファEを使用して洗浄ステップをもう一度繰り返し、バッファーF「MNaseバッファ」(20 mM Tris-HCl pH 7.5、100 mM KCl、2 mM MgCl 2、1 mM CaCl 2、0.3Mスクロース、0.1%NP-40、1mM PMSF、および1/100プロケーターカクテル)。 注意:ペレットは、洗い流しや遠心分離の間に浮きます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>5 mLバッファーFでクロマチンを再ステーペンし、ペレットをマイクロコッカルヌクレアーゼ(MNase)で処理します(室温で10分間3U/mL)。 注:反応は、ダンスホモジナイザーを用いて混合することによって助けることができる。</li>
	<li>
インキュベーション後、ヌクレオソームDNA断片の分析のために混合物の40 μLアリコートを服用する。このアリコートをフェノール/クロロホルムの40 μLと6x DNA読み込みバッファーの20 μLと混合し、渦、18,000 x gで2分間スピンし、2%のアガロースゲルにDNAをロードします。
	<ol>
<li>DNAが主に単核球に対応する147 bp断片である場合は、最終濃度で5mM EDTAを加えて反応を停止する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>4°Cで20分間21,000 x gの遠心分離に続き、4°Cで一晩反フラグ樹脂で可溶性クロマチン画分をインキュベートします。ビーズを6xバッファーG(50 mMトリス-HCl、pH 7.3、5 mM EDTA、150 mM NaCl、1%NP-40、1mM PMSF、1 mM DTT、1/100プロテアーゼ阻害剤カクテル)で洗浄します。 </li>
	<li>5 mLバッファー Gを使用してビーズを空のクロマトグラフィーカラムに転送します。フラグ溶出ペプチドの200 μg/mLでビーズ結合ヌクレオソームを溶出します。200 μg/mL フラグ溶出ペプチド(材料の表を参照)と 1/5 (vol:vol) 1 M トリス、pH 8.0 を含むバッファー Gで構成される溶出バッファーを使用します。260 μL フラグ溶出バッファー(各溶出2h)で核素ソーム3倍を溶出します。</li>
	<li>フェノールクロロホルム抽出のためのアリコートを取り、2%アガロースゲルにDNAをロードすることにより、3つの溶出液をテストします。各溶出率の10 μLを取り、SDS-PAGEおよびCoomassieブルー分析のためのLaemmliサンプルバッファ2xの10 μLを加え、ユビキチン化されたH2Aのウェスタンブロット検出のために各溶出をロードします。溶出物を-80°Cで保存します。一般に、ヒト細胞からの精製は細菌に比べてタンパク質の量が少なく、濃度は0.1~0.5 μg/μLです。</li>
</ol>4. BMI1/RING1B E3ユビキチン・リガセ・コンプレックスを用いてヌクレオソームユビキチン化アッセイ
<ol><li>10K細孔0.5mL遠心フィルターを通して核原子を遠心分離し、溶出バッファーから反応バッファーH(25 mMトリス、pH 7.5;10mM MgCl 2、および5mM ATPATP)に基板を変更します。あるいは、市販のヌクレオソームをアッセイに用いることができる。 注:基質懸濁液を反応バッファーに変更することで、再現性を確保し、フラグ溶出混合物中に存在する化合物による潜在的なE3リゲス阻害を防止します。</li>
	<li>ヌクレオソームの1 μgを40μLのバッファーHの総体積でインキュベートする。Ub活性化酵素(UBE1)(250 ng)、Ub(50 ng/μL)およびE2 Ub結合酵素(672 ng)、およびBMI1/RING1B E3ユビキチンリゲス複合体の1 μgを添加する。時折揺れで37°Cで3時間の反応をインキュベートします。 注:省略、E1、E2、E3、ATP、ユビキチンを含むいくつかのコントロールを並行して行うことができます。これにより、ユビキテーション反応に対する特異性が保証される。</li>
	<li>2x Laemmliサンプルバッファーの40 μLを追加して反応を停止し、標準的な手順に従って、SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングによるヒストンH2A K119ユビキチン化を分析する。抗H2Aまたは抗H2A K119ub抗体を使用してください(材料の表を参照)。</li>
</ol>5. BAP1/DEUBADを用いてインビトロヌクレオソームH2A DUBアッセイ
<ol><li>インビトロデュビキチン化アッセイには精製ヌクレオソームを使用します。40 μLバッファー I (50 mM トリス-HCl、pH 7.3、1 mM MgCl 2、50 mMNaCl、および 1 mM DTT) で 100~500 ng のヌクレオソームを再中断します。BAP1細菌精製His-BAP1およびMBP-DEUBADの1 μgを追加します。時折揺さぶりを加えて37°Cで3時間の除ビスキチン化反応を行う。</li>
	<li>2x Laemmliバッファーの40 μLを加えてインビトロ反応を停止し、免疫ブロッティングで分析します。</li>
</ol>

<ol><li>Ye, Y., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+ubiquitin+chains%3A+E2+enzymes+at+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).</li>
<li>Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+chains%3A+structure+and+function+of+the+deubiquitinases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 550-563 (2009).</li>
<li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unravelling+of+the+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The unravelling of the ubiquitin system.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 322-324 (2015).</li>
<li>Nakayama, K. I., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+ligases%3A+cell-cycle+control+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 6, 369-381 (2006).</li>
<li>Senft, D., Qi, J., Ronai, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+ligases+in+oncogenic+transformation+and+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin ligases in oncogenic transformation and cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 69-88 (2018).</li>
<li>Zheng, N., Shabek, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+Ligases%3A+Structure%2C+Function%2C+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin Ligases: Structure, Function, and Regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).</li>
<li>Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+ubiquitin+chains.+NF-kappaB+signalling%2C+cell+death+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Linear ubiquitin chains. NF-kappaB signalling, cell death and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 503-508 (2014).</li>
<li>Kulathu, Y., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+ubiquitylation+-+the+unexplored+world+of+polyubiquitin+beyond+Lys48+and+Lys63+linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Atypical ubiquitylation - the unexplored world of polyubiquitin beyond Lys48 and Lys63 linkages.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 508-523 (2012).</li>
<li>Yau, R., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increasing+complexity+of+the+ubiquitin+code%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The increasing complexity of the ubiquitin code.</a> Nature Cell Biology. 18, 579-586 (2016).</li>
<li>Mevissen, T. E. T., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Deubiquitinase+Specificity+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Deubiquitinase Specificity and Regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 159-192 (2017).</li>
<li>Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-like+protein+conjugation+and+the+ubiquitin-proteasome+system+as+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).</li>
<li>Minton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammasomes%3A+Ubiquitin+lines+up+for+inflammasome+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inflammasomes: Ubiquitin lines up for inflammasome activity.</a> Nature Reviews Immunology. 14, 580-581 (2014).</li>
<li>Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+in+disease+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment.</a> Nature Medicine. 20, 1242-1253 (2014).</li>
<li>Upadhyay, A., Amanullah, A., Chhangani, D., Mishra, R., Mishra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+multifaceted+E3+ubiquitin+ligases+barricade+extreme+defense%3A+Potential+therapeutic+targets+for+neurodegeneration+and+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Selective multifaceted E3 ubiquitin ligases barricade extreme defense: Potential therapeutic targets for neurodegeneration and ageing.</a> Ageing Research Reviews. 24, 138-159 (2015).</li>
<li>Hammond-Martel, I., Yu, H., Affar el, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+ubiquitin+signaling+in+transcription+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">Roles of ubiquitin signaling in transcription regulation.</a> Cellular Signalling. 24, 410-421 (2012).</li>
<li>Schwertman, P., Bekker-Jensen, S., Mailand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+DNA+double-strand+break+repair+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+modifiers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of DNA double-strand break repair by ubiquitin and ubiquitin-like modifiers.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 379-394 (2016).</li>
<li>Uckelmann, M., Sixma, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+ubiquitination+in+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Histone ubiquitination in the DNA damage response.</a> DNA Repair. 56, 92-101 (2017).</li>
<li>Robzyk, K., Recht, J., Osley, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad6-dependent+ubiquitination+of+histone+H2B+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rad6-dependent ubiquitination of histone H2B in yeast.</a> Science. 287, 501-504 (2000).</li>
<li>Hwang, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+RING+finger+protein+required+for+histone+H2B+monoubiquitination+and+cell+size+control%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A conserved RING finger protein required for histone H2B monoubiquitination and cell size control.</a> Molecular Cell. 11, 261-266 (2003).</li>
<li>Kim, J., Hake, S. B., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+homolog+of+yeast+BRE1+functions+as+a+transcriptional+coactivator+through+direct+activator+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The human homolog of yeast BRE1 functions as a transcriptional coactivator through direct activator interactions.</a> Molecular Cell. 20, 759-770 (2005).</li>
<li>Wood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((an+E3+ubiquitin+ligase+required+for+recruitment+and+substrate+selection+of+Rad6+at+a+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">an E3 ubiquitin ligase required for recruitment and substrate selection of Rad6 at a promoter.</a> Molecular Cell. 11, 267-274 (2003).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+histone+H2A+ubiquitination+in+Polycomb+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing.</a> Nature. 431, 873-878 (2004).</li>
<li>Buchwald, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+E3-ligase+activity+of+the+Ring-Ring+complex+of+polycomb+proteins+Bmi1+and+Ring1B%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Structure and E3-ligase activity of the Ring-Ring complex of polycomb proteins Bmi1 and Ring1B.</a> The EMBO Journal. 25, 2465-2474 (2006).</li>
<li>Scheuermann, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H2A+deubiquitinase+activity+of+the+Polycomb+repressive+complex+PR-DUB%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB.</a> Nature. 465, 243-247 (2010).</li>
<li>Jensen, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAP1%3A+a+novel+ubiquitin+hydrolase+which+binds+to+the+BRCA1+RING+finger+and+enhances+BRCA1-mediated+cell+growth+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">BAP1: a novel ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCA1-mediated cell growth suppression.</a> Oncogene. 16, 1097-1112 (1998).</li>
<li>Harbour, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+mutation+of+BAP1+in+metastasizing+uveal+melanomas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Frequent mutation of BAP1 in metastasizing uveal melanomas.</a> Science. 330, 1410-1413 (2010).</li>
<li>Abdel-Rahman, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GermLine+BAP1+mutation+predisposes+to+uveal+melanoma%2C+lung+adenocarcinoma%2C+meningioma%2C+and+other+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">GermLine BAP1 mutation predisposes to uveal melanoma, lung adenocarcinoma, meningioma, and other cancers.</a> Journal of Medical Genetics. , (2011).</li>
<li>Bott, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+deubiquitinase+BAP1+is+commonly+inactivated+by+somatic+mutations+and+3p21.1+losses+in+malignant+pleural+mesothelioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The nuclear deubiquitinase BAP1 is commonly inactivated by somatic mutations and 3p21.1 losses in malignant pleural mesothelioma.</a> Nature Genetics. 43, 668-672 (2011).</li>
<li>Goldstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GermLine+BAP1+mutations+and+tumor+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">GermLine BAP1 mutations and tumor susceptibility.</a> Nature Genetics. 43, 925-926 (2011).</li>
<li>Testa, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GermLine+BAP1+mutations+predispose+to+malignant+mesothelioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">GermLine BAP1 mutations predispose to malignant mesothelioma.</a> Nature Genetics. 43, 1022-1025 (2011).</li>
<li>Wiesner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GermLine+mutations+in+BAP1+predispose+to+melanocytic+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">GermLine mutations in BAP1 predispose to melanocytic tumors.</a> Nature Genetics. 43, 1018-1021 (2011).</li>
<li>Dey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+tumor+suppressor+BAP1+causes+myeloid+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation.</a> Science. 337, 1541-1546 (2012).</li>
<li>Pena-Llopis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAP1+loss+defines+a+new+class+of+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">BAP1 loss defines a new class of renal cell carcinoma.</a> Nature Genetics. 44, 751-759 (2012).</li>
<li>Bononi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAP1+regulates+IP3R3-mediated+Ca2%2B+flux+to+mitochondria+suppressing+cell+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BAP1 regulates IP3R3-mediated Ca2+ flux to mitochondria suppressing cell transformation.</a> Nature. 546, 549-553 (2017).</li>
<li>Daou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoubiquitination+of+ASXLs+controls+the+deubiquitinase+activity+of+the+tumor+suppressor+BAP1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Monoubiquitination of ASXLs controls the deubiquitinase activity of the tumor suppressor BAP1.</a> Nature Communications. 9, 4385(2018).</li>
<li>Daou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BAP1%2FASXL2+Histone+H2A+Deubiquitinase+Complex+Regulates+Cell+Proliferation+and+Is+Disrupted+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The BAP1/ASXL2 Histone H2A Deubiquitinase Complex Regulates Cell Proliferation and Is Disrupted in Cancer.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290, 28643-28663 (2015).</li>
<li>Mashtalir, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autodeubiquitination+protects+the+tumor+suppressor+BAP1+from+cytoplasmic+sequestration+mediated+by+the+atypical+ubiquitin+ligase+UBE2O%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Autodeubiquitination protects the tumor suppressor BAP1 from cytoplasmic sequestration mediated by the atypical ubiquitin ligase UBE2O.</a> Molecular Cell. 54, 392-406 (2014).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+carboxyl+hydrolase+BAP1+forms+a+ternary+complex+with+YY1+and+HCF-1+and+is+a+critical+regulator+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin carboxyl hydrolase BAP1 forms a ternary complex with YY1 and HCF-1 and is a critical regulator of gene expression.</a> Molecular and Cellular Biology. 30, 5071-5085 (2010).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+and+deubiquitinase+BAP1+promotes+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor and deubiquitinase BAP1 promotes DNA double-strand break repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 285-290 (2014).</li>
<li>Dai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAP1+inhibits+the+ER+stress+gene+regulatory+network+and+modulates+metabolic+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">BAP1 inhibits the ER stress gene regulatory network and modulates metabolic stress response.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 3192-3197 (2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAP1+links+metabolic+regulation+of+ferroptosis+to+tumour+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression.</a> Nature Cell Biology. 20, 1181-1192 (2018).</li>
<li>Kolluri, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+functional+BAP1+augments+sensitivity+to+TRAIL+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells.</a> eLife. 7, (2018).</li>
<li>Machida, Y. J., Machida, Y., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Dutta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+deubiquitinating+enzyme+BAP1+regulates+cell+growth+via+interaction+with+HCF-1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The deubiquitinating enzyme BAP1 regulates cell growth via interaction with HCF-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. , (2009).</li>
<li>Sahtoe, D. D., van Dijk, W. J., Ekkebus, R., Ovaa, H., Sixma, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BAP1%2FASXL1+recruitment+and+activation+for+H2A+deubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">BAP1/ASXL1 recruitment and activation for H2A deubiquitination.</a> Nature Communications. 7, 10292(2016).</li>
</ol>

著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。

目的のタンパク質に対して、インビトロユビキチン化およびデュビキチン化アッセイを確立することにはいくつかの利点があります。これらのアッセイは、(i)最適な条件を確立し、これらの反応に対する最小限の要件を定義し、(ii)酵素運動および生化学的定数を決定し、(iii)これらの反応に影響を与える可能性のある補因子または阻害剤の役割を定義する、(iv)相互作用インタフェースを同定し、(v)人工的または疾患関連変異の影響をテストし、(vi)高スループットの化学スクリーニングアッセイを開発するためにさらに使用できるアッセイ条件を確立する。ここでは、これらのアッセイを例示し、BMI1/RING1B媒介型H2Aユビキチン化およびBAP1/ASXL媒介H2Aデュビキチン化をヌクレオソーム基板上で行う方法を説明する。
ヒストンH2Aのユビキチン化は、BMI1-RING1B複合体を用いてH2Aのほぼ完全なユビキチン化が観察されることができるように、最小限の成分を用いてインビトロで要約することができる。なお、この反応は組換えヌクレオソームに対して行われる。これらは、哺乳動物細胞で起こる翻訳後修飾後の他のヒス...

ユビキチン化は、翻訳後の最も保存された修飾の1つであり、酵母、植物、脊椎動物を含む多種多様な生物にとって重要です。ユビキチンは、高度に保存された76アミノ酸ポリペプチドであるユビキチンの共生結合から成り、タンパク質を標的とし、3つの酵素、すなわち、E1活性化、E2-共役およびE3リゲス1を含む3つの順次ステップで起こる。 2,3.この翻訳後の改変は、生物学的プロセスの広いスペクトルで中心的な役割を果たしています。実際、反応の特異性を提供するE3リチウムは、酵素の大きなスーパーファミリーを構成し、ユビキチン系4、5、6の最も豊富な酵素である。タンパク質ユビキチン化の下流効果は、単一ユビキチン化、多単一ビキチン化、線形または分岐ポリユビキチン化の性質に依存する。モノウビキチン化はプロテアソーム分解と関連することはほとんどないが、代わりにこの修飾は様々なシグナルイベントの媒次に関与する。ポリウビキチン化は、ユビキチン分子自体のN末端またはリジン残基を含み、ポリユビキチン化タンパク質の運命は、ユビキチン鎖拡張に関与する残基に依存する。ユビキチンのリジン48によって媒介されるポリウビキチン化がプロテアソーム分解を誘導することを長い間知られている。反対に、ユビキチンのリジン63を介したポリウビキチン化は、しばしばタンパク質活性化7、8、9と関連している。他の重要な翻訳後修飾と同様に、ユビキチンは可逆的であり、タンパク質からのユビキチン除去は、細胞プロセスの重要な調節剤として出現したドゥビキチナーゼ(DUB)と呼ばれる特定のプロテアーゼによって保証される。2,10.重要なことに、多くのDUBは高度に専門化されており、また、デュビキチン化を通じて、特定の基質を調節し、タンパク質機能に対するユビキチン化とデュビキチン化の微妙なバランスが重要であることを示す。E3とDUBは、プロテアソーム分解機構およびアクセサリ因子と共に、主要なシグナル伝達経路を調節するユビキチンプロテアソームシステム(UPS、>1200遺伝子)を形成し、そのうちのいくつかは細胞増殖および増殖に関連する。細胞の運命の決定、分化、細胞移動、および細胞死。重要なことに、ユビキチン化を伴ういくつかのシグナル伝達カスケードの規制緩和は、腫瘍形成および神経変性疾患5、11、12、13を促進する。14.
ユビキチン化は、クロマチン生物学およびDNA依存プロセス15、16、17において広範な役割を果たす。例えば、リジン119上のヒストンH2Aの単一化化(以下、H2A K119ub)は、転写抑圧およびDNA修復18、19、20に関与する重要な翻訳後修飾である。 21、22。H2A K119ubは、エピジェネティック情報の維持に重要な役割を果たし、ショウジョウバエからヒトへの高度に保存されているポリコム抑圧複合体1(PRC1)によって触媒される。正規PRC1は、特に、上記のユビキチン化イベント22、23を担うコアE3ユビキチンリゲス複合体であるリング1BおよびBMI1によって構成される。ショウジョウバエでは、H2Aモノビキチン化(哺乳類のH2A K119ubに相当するH2A K118ub)は、ポリコム抑圧DUB(PR-DUB)複合体24を形成する追加のセックスコーム(ASX)と相互作用するDUBカリプソによって逆転される。カリプソの哺乳類のオルソログ、BAP1は、様々なヒト悪性腫瘍25、26、27、28、および様々なヒト悪性腫瘍において削除または不活性化された腫瘍抑制剤である。 29歳,30歳,31歳,32歳,33.BAP1は、小プラズム網膜33、34、35、36、核およびカルシウムシグナル伝達媒介アポトーシスにおけるDNA依存的プロセスを調節する。37歳,38歳,39歳,40歳,41歳,42.BAP1は、特にASXL1、ASXL2およびASXL3(ASXLs)、ASX38、43の3つのオルソログを含むマルチサブユニットタンパク質複合体を組み立てる。AsxLsは、DEUビクチネーゼアダプター(DEUBAD)ドメインを使用し、ASXMドメインとも呼び、BAP1 DUB活性35、36、44を刺激する。したがって、APLはクロマチンにおけるBAP1 DUB活性を調整する上で重要な役割を果たし、より広範に腫瘍抑制機能を果たす。
ユビキチン化およびデュビキチン化プロセスを研究するいくつかの方法が存在します。.特に、細菌から精製されたタンパク質を用いて生化学的アッセイは、特定の基質からのユビキチンの直接ユビキチン化または除去を実証する上で非常に強力なままである。これらの実験は、最小限の複合体の要件の決定、反応運動学の決定、構造/機能関係の定義、病理学的影響の理解などのパラメータの範囲を調査するために行うことができます。遺伝子の突然変異。ここでは、精製成分を用いてクロマチン基質に対してユビキチン化およびデュービキチン化反応を行うプロトコルを提供する。モデルシステムとして、ヌクレオソームH2Aタンパク質のインビトロユビキチン化およびデュビキチン化が提示される。RING1B/BMI1およびBAP1/DEUBADの最小限の複合体で組み立てられた細菌精製タンパク質は、それぞれヌクレオソームH2Aのユビキチン化またはデュビキチン化に使用されます。

<table><tbody><tr><td>アミロースアガロースビーズ</td><td>New England Biolabs</td> <td>#E8021</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 mL 遠心フィルター 10K</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>#UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>Anti-H2AK119ub (H2Aub)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#8240</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Flag-agarose beads</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>#A4596</td><td></td></tr><tr><td>Anti-protease cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>#P8340</tr><tr><td>BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria</td><td>Agilent technologies</td><td>#230240</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Wisent</td><td>#319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>Empty chromatography column</td><td>Biorad</td><td>#731-1550</td><td></td></tr><tr><td>Flag peptide</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>#F3290</td><td></td></tr><tr><td>GSH-agarose beads</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>#G4510</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T</td><td>ATCC</td> <td>#CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>#I5513</td><td></td></tr><tr><td>Micrococcal nuclease (MNase)</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>#N3755</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA アガロース ビーズ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#88221</td><td></td></tr><tr><td>N-メチルmaleimide (NEM)</td><td>Bioshop</td> <td>#ETM222</td><td></td></tr><tr><td>Pore syringe filter 0.45 &mu;m</td><td>Sarstedt</td><td>#83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine (PEI)</td><td>Polysciences Inc</td><td>#23966-1</td><td></td></tr><tr><td>pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109)</td><td>Addgene</td><td>#63139</td><td></td></tr><tr><td>UB活性化酵素(UBE1)</td><td>Boston Biochem</td> <td>#E-305</td><td></td></tr><tr><td>UBCH5C (UBE2D3)</td><td>Boston Biochem</td> <td>#E2-627</td><td></td></tr></tbody></table>

ヌクレオソームヒストンのインビトロユビキチン化とデュービキチン化アッセイ

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

ユビキチン化は、様々なシグナル伝達経路において重要な役割を果たし、クロマチン機能とDNA関連プロセスの調整に特に関与する翻訳後修飾である。この修飾は、E1ユビキチン活性化、E2ユビキチン結合およびE3ユビキチン-リガゼを含むいくつかの酵素の逐次作用を伴い、デュビキチナーゼ(DUB)によって逆転される。ユビキチン化は、酵素活性の変調、タンパク質とタンパク質の相互作用および細胞下局在化を含むタンパク質機能の分解またはタンパク質機能の変化を誘発する。タンパク質ユビキチン化またはデュビキチン化を実証する上で重要なステップは、精製された成分を用いてインビトロ反応を行うことです。有効なユビキチン化およびデュビキチン化反応は、使用される異なる成分、酵素共因子、緩衝条件、および基板の性質によって大きく影響を受ける可能性があります。 ここでは、ユビキチン化およびデュビキチン化反応を行うためのステップバイステップのプロトコルを提供する。これらの反応は、マウスポリコム抑圧複合体1(PRC1)、BMI1、およびRING1B、リジン119上のヒストンH2Aを単一ユビキチン化するE3ユビキチンリゲスを用いて示す。ヌクレオソームH2Aのデュビキチン化は、ヒトデュビキチネーゼBAP1およびDEUBiquitinaseeAAptor(DEUBAD)ドメインの共因子ASXL2によって形成された最小限のポリコム抑圧デュビキチネーゼ(PR-DUB)複合体を用いて行われる。これらのユビキチン化/デュビキチン化アッセイは、細菌精製タンパク質または哺乳動物細胞から精製された天然核ソームで再構成された組換えヌクレオソームのいずれかの文脈で行うことができる。我々は、これらの反応に重大な影響を及ぼす可能性のある複雑さを強調し、これらのプロトコルの一般的な原理が他のE3ユビキチンリガスおよびデュビキチナーゼに迅速に適応できることを提案する。

GST-BMI1およびRING1Bタンパク質は細菌でよく産生され、可溶性画分で容易に抽出することができる。図1Aは、GST-BMI1-RING1B複合体の典型的な精製のためのクマシーブルー染色を示す。GST-BMI1およびRING1Bバンドは、それぞれ予想分子量、~45 kDaおよび~13 kDaで移動します。特にE3リゲス複合体は、細菌タンパク質汚染物質および/または分解産物の非常に低いレベルで非常に均質です。また、精製複合体の調存測定は最適であり、モル比1:1と同様に、GST-RING1Bタンパク質のバンド強度はBMI1の2~3倍強くなると予想される。同様に、His-BAP1/MBP-DEUBAD複合体の精製は、それぞれ約90kDaおよび〜55 kDaのバンドを用いた比較的均質な調製物をもたらした(図1B)。BAP1およびDEUBADのタンデム親和性精製は、ニッケルアガロースおよびアミロース・アガロースを通じて、それぞれ精製複合体からの自由なBAP1...

ユビキチン化は、細胞プロセスで重要な役割を果たし、デュビキチン化によって緊密に調整される翻訳後修飾です。両方の反応の欠陥は、人間の病理の下にある。精製成分を用いてインビトロでユビキチン化・デュビキチン化反応を行うためのプロトコルを提供します。

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

ユビキチン化および細胞内のデュビキチン化反応の複雑さを考えると、定義された精製成分を用いたインビトロアッセイを確立することが重要である。これは、ユビキチン化およびデュビキチン化のメカニズムを理解し、また、この反応を担う酵素をコードする遺伝子に関連する突然変異がヒト疾患を引き起こす方法を決定するのに役立ちます。これらの反応を促進するこれらの成分のドメインとモチーフを特定することができます。また、潜在的な治療薬として開発できる低分子阻害剤のスクリーニングに使用できる高スループットスクリーンアッセイを開発することもできます。細菌のリシスを開始するには、氷冷リシスバッファーAにPMSFと抗プロテアーゼカクテルを追加します。超音波処理のためにチューブ内の細菌を含むライセートを転送します。プローブ超音波処理器を使用して、30秒、4〜5回、70%出力振幅でlysateを超音波処理します。その後、摂氏4度で20分間21,000倍gで遠心分離機。原稿に従って5時間GSHビーズで菌溶解物をインキュベートした後、10ミリルターのバッファーとともにビーズを空のクロマトグラフィーカラムに移します。次に、25ミリモルグルタチオンを含む緩衝液Aの1.5ミリルターをカラムに加え、重力による溶出を1.5ミリリットルマイクロチューブに集める。新鮮な緩衝液Aを用いて、その溶出手順を原稿に従って溶出した分画の継続処理を4回繰り返す。まず、氷冷ライシスバッファーB.Mix 25ミリルターの氷冷ライシスバッファーB.Mix 25ミリルターでHis-BAP1とMBP-DEUBAD細菌ペレットを再中断し、氷の上で15分間インキュベートします。ソニッケートし、20分間21,000回gでリセートを遠心分離します。遠心分離を取り付けた後、0.45マイクロメートルの細孔注射器フィルターを通してリセートをボトルにフィルターし、ニッケルNTAビーズと混ぜます。5時間揺れで摂氏4度でインキュベートします。その後、ビーズを25,000回gで3分間回転させます。ピペットを使用して、流れとして50ミリリットルのチューブに上清を保存します。20ミリモルイミダゾールを含むバッファーBの5ミリルターでビーズを洗浄し、3分間の遠心分離機で6回。最後の洗浄後、10ミリルターのバッファーBを含むビーズを空のクロマトグラフィーカラムに移し、200ミリモルイミダゾールを含む緩衝液Bの1ミリリットルを加える。DTTおよびEDTAを含む1.5ミリリットルマイクロチューブに重力による溶出を収集する。溶出手順を4回繰り返し、所望の溶出した分画を15ミリリットルのチューブにプールします。緩衝液Cを加え、溶出した複合体を3回希釈する。その後、希釈した溶出液をチューブ内の準備されたアミロースビーズに移し、振盪で摂氏4度で一晩インキュベートします。午前中、チューブを2、500回gで3分間遠心し、流れとして15ミリリットルチューブに上清を保ちます。5ミリルターのバッファーCでタンパク質結合ビーズを5〜6回洗浄します。次に、精製されたHis-BAP1/MBP-DEUBAD複合体に500マイクロリットルのバッファーDをアミロースアガロースビーズに加え、50%ビーズ溶液を作ります。50%ビーズ溶液の20マイクロリットルをマイクロ遠心チューブに移し、SDS-PAGEおよびクマシーブルー分析のために2倍のレムリサンプルバッファーの20マイクロリットルを加えます。将来の使用のためにマイナス80°Cで残りのビーズ溶液を保管してください。HEK293T細胞を培養した後、トランスフェクションの1日前の15センチメートル培養皿で完全培地20ミリルターに1200万個の細胞をプレートする。1日後、細胞培養フードの下で、吸気培地を12ミリルターの無血清培地で供給する。1ミリリットル当たり1ミリグラムで63マイクロリットルのPEIを使用して、21マイクログラムのpCDNAフラットH2Aで細胞をトランスフェクトする。12時間後、培地を完了するように変更します。原稿に従って細胞を収穫した後、NEMを含む約10体積の緩衝E中の細胞ペレットを再懸濁して、デュビキチナーゼを阻害し、氷上で20分間インキュベートする。3,000回gで5分間遠心分離した後、上清を捨てる。クロマチンペレットを10容量のバッファーEで2回洗浄し、次にバッファーFで2回洗浄し、クロマチンをバッファーFの5ミリルターで再懸濁し、マイクロコッカスヌクレアーゼでペレットを1ミリリットル当たり3単位の濃度で室温で10分間処理します。インキュベーション後、ヌクレオソームDNA断片を分析するために、混合物の40マイクロリットルのアリコートを1.5ミリリットルチューブに移す。40マイクロリットルのフェノールクロロホルムと20マイクロリットルの6倍のDNAローディングバッファーを加えます。渦と2分間18,000回gで回転する。次に、2%アガロースゲルで水相の15マイクロリットルを転写し、DNAをロードする。原稿による反応と遠心分離を停止した後、可溶クロマチン分率を15ミリリットルチューブに一晩振盪して摂氏4度でインキュベートする。バッファーGでビーズを6回洗い、5ミリルターのバッファーGを持つビーズを空のクロマトグラフィーカラムに移します。ビーズ結合型ヌクレオソームを、フラグ溶出ペプチドの1ミリリットル当たり200マイクログラム、pH 8で1~5モルトリスを含む260マイクロリットルの緩衝Gで希釈します。冷たい部屋で3回、1時間のヌクレオソームをエルクする。ユビキチン化アッセイを行うために、まず精製されたヌクレオソームのマイクログラムを40マイクロリットルのバッファーHに追加し、その後、UBE1の250ナノグラム、UBおよびE2 UB結合酵素の672ナノグラムおよびBMI1-RING1B E3ユビキチンリガー複合体の1マイクログラムを含む酵素溶液ミックスを加える。時折揺れで摂氏37度で3時間反応をインキュベートします。2回のLaemmliサンプルバッファーの40マイクロリットルを加えることによって反応を停止し、ウェスタンブロッティングによるヒストンH2AK119ユビキチン化を分析します。インビトロ・デュビキチン化アッセイを行うために、精製されたヌクレオソームを40マイクロリットルのバッファーIおよび1マイクログラムの細菌で再懸濁し、His-BAP1/MBP-DEUBADビーズを精製した。チューブを摂氏37度のインキュベーターに3時間置き、時折揺れでデュービキチン化反応を行います。次に、2回のレムリバッファーの40マイクロリットルを加えて反応を停止し、免疫ブロッティングにより分析します。この実験では、GST-BM1-RING1B複合体の典型的な精製のためのクマシーブルー染色は、GSTアフィニティービーズを使用して、バンドがそれぞれ約45キロダルトンと13キロダルトンの周りに予想モル重量で移動することを示しています。同様に、His-BAP1 MBP-DEUBAD複合体の精製は、それぞれ約90キロダルトンと55キロダルトンのバンドを有する比較的高い均質製剤をもたらした。一方、精製されたヌクレオソーム画分は、本質的には、高濃縮単核体画分の存在を示す147塩基対バンドによって構成される。精製されたヌクレオソームのクマシーブルー染色は、量論量を有する4つのヒストンサブユニットの典型的なバンドパターンを示す。BMI1-RING1B複合体を有するヒストンH2Aのユビキチン化は、非修飾形態のレベルが付随的に減少している間にタンパク質のユビキチン化形態の時間依存性の増加を示す。ユビキチン化反応は、事実上すべてのH2Aタンパク質がH2A K119ubに変換されるため、合計です。一方、デュビキチン化アッセイは、天然核組を実施した。これらのヌクレオソームをBAP1-DEUBADでインキュベートした後、H2A K119ubシグナルの時間依存的な減少が観察された。ユビキチン化およびデュビキチン化反応の成功は、タンパク質の精製方法によって異なります。我々は良好な収量を必要とし、タンパク質の再懸濁および精製のための緩衝剤の使用は生化学的反応と互換性があるべきである。このユビキチン化およびデュービキチン化アッセイが十分に確立されている場合、我々は影響活性化剤および阻害剤ならびに疾患関連遺伝子突然変異の影響をテストすることができる。この方法は、いくつかの実験室の貢献によって確立されており、ユビキチン化およびデュビキチン化のメカニズムを理解するのに非常に有用である。いくつかの化学物質は危険であり、フード内で操作する必要があります。これには、フェノールクロロホルム、酸、塩基、還元剤が含まれる。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

ユビキチン化は、3つの酵素のセットによって行わキー翻訳後修飾である。この変更に関与する遺伝子の変異が様々なヒト疾患に関連付けられています。ここで、我々は培養細胞でのタンパク質のユビキチン化を検出するためのプロトコルを説明...

タンパク質のユビキチン化の検出

ここでは、ATP依存性クロマチンリモデリング酵素の能力を特徴づけるために使用できる生化学的アッセイについて説明し、1)ATP依存性のヌクレオソームのスライドを触媒し、2)ヌクレオソーム基質と関与し、3)ATPをヌクレオソームまたはDNA依存的に加水分解します。...

ATP依存性クロマチンリモデリング酵素の活性を分析するための生化学的アッセイ

現在のプロトコルは、機能的に相同脱ユビキチン化酵素の活性を測定する方法を詳述します。特殊なプローブは、共有結合酵素を変更し、検出を可能にします。この方法は、新たな治療標的を同定する可能性を保持しています。...

細胞株および組織試料中の脱ユビキチン化酵素の活性を測定する方法

このプロトコルは、示差的に同位体標識姉妹ヒストンを含むヌクレオソームの再構成を説明します。これと同時に、非対称的に翻訳後修飾ヌクレオソームはpremodifiedヒストンのコピーを使用した後に発生することができます。これらの製剤は、容易に高分解能NMR分光法を用いて、同時に両方の姉妹ヒストンに、修正クロストークのメカニズムを研究するために使用することができます。...

示差同位体で標識された姉妹ヒストンとヌクレオソームの再構成

この方法はユビキチン鎖トポロジーにおけるグローバルな変化の評価を記述する。この評価は、質量分析法に基づく標的プロテオミクスアプローチの適用によって行われます。...

並列反応モニタリングによるユビキチン連鎖解析

本研究は、E3ユビキチンリガーゼ触媒活性の分析のための詳細な インビトロ ユビキトリメンテーションアッセイプロトコルを提供する。組換えタンパク質は 、大腸菌...

イン・ヴィトロ E3ユビキチンリガーゼ関数の解析

このプロトコルは、ヒストンシャペロンのオリゴマー化と安定性を研究するための分析サイズ排除クロマトグラフィー、ヒストンシャペロンとヒストンの相互作用を解明するためのプルダウンアッセイ、タンパク質複合体の化学量論を分析するAUC、および推定ヒストンシャペロンをin vitroで機能的に特徴付けるためのヒストンシャペロンアッセイを含む一連の方法について説明しています。...

インビトロ 分析アッセイ、プルダウンアッセイ、シャペロニングアッセイを使用したヒストンシャペロンの特性評価

我々は、哺乳動物細胞における特定の基質およびE3ユビキチンリガーゼのユビキチル化アッセイのための詳細なプロトコルを提供する。HEK293T細胞株をタンパク質過剰発現に使用し、ポリユビキチル化基質を免疫沈降によって細胞溶解物から精製し、SDS−PAGEで分解した。イムノブロッティングを用いて、この翻訳後修飾を可視化した。...

哺乳動物細胞溶解物におけるE3ユビキチンリガーゼによる基質ユビキチル化の評価

このプロトコルでは、組換えタンパク質精製とユビキチン鎖切断アッセイを組み合わせることにより、神経発達障害に関連する遺伝的変異が脱ユビキチン化酵素活性に及ぼす影響を測定する方法を説明しています。...

In vitroユビキチン鎖切断アッセイによる神経発達障害関連脱ユビキチン化酵素の酵素活性の測定

ユビキチン化は細胞内タンパク質機能の重要な調節因子です。ここでは、哺乳類細胞における基質タンパク質のユビキチン化レベルを検出するための2つの細胞溶解法を説明し、それらのユビキチン化レベルの解析効果を比較します。HEK293T細胞内のタンパク質過剰発現は一時的なトランスフェクションによって誘導され、ウビキチン化タンパク質はウェスタンブロット解析によって検出されました。...

SMAD2/SMURF2をモデルとした哺乳類細胞溶解液におけるユビキチン検出の比較戦略

本プロトコルは、哺乳類細胞溶解液または純粋なユビキチン酵素複合体を用いて肺炎 連鎖...

体外受精 細菌のユビキチン化の再構築とVCP/p97媒介の除去

学ぶヌクレオソームヒストンのインビトロユビキチン化とデュービキチン化アッセイ。精製した成分を用いて、細胞内の翻訳後修飾メカニズムと疾患関連酵素変異の影響を解明する方法です。

ヌクレオソームヒストンのインビトロユビキチン化とデュービキチン化アッセイ

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