Name: アンジオテンシンIIによるニトロペプチドプロファイリングと同定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: 学ぶニトロペプチドの化学的濃縮と質量分析による同定法。アンジオテンシンIIをモデルに、チロシン硝化タンパク質の検出感度を向上させ、in vitroおよびin vivo系への応用が可能です。

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この研究は、米国癌学会機関研究助成金IRG-14-195-01(M.シャロンスタックは主任研究者です。X.L.は、サブ受信者調査員です。この出版物は、国立衛生研究所、国立翻訳科学、臨床および翻訳科学賞のグラント番号KL2 TR002530とUL1 TR002529(A.シェカール、PI)からの部分的な支援によって可能になりました。X. L. はインディアナ CTSI KL2 若手研究者賞を受賞しています。S.F.は、基本がん助成金を推進するワルサー癌財団によって支援されています。X.W.は、中国国立自然科学財団(助成第817773047号)の支援を受けています。

1. アンジオテンシンIIの硝化
<ol><li>硝化ペプチドを生成するには、50 μMの最終濃度で390 μL PBS溶液(10mM NaH2PO 4、150 mM NaCl、pH 7.4)でアンジオテンシンII(DRVYIHPF)親溶液(水中2mM)を希釈します。</li>
	<li>アンジオテンシンII溶液に10 μLのペルオキシニットライト(4.7%NaOHで200mM)を加え、ペルオキシニットライト5mMの最終濃度を作ります。 注:ペルオキシニットライトは、それが酸性の形態であるときに不安定で解決しやすいので、ペルオキシニットライトの親溶液は、基本的な溶液に保持され、-80 °Cに保存されます。</li>
	<li>溶液のpH値を1M HClで7-8に調整します。硝化反応を開始するには、チューブを400rpmで5分間振ります。</li>
	<li>脱塩には、市販の逆相 SPE 列 (材料の表を参照) を使用します。<ol>
<li>脱塩用の2つの溶液、洗浄用の水に5%のメタノール、溶出用の水に80%メタノールを調べます。</li>
		<li>500 μLのメタノールを加え、続いて500μLの水をカラムを予め条件付けし、1mLピペッタを柱の上部に先端に置き、ピペッタを押して流れを加速させる。</li>
		<li>カラムのステップ1.3でサンプルの410 μLをロードし、流れを破棄します。</li>
		<li>5%メタノールの500 μLで洗浄した後、80%メタノールの300 μLを使用してニトロペプチドを溶出させ、室温でのデフォルト設定で速度vacによって完全に乾燥させます。 注:前のステップで残された溶媒は次のステップに悪影響を及ぼす可能性があるため、脱塩は反応にとって非常に重要です。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ジメチル標識による一次アミンのアルキル化
<ol><li>重炭酸トリエチランモニウム(TEAB)溶液の100μLで粉末ニトロアンジオテンシンIIを再構成する。 注:溶液のpH値は7~9で、溶液中に一次アミンが添加されていないことを確認してください。</li>
	<li>溶液に4%ホルムアルデヒドの4 μLを加え、簡単に混ぜます。 注意: ホルムアルデヒド蒸気は有毒です。ヒュームフードで実験を行う。</li>
	<li>溶液に0.6 M NaBH3CNの4 μLを加え、室温で1時間400rpmでチューブを振る。</li>
	<li>1%アンモニア溶液の16μLを添加して標識反応をクエンチし、室温で5分間インキュベートする。</li>
	<li>溶液を酸性化するために8 μLのギ酸を加え、ステップ1.4で説明するように逆相SPEカラムを使用して脱塩を行います。</li>
</ol>3. アミノチロシンに対するニトロチロシンの減少
<ol><li>PBSの500 μL(10mM NaH2PO 4、150 mM NaCl、pH7.4)でジメチル標識ニトロアンジオテンシンIIを再構成する。</li>
	<li>溶液に1Mジチオネートナトリウムの10 μLを加え、室温で1時間インキュベートします。還元反応の後、溶液の黄色が明らかになる。 注:174.1 mgのジチオネートナトリウムの重量を量り、最終的な容積が1 mLであることを作るために水にそれを溶解します。この溶液は、1週間以内に-20°Cで保存することができます。</li>
	<li>ステップ 1.4 で説明するように、脱塩には逆相 SPE 列を使用します。</li>
</ol>4. バイオチンラ化、濃縮、検出
<ol><li>PBSの500 μL(10mM NaH2PO 4、150 mM NaCl、pH 7.4)でアミノアンジオテンシンIIを標識したジメチルを再構成する。</li>
	<li>40 nM NHS-S-S-ビオチンの5μLを加え、DMSOに溶解し、溶液に、室温で2時間インキュベーションした後、反応をクエンチするために5%ヒドロキシルアミンの1 μLを使用する。</li>
	<li>一方、PBSの500μL(10mM NaH2PO 4、150 mM NaCl、pH7.4)を加えて平衡化し、室温で5分間580×gで遠心分離し、上清を廃棄する。平衡化を3回行う。</li>
	<li>反応系に100μLの連鎖アジャビジンアガロースビーズを加え、室温でロータリーシェーカーで1時間インキュベートする。PBSで4回洗浄(10 mM NaH2PO 4、150 mM NaCl、pH 7.4)。各洗浄工程について、ビーズに500 μLのPBSを加え、よく混ぜ、室温で5分間580xgで遠心分離機を使用し、上清を廃棄します。 </li>
	<li>10mMジチオスレイトール(DTT)の400 μLを使用して、アガロースビーズを50°Cで45分間インキュベートし、室温で5分間580xgでスピンダウンし、ビーズを捨て、0.5Mのidoacetatamid(IAM)の20 μLを超暗闇の20mに加えます。 注:DTTは、ビオチンとペプチドのリンク間の二硫化結合を破るために使用され、後者はビーズから放出され、さらにIAMによってアルキル化される。</li>
	<li>ステップ 1.4 に示す脱塩には、逆相 SPE 列を使用します。</li>
	<li>0.1%ギ酸(FA)の20μLで乾燥ペプチドを溶解した後、各部の産物をスタンデム質量分析(LC-MS/MS)分析で液体クロマトグラフィーに加える。<ol>
<li>60分の勾配溶出によって修飾されたAng IIペプチドを分離する(0-8分、2%B;8-10分、 5% B; 10-35 分, 18% B; 35-50 分, 28% B; 50-52 分, 80% B; 52-58 分, 80% B; 58-59 分, 2% B; 59-60 分, 2% B) 流量で 0.30 μl/mPLC システム高分解能質量分析計と直接インターフェースされます。 注:分析カラムは、C-18樹脂を詰めた75μmのID、150 mmの長さです。移動相Aは0.1%ギ酸、移動相Bは100%アセトニトリルと0.1%のギ酸で構成された。</li>
		<li>データ依存性集録モードで質量分析計を操作し、単一のフルスキャン質量スペクトル(300-1800 m/z、60 000解像度)を設定し、20のデータ依存MS/MSスキャンを28%正規化された衝突エネルギーでスキャンします。</li>
		<li>質量スペクトルデータを開き、各工程で製品のピークを特定し、化学反応が正常に行われたことを確認します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. ニトロペプチドの定量
<ol><li>ステップ1.4からニトロアンジオテンシンII溶液の3セットを準備し、各セットは、ニトロアンジオテンシンIIの2濃度を含む:#1、チューブAで20 nmol、チューブBで20 nmol、それぞれ100 μl TEAB溶液中に。#2、チューブCに10nmol、チューブDに20 nmolを設定し、それぞれ100 μl TEAB溶液中に入れます。#3、チューブEに40nmol、チューブFに10nmol、それぞれ100μl TEAB溶液にセットします。 注:各セット中のニトロアンジオテンシンIIの2つの濃度は、ジメチル標識に使用され、ホルムアルデヒド(光)およびホルムアルデヒド-D2(重)とそれぞれ反応する。</li>
	<li>各セットについて、4%ホルムアルデヒドとホルムアルデヒド-D2の4 μLをサンプルに加え、それぞれ軽くて重いと標識します。ジメチルラベリングを完了するには、手順 2.3 ~ 2.5 に従います。</li>
	<li>軽く、重いラベルのサンプルを混ぜます。</li>
	<li>削減、バイオチニル化、濃縮、検出については、3.1 から 4.6 までの手順に従います。</li>
</ol>

<ol><li>Radi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide%2C+oxidants%2C+and+protein+tyrosine+nitration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide, oxidants, and protein tyrosine nitration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4003-4008 (2004).</li>
<li>Radi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+tyrosine+nitration%3A+biochemical+mechanisms+and+structural+basis+of+functional+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Protein tyrosine nitration: biochemical mechanisms and structural basis of functional effects.</a> Accounts of Chemical Research. 46, 550-559 (2013).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-induced+fragmentation+of+leucine+enkephalin%2C+nitro-Tyr-leucine+enkaphalin%2C+and+d5-Phe-nitro-Tyr-leucine+enkephalin%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">MALDI-induced fragmentation of leucine enkephalin, nitro-Tyr-leucine enkaphalin, and d5-Phe-nitro-Tyr-leucine enkephalin.</a> Int. J Mass Spectrometry. 287, 77-86 (2009).</li>
<li>Batthyány, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine-Nitrated+Proteins%3A+Proteomic+and+Bioanalytical+Aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Tyrosine-Nitrated Proteins: Proteomic and Bioanalytical Aspects.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 26, 313-328 (2017).</li>
<li>Feeney, M. B., Schöneich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+approaches+to+analyze+protein+tyrosine+nitration%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Proteomic approaches to analyze protein tyrosine nitration.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 19, 1247-1256 (2013).</li>
<li>Zhan, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitroproteins+from+a+human+pituitary+adenoma+tissue+discovered+with+a+nitrotyrosine+affinity+column+and+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 354, 279-289 (2006).</li>
<li>Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+analysis+of+nitrotyrosine-containing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins.</a> Mass Spectrometry Reviews. 34, 423-448 (2015).</li>
<li>Abello, N., Barroso, B., Kerstjens, H. A. M., Postma, D. S., Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+labeling+and+enrichment+of+nitrotyrosine-containing+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Chemical labeling and enrichment of nitrotyrosine-containing peptides.</a> Talanta. 80, 1503-1512 (2010).</li>
<li>Chiappetta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+identification+of+protein+nitration+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative identification of protein nitration sites.</a> Proteomics. 9, 1524-1537 (2009).</li>
<li>Dekker, F., Abello, N., Wisastra, R., Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+and+detection+of+tyrosine-nitrated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Enrichment and detection of tyrosine-nitrated proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. , Chapter 14, Unit 14.13 (2012).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+selective+enrichment+and+analysis+of+nitrotyrosine-containing+peptides+in+complex+proteome+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">A method for selective enrichment and analysis of nitrotyrosine-containing peptides in complex proteome samples.</a> Journal of Proteome Research. 6, 2257-2268 (2007).</li>
<li>Feng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+inhibit+T+cell+activation+through+nitrating+LCK+in+mouse+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells inhibit T cell activation through nitrating LCK in mouse cancers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 10094-10099 (2018).</li>
<li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocol. 4, 484-494 (2009).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

ここでのプロトコルは、ニトロペプチド濃縮およびプロファイリングについて説明する。モデルペプチドとしてアンジオテンシンIIを用いて、図1に示す手順を示した。ニトロアンジオテンシンIIを得た後、ペプチド上の一次アミンは、プロトコル内で最も重要なステップの1つであるさらなるアミン結合を避けるためにブロックされるべきである。現在のプロトコルでは、ジメチル標識は2つの理由で一次アミンをブロックするために使用されます:最初に、定量的な結果の獲得を可能にします。第二に、この反応のコストはNHSベースの反応よりも低く、ブロッキング効率は高い13である。定量化の場合、測定された光と重い比率は予想される比率に非常に近い(図7)、誤差は10%未満に計算される。
プロトコルのもう一つの重要なステップは、ジメチル標識ペプチド上の3-ニトロチロシンの還元を、ディチオネートナトリウムによるアミオチロシンに還元し、迅速かつ効率的に反応する。新たに生...

3-ニトロチロシンを形成するタンパク質中のチロシン残化の硝化は、多くの生物学的プロセスを調節する。チロシンと3-ニトロチロシンの間の異なる化学的特性のために、硝化されたタンパク質はシグナル伝達活性1、2を乱暴にしてもよい。そのため、タンパク質上の硝化部位を効率的に濃縮・同定できる方法を開発することが重要です。3-ニトロチロシンは、リン酸化やアセチル化などの他の形態のPTMと比較してタンパク質に対する豊富な修飾が低いため、細胞株や組織サンプルから直接内因性の硝化部位を同定することは困難です。それにもかかわらず、ニトロペプチドの断片化パターンを特徴付けるために質量分析(MS)を用いた方法論(例えば、Zhan & Desiderio 3)が開発され、これはニトロプロテオミクスの新しい方法の基礎を築く。
現在、MSに続く濃縮ステップは、ニトロペプチドプロファイリング4、5のための最も強力な戦略です。エンリッチメント メソッドは、2 つのクラスに分類できます。1つのクラスは、3-ニトロチロシンを特異的に認識できる抗体に基づいており、他のクラスは、アミン基4、5にニトロ基を減少させる化学誘導法に基づいている。抗体ベースの方法では、ニトロチロシン親和性カラムが濃縮に使用され、そこから、解離された材料がさらに高分解能MS6、7によって分解および分析される。化学誘導ベースの方法では、ペプチドまたはリジンのN終位におけるアミン基は、アセチル化、相対および絶対定量のための同位体タグ(iTRAQ)、またはタンデム質量タグ(TMT)試薬のいずれかによって最初のステップでブロックされるべきである。次に、ミトロチロシンをアミノチロシンに還元し、続いて新たに形成されたアミン群を改変するためにリデューサを使用し、ビオチンライゲーション、スルフィドリルペプチド変換、または他のタイプのタグ付けシステム8、9、および 10、11.これまでに確立されたプロトコルのほとんどは、内因性硝化タンパク質の代わりに、インビトロの過剰硝化タンパク質に基づいています。
本研究では、ニトロチロシンの化学誘導法の改変手順を、MS検出時の感度向上を示し、定量化目的に適したニトロペプチド濃縮および同定のために開発される。この手法を生物系に用いた最近の研究では、骨髄系抑制細胞(MDSC)から産生されるRNSによるTyr394におけるリンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(LCK)の硝化が重要な役割を果たしていることを明記した。腫瘍微小環境の免疫抑制12.したがって、我々のニトロペプチド同定の方法は、複雑な生物学的試料にも適用することができる。ここで、フラグメンテーションパターンが知られており、ニトロプロテオミクス研究8、9、10、11で広く使用されているモデルペプチドアンジオテンシンIIを例として我々のプロトコルを説明する。

<table><tbody><tr><td>絶賛 pepmap 100 C18 カラム</td><td>サーモフィッシャー</td><td>164534</td><td></td></tr><tr><td>1 M ティーブ溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7408</td><td></td></tr><tr><td>50% ヒドロキシルアミン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>90115</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A955</td><td>MS グレード</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>F8775</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド-D2</td><td>トロント研究</td><td>F691353</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>695076</td><td>ACS試薬</td></tr><tr><td>フュージョン・ルーモス質量分析計</td><td>サーモ</td><td></td><td></td></tr>イ<tr><td>ソアセトアミド</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A456</td><td>MS グレード</td></tr><tr><td>NHS-S-S-bition</td><td>サーモフィッシャー</td><td>21441</td><td></td></tr><tr><td>オアシス HLB カラム (10 mg)</td><td>Waters</td><td>186000383</td><td></td></tr><tr><td>ペルオキシ亜硝酸塩</td><td>メルク・ミリポア</td><td>516620</td><td></td></tr><tr><td>シアノボウハイドライトナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42077</td><td>PhamaGrade</td></tr><tr><td>ジチオン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>157953</td><td>テクニカルグレード</td></tr><tr><td>ストレプトアビジンセファロー</td>ス <td>GE Healcare</td><td>GE17-5113-01</td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 nanoLC</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

アンジオテンシンiiによるニトロペプチドプロファイリングと同定

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

タンパク質硝化は、チロシン残基に対する最も重要な翻訳後修飾(PTM)の1つであり、真核細胞における活性酸素種(ROS)および反応性窒素種(RNS)の化学作用によって誘導されうる。タンパク質上の硝化部位の正確な同定は、炎症、老化、癌などのタンパク質硝化に関連する生理学的および病理学的プロセスを理解するために重要です。硝化タンパク質は、誘導条件下でも細胞内の存在量が少ないため、タンパク質硝化部位のプロファイリングと同定のための普遍的かつ効率的な方法は開発されていません。ここでは、化学還元反応とビオチン標識を用いてニトロペプチド濃縮のためのプロトコルを説明し、続いて高分解能質量分析を行う。我々の方法では、ニトロペプチド誘導体を高精度で同定することができる。我々の方法は、以前に報告された方法と比較して2つの利点を示す。まず、ジメチル標識は、ニトロペプチド上の一次アミンをブロックするために使用され、定量的な結果を生成するために使用することができます。第二に、NHS-ビオチン試薬を含むジスルフィド結合が濃縮に使用され、質量分析計上の検出信号を増強するためにさらに低減およびアルキル化することができる。このプロトコルは、現在の論文においてモデルペプチドアンジオテンシンIIに正常に適用されている。

この原稿におけるニトロペプチドプロファイリングのフローチャートを図1に示す。図2、3、4および5は、アンジオテンシンII、ニトロ−アンジオテンシンII、ジメチル標識ニトロアンジオテンシンIIおよびジメチル標識アミノアンジオテンシンIIの質量スペクトルを示す。 化合物の分子量は、各図におけるモノアイソトープピークのm/z値によって反映することができ、アンジオテンシンII上の化学修飾が各工程で正常に達成されたことを示す。図6は、LC-MS/MS.図7によって検出および特徴付けられたステップ4.7における最終製品を示し、ジメチル標識によるニトロペプチドの定量的結果を示す。光と重の相対的な量は、各群のモノアイソトープピークの強度の比較によって決定され、異なるグループからの濃縮ニトロペプチドを定量化すること...

チロシン硝化タンパク質のプロテオミックプロファイリングは、3-ニトロチロシン修飾の低い存在性のために挑戦的な技術であった。ここでは、アンジオテンシンIIをモデルにしたニトロペプチド濃縮とプロファイリングに対する新しいアプローチについて述べた。この方法は、他のインビトロまたはインビボシステムに拡張することができます。

アンジオテンシンIIによるニトロペプチドプロファイリングと同定

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

化学アプローチと質量分析によってニトロペプチドを濃縮し同定する方法についての重要な質問に答えることができるこのメッセージ。この技術は、質量分析法によってニトロペプチドを検出するための高められた感受性を有し、それはインビトロ生化学系および内因性生物学的組織の両方に適用することができる。ニトロアンジオテンシンII脱塩の場合、1ミリリットルのピレットを使用して、メタノール500マイクロリットルと500マイクロリットルの水をカラムの上部に添加して、逆相固相抽出またはSPEカラムを予調します。すべての水がカラムを通り抜けたら、410マイクロリットルのニトロアンジオテンシンII溶液をカラムに積み込みます。5%メタノールと水の500マイクロリットルと80%メタノールと水の300マイクロリットルでカラムを洗浄し、ニトロペプチドを溶出させます。その後、室温でデフォルト設定で真空速度で溶出物を乾燥させます。一次アミンアルキル化の場合、粉末ニトロアンジオテンシンIIを100ミリモルトリエチランモニウム重炭酸塩溶液100マイクロリットルで再構成し、4%ホルムアルデヒドの400マイクロリットルをヒュームフードに加えて、短い混合を行う。次に、0.6モルのシアノ水素化ナトリウムを4マイクロリットル加え、室温で1時間毎分400回転で振る。インキュベーションの終了時に、16マイクロリットルの1%アンモニア溶液を室温で5分間焼き付け、続いて8マイクロリットルのギ酸で酸性化します。次に、ちょうど示したように、新しい逆相SPE列で溶液を脱塩します。ニトロチロシンからアミノチロシンへの還元のために、ジメチル標識ニトロアンジオテンシンIIをPBSの500マイクロリットルで再構成し、10マイクロリットルのモルルナトリウムジチオン酸を室温で1時間インキュベートする。還元反応後、黄色の溶液が明らかになります。デモに示すように、新しい逆相SPEカラムで還元サンプルを脱塩します。ビオチン化および濃縮のために、ジメチル標識アミノアンジオテンシンIIを500マイクロリットルのPBSで再構成し、続いて40ナノモルNHS-Sビオチンをジメチルスルホキシドに溶解した5マイクロリットルを室温で2時間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、5%ヒドロキシラミンの1マイクロリットルで反応をクエンチし、3つの別々の遠心分離によって平衡化するためにストレプトアビジンアガロースビーズの100マイクロリットルに新鮮なPBSの500マイクロリットルを追加します。最後の遠心分離の後、室温でロータリーシェーカーに1時間インキュベーションを行い、反応系に100マイクロリットルのビーズを加えます。インキュベーションの最後に、1回の洗浄ごとに500マイクロリットルの新鮮なPBSでシステムを4回洗浄し、続いて摂氏50度で45分間のインキュベーションに10ミリモルジチオトレイトールを400マイクロリットル添加します。インキュベーションの終わりに、カラムをスピンダウンし、20マイクロリットルの0.5モルヨウアセトアセトアミドを含む新しいチューブに上清を移し、暗闇の中で20分間インキュベーションします。次に、新しい逆相SPEカラムで溶液を脱塩し、乾燥ペプチドを0.1%のギク酸の20マイクロリットルで分解します。検出のために、タンデム質量分析計を用いて液体クロマトグラファーに製品をロードします。高分解能質量分析計と直接インターフェースするナノ高圧液体クロマトグラフィーシステムにより、変性アンジオテンシンIIペプチドを毎分0.3マイクロリットルの流量で60分の勾配輝度で分離します。データ依存型取得モードでは、質量分析計に単一のフルスキャン質量スペクトルを設定し、続いて28%正規化された衝突エネルギーで20のデータ依存タンデム質量分析計スキャンを行います。次に質量スペクトルデータを開き、各工程で生成物のピークを特定し、化学反応が正常に行われたことを確認します。ここで、アンジオテンシンIIの代表的な質量スペクトルは、実証された各化学修飾の前後に観察できる。化合物の分子量はモノ同位体ピークの質量電荷比値で示され、アンジオテンシンIIに対する化学修飾がそのステップに対して正常に達成されたことを示す。ここで、タンデム質量分析を用いた液体クロマトグラフィーによって検出され特徴付けられる最終生成物が示されている。ジメチル標識によるニトロペプチドの定量的分析は、各群におけるモノ同位体ピークの強度の比較を通じて、軽くて重い量の相対的量を計算することを可能にし、異なる群からの濃縮されたニトロペプチドの定量を可能にする。手順に従って、潜在的なニトロペプチドを識別するために、pFINDのSEQUESTの最大カウントなどのプログラム検索エンジンを使用することができます。開発後、この技術は、特定のニトレーション部位の生物学的機能の開始への道を開いた。

nitropeptide-profiling-identification-illustrated-angiotensin

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

L-DOPAを用いたドーパミン補充薬物療法は、パーキンソン病の最も一般的に使用される対症療法ですが、不随意の異常な動き、と呼ばれる運動障害などの副作用が付属しています...

パーキンソン病における神経ペプチドのMALDIイメージングマススペクトロメトリー

一酸化窒素（NO）の内因性産生は、生物多様な機能を調節する。それは、NOベースのシグナリングの中断または調節不全は、多くのヒト疾患に関与していることがますます明らかになりつつあります。関連するNOの代謝産物を定量化しないための方法は、ヒトの疾患の新しい診断または予後バイオマーカーを提供することがあります。...

一酸化窒素の生物活性をアッセイするための分析手法

機能的モチーフとその結合パートナーのペプチドベース識別

ここでは、アンジオテンシンIIのヨウ素-125標識類似体を用いた定量的、密度測定、in vitro受容体オートラジオグラフィーにより、ラット脳内のアンジオテンシンII型1受容体の局在を説明するためのプロトコルを提示します。...

アンジオテンシンII受容体のローカライズされた可視化のための受容体オートラジオグラフィープロトコル

ここでは、アンジオテンシンII治療によって開始エンドサイトーシスの間に緑色蛍光タンパク質タグ付きアンジオテンシン1a型受容体を発現画像セルにプロトコルを提示します。この技術は、第二の蛍光マーカーで標識リソソームを含み、その後時間をかけて立体的に受容体とリソソームの共局在を分析するためのソフトウェアを利用します。...

共焦点顕微鏡を使用してトランスフェクトされたヒト胚性腎細胞におけるアンジオテンシン受容体1a型の人身売買のライブセルイメージングと3D解析

ペプチドおよびタンパク質定量を使用して自動免疫-MALDI (iMALDI)

低運動エネルギーの中性SO2クラスター(&lt;0.8...

クラスターによる脱着/イオン化質量分析による、表面上の複雑分子とその反応の解析

この記事では、アルカリホスファターゼ結合ScFv D11抗体を使用した免疫蛍光法による組織内のイソレブグランジンの測定のための詳細な方法論を提供します。マウスとヒトの両方の高血圧モデルは、組織サンプル中のイソレブグランジン測定に関連する段階的な手順と基本原理を説明するために使用されます。...

D11 scFv-アルカリホスファターゼ融合タンパク質と免疫蛍光を用いた組織中のイソレブグランジンの直接検出(英語)

ここでは、アンジオテンシンII注入によって誘発された高血圧マウスにおける腎交感神経除神経(RDN)のプロトコルを提示します。この手順は再現性があり、便利であり、高血圧および心肥大に対するRDNの調節メカニズムを研究することを可能にする。...

腎除神経の改善により、アンジオテンシンII注入による高血圧が軽減されました。

ここでは、光親和性標識を使用して低分子結合タンパク質を同定する方法を説明します。この技術の利点は、標的タンパク質の結合および共有結合標識が生細胞環境内で行われるため、細胞溶解時に天然タンパク質の構造および結合条件を破壊するリスクが排除されることです。...

ライブセル光親和性標識によって、ネイティブの細胞環境における小分子結合タンパク質の同定

学ぶニトロペプチドの化学的濃縮と質量分析による同定法。アンジオテンシンIIをモデルに、チロシン硝化タンパク質の検出感度を向上させ、in vitroおよびin vivo系への応用が可能です。

アンジオテンシンIIによるニトロペプチドプロファイリングと同定

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