Name: 誘導、細胞型における発現シロイヌナズナLhGR を介したトランス-活性化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 学ぼう、緑色ゲートクローニングシステムを用いてArabidopsis thalianaの主要な分裂組織で誘導的かつ細胞型特異的な遺伝子発現を実現する方法です。この技術は植物の発生生物学における遺伝子機能解析に有用です。

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我々 の研究室での仕事はドイツ研究振興協会 (DFG) によってサポートされている助成金ヲ 1660/6-1 (南西) におよび GR 2104/4-1 (T.G.) と (TG および J.U.L) に SFB1101 と欧州研究評議会によってコンソリ データ付与 (PLANTSTEMS 647148) T.G. 南西は DFG を通じて助成を 1660/2 エミー賞ネーター的な団体を通してサポートされています。

<ol><li>Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transactivated+and+chemically+inducible+gene+expression+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Transactivated and chemically inducible gene expression in plants.</a> The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).</li>
<li>Lampropoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GreenGate---a+novel%2C+versatile%2C+and+efficient+cloning+system+for+plant+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis.</a> PLoS One. 8 (12), e83043(2013).</li>
<li>Baroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictable+activation+of+tissue-specific+expression+from+a+single+gene+locus+using+the+pOp%2FLhG4+transactivation+system+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis.</a> Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).</li>
<li>Craft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+pOp%2FLhG4+vectors+for+stringent+glucocorticoid-dependent+transgene+expression+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).</li>
<li>Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcription+activation+system+for+regulated+gene+expression+in+transgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).</li>
<li>Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pOp6%2FLhGR%3A+a+stringently+regulated+and+highly+responsive+dexamethasone-inducible+gene+expression+system+for+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco.</a> The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).</li>
<li>Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steroid-binding+domains+for+regulating+the+functions+of+heterologous+proteins+in+cis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis.</a> Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).</li>
<li>Schurholz, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+Toolkit+for+Inducible%2C+Cell+Type-Specific+Gene+Expression+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).</li>
<li>Kubo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+switches+for+protoxylem+and+metaxylem+vessel+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation.</a> Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).</li>
<li>Di Laurenzio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SCARECROW+gene+regulates+an+asymmetric+cell+division+that+is+essential+for+generating+the+radial+organization+of+the+Arabidopsis+root%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root.</a> Cell. 86 (3), 423-433 (1996).</li>
<li>Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+SCARECROW+function+reveals+a+radial+patterning+mechanism+common+to+root+and+shoot%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot.</a> Development. 127 (3), 595-603 (2000).</li>
<li>Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pGreen%3A+a+versatile+and+flexible+binary+Ti+vector+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).</li>
<li>Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+the+floral+dip+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.</a> Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).</li>
<li>Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABI-Kat+SimpleSearch%3A+new+features+of+the+Arabidopsis+thaliana+T-DNA+mutant+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database.</a> Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).</li>
<li>GABI KAT. Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html">https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html</a> (2018).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+addition+quantitative+real-time+PCR+%28SAQPCR%29%3A+a+novel+approach+for+determination+of+transgene+copy+number+avoiding+PCR+efficiency+estimation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation.</a> PLoS One. 8 (1), e53489(2013).</li>
<li>Wallner, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strigolactone-+and+Karrikin-Independent+SMXL+Proteins+Are+Central+Regulators+of+Phloem+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation.</a> Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).</li>
<li>Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+of+cell+fate+decisions+by+CLAVATA3+in+Arabidopsis+shoot+meristems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems.</a> Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).</li>
<li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cellulose+synthases+in+Arabidopsis+secondary+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls.</a> Science. 350 (6257), 198-203 (2015).</li>
<li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN6+and+VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN7+effectively+induce+transdifferentiation+into+xylem+vessel+elements+under+control+of+an+induction+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system.</a> Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).</li>
<li>Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+a+Gal4-mediated+LUC%2FGFP%2FGUS+enhancer+trap+system+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis.</a> BMC Plant Biology. 5, 9(2005).</li>
<li>Aoyama, T., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glucocorticoid-mediated+transcriptional+induction+system+in+transgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants.</a> The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).</li>
<li>Decaestecker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-TSKO+facilitates+efficient+cell+type-%2C+tissue-%2C+or+organ-specific+mutagenesis+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2018).</li>
</ol>

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ここでは、生成および誘導型、セル型特定トランスの汎用性と包括的なツールキットを適用に必要な手順を述べる-活性化。ドライバーの行とポップのプロモーターの制御下でエフェクター カセットを運ぶラインを渡る F1 世代、幅広い種類の細胞で遺伝的摂動の迅速な評価を有効にすることで誤表現効果を勉強できます。また、エフェクターの構造は、ドライバーの行に変換する使用ことができます。 または、クローンの戦略、ドライバー、エフェクターを適応させることによって構築組み合わせることもできます 1 つの T-DNA に。アプリケーションからこのシステムの範囲の時空間制御ドメイン固有ノックダウンまたは遺伝子編集と細胞型特定の補完に誤表現学部。
ここで説明する手順のいずれもは、一般的な分子生物学の技術のための装備のラボへの挑戦を提起するべき。LhG4 式システム徹底的にテストされており、高に駆動することができます非水漏れやパワーバルブ式レベル8、されますが、我々 はインデューサ濃度のダイナミック レンジは、各ドライバーの経験的確...

ポストゲノム時代における生物学の主要な制限は、特定の要因や遺伝的摂動のコンテキストの特定の役割を解読することです。関数の損失と利得の機能のアプローチなど遺伝的摂動構成では、プライマリとセカンダリの効果の違いを難読化、生涯適応プロセスのエンドポイント解析頻繁のみ許可します。さらに、コンテキストの特定の機能をマスクまたは遠い組織または開発の他の段階で大規模な効果によって希釈できます。また、極端な場合、致死することができます任意の機械論的な洞察力を妨げるもの。理想的には、これらの問題を回避するために、時間分解の方法で特定のセル型などの特定のコンテキスト内で急性の遺伝的摂動の効果を分析 1 つ。そのためには、誘導、細胞型特異的発現の遺伝学的ツール、必要な1です。与えられたエフェクターへの応答の時空間ダイナミクスの迅速な評価のため、リソースを提供するために我々 は定める GreenGate システム2 GR LhG4 システム3,の実証済みの有効性とクローン作成の容易さを結合した4,5,6。我々 は、LhG4 はよく特徴付けられる細胞の種類特定のプロモーター8の制御の下でラットのコルチコイド受容体 (GR)7のリガンド結合ドメインに融合キメラ転写因子を表現する行のセットを生成しています。GR ドメインは細胞質 HSP90 に拘束条件を安静時の転写因子の核外ままです。合成リガンド デキサメタゾン (Dex) の追加により、核移行が誘導される LhG4 は式カセット mTurquoise2 記者などの同種合成pOp 型プロモーターの制御下での転写を仲介して誘導後定義式のドメインを視覚化するドライバーの行に含まれます。 したがって、ドライバーの行技術的にまた含まれているエフェクタ カセット。したがって、たとえば、同じpOp 型プロモーターの制御下で興味の遺伝子とエフェクター カセットを運ぶライン ドライバーの行のセットの交差により、エフェクター表現の急性または長期的な結果を迅速に評価幅広い種類の細胞。
ここで、ドライバーとエフェクターの行を生成し、細胞型特異的発現が誘導し、茎頂や根の頂端分裂組織の形成に続いて方法を示して必要な手順を記述したプロトコルを提供します。シロイヌナズナ。力とこの方法の特異性を説明するためによく知られているトランスクリプション要因 VND7 異所萌出へ木部二次細胞壁肥厚を運転することができる利用9。シロイヌナズナの細胞幹デンプン鞘内異所性木部細胞の形成につながるpSCR10,11ドライバー ラインとpOp6:VND7エフェクター ライン間のクロスから F1 を治療します。
ドライバーとエフェクターの発現プラスミドを構築するために必要な大規模な DNA アセンブリの生成を容易にするには、方法2のクローン作成の迅速かつ効率的な GreenGate を使用しました。GreenGate クローニングは2エコ31I やその isoschizomer Bsaなどタイプ II 制限酵素に基づいています。これらの酵素はカット基本組成を変化させてオーバー ハングを生産、不斉認識サイトの下流。エコ31I を組み込むことによって/Bsa私制限サイト オリゴヌクレオチドと DNA 要素に特定の突出部分シーケンスの割り当て、モジュラー クローン作成を実現、大規模なアセンブリの生成を促進します。GreenGate フレームワークで DNA モジュールはアダプターとして機能し、その順序で組み立てられて A ~ F オーバー ハング シーケンスに基づいてカテゴリに分類されます。したがって、ご希望の商品を増幅するプライマーは選択したモジュール2 (図 1 a) に従ってする必要があります。内部エコ31I/Bsa私はサイトとシーケンスは GreenGate エントリと宛先モジュールと互換性がない、mutagenizing、なく低い効率を進むことが。また、サイト指示された突然変異誘発を使用してエコ31I を削除する/Bsa私遺伝子産物中のアミノ酸を変更するように注意して、制限のサイト。

<table><tbody><tr><td>Ampicillin</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>K029.1</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>カラム精製</td><td>Qiagen</td><td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td><td></td></tr><tr><td>イメージング用培養チャンバー</td><td>Sarstedt AG & Co. KG</td><td>1ウェル組織培養チャンバー、カバーガラス上II</td><td></td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4903</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific, UK</td><td>D139-1</td><td></td></tr><tr><td>Eco31I</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>FD0294</td><td></td></tr><tr><td>注射カニューレ (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2)</td><td>Sterican, Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>T832.2</td><td></td></tr><tr><td>ライカ TCS SP5 CLSM, HCX PL APO ラムダ ブルー 63x 水浸 objectiv</td><td>ライカ, ヴェッツラー, ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS 中</td><td>Duchefa, Haarlem, Netherlands</td><td>M0221.0050</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x&nbsp; 1.1 NA 水浸対物レンズ</td><td>ニコン, 港区, 東京, 日本</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿 35/10 mm</td><td>Greiner Bio-One GmbH, ドイツ</td><td>627102</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿60/150 mm</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿 120/120/17</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Germany</td><td>688102</td><td></td></tr><tr><td>Plant agar</td><td>Duchefa, Haarlem, Netherlands</td><td>P1001</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid extraction</td><td>Qiagen</td><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide (PI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Razorblade</td><td>Classic, Wilkinson Sword GmbH</td><td>7005115E</td><td></td></tr><tr><td>反応管</td><td>Sarstedt AG & Co. KG</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>AppliChem GmbH</td><td>3834.001</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000c</td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>スルファジアジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6387</td><td></td></tr><tr><td>テトラサイクリン</td><td>AppliChem GmbH</td><td>2228.0025</td><td></td></tr><tr><td>T4 リガーゼ 5 U/&micro;l</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>T4 リガーゼ 30 U/&micro;l</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>EL0013</td><td></td></tr></tbody></table>

誘導、細胞型における発現シロイヌナズナlhgr を介したトランス-活性化

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

誘導、組織固有の式は遺伝的摂動の時空間的ダイナミクスを研究するための重要かつ強力なツールです。エフェクターの式をドライブすることができます形質転換シロイヌナズナ行セットを生成しているクローン作成実績とベンチマークを行った LhGR システム (ここでは GR LhG4 と呼ばれる) 誘導式の柔軟かつ効率的な GreenGate 組み合わせることで、3 つの主要な植物の分裂で特定の細胞型の範囲でのカセット。このため、我々 はキメラ転写因子と表現のレベルの広い範囲にわたってタイトなコントロールを確保する同種pOp 型プロモーターに基づいて開発済みの GR LhG4 システムを選んだ。さらに、合成転写因子がアクティブ式ドメインを視覚化するpOp4 または pOp6プロモーターの制御下で ER ローカライズ mTurquoise2 蛍光レポーターはドライバーの行でエンコードされます。ここでは、ドライバーまたはエフェクター ラインを生成し、細胞型特異的発現の誘導および茎頂、根の頂端分裂組織とシロイヌナズナのひこばえに続いてできる方法を示すに必要な手順について述べる。使用するには、いくつかまたはすべてのドライバー ライン、1 つのコンテキスト特定効果かポップ合成プロモーターの制御下で複数の要因 (エフェクター) を 1 つのエフェクターと複数間のクロスの F1 植物で急速に、たとえば評価できます。ドライバーの行。このアプローチは、VND7、細胞自律的に異所性の二次細胞壁形成を誘導することができる NAC 転写因子の異所性発現によって例証されます。

GreenGate クローニングを介してドライバーとエフェクターの行の世代
クローニング システム GreenGate、GoldenGate のクローニングとBsaタイプ IIS の制限の endonuclease の使用に基づいて私またはその isoschizomerエコ31I。その不斉認識のサイトでオーバー ハングの基本組成から遠い酵素生成張り出しが自由にすることができます選択すると、基礎となるシステムのモジュールを形成します。PCR 生成した要素、たとえば、プロモーター、CD、または終端文字、各最初、モジュールを生成する制限のダイジェストのプロデュースのオーバー ハングに一致する指定されたエントリ ベクトルに挿入されます。Subcloning 後、一致するモジュール、通常六つの数、バイナリー デスティネーション ベクトルの構成要素のアセンブリの結果 GreenGate ligation の反作用のために使用されます。
ドライバーの線、組織固有のプロモー...

ここでは、我々 は生成を記述して形質転換シロイヌナズナのセットのアプリケーション線 3 主な分裂、茎頂や根の頂端分裂組織形成層で有効にする、組織固有の誘導式です。

誘導、細胞型における発現シロイヌナズナLhGR を介したトランス-活性化

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

発生生物学の主な目標は、遺伝子の文脈固有の役割を理解することです。そして、これは従来のノックアウト突然変異体によって、または構成的な過剰発現線によって達成することは困難であり得る。モジュラーグリーンゲートクローニングシステムを用いて、モデル植物シロイヌナズナの3つの主要なメリステムに誘導可能な細胞特異的発現のためのリソースを生成しました。同じモジュラークローニング戦略を使用して、この方法は、変換に不変である他の植物種に適用することができます。この手順の視覚的なデモンストレーションは、ステムと短い頂点のメリステムにおけるトランス活性化の効果を分析するには、イメージング前に解剖が必要であり、非常に困難であるため、貴重です。まず、テキストプロトコルで概説されているように種子を殺菌します。次に、pH 5.8で半強度のムラシゲとスクーグ培地を準備し、1%のスクロースと0.9%寒天を加えます。オートクレーブ処理後、DMSOに溶解したDexを誘導プレートに10~30マイクロモルの最終濃度で加えます。コントロールプレートに同量のDMSOを追加します。皿の上に根イメージングのための種子を置き、暗闇の中で48時間、摂氏4度でそれらを層化します。プレートを植物のインキュベーターの垂直位置に入れ、5日間成長させます。発芽の5日後、共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して苗を画像化します。まず、テキスト プロトコルで説明されているようにシードを準備し、拡大します。発芽後6~7日後、各苗を別々の鍋に移します。水を入れ、植物を誘導する場合は、25ミクロモルDEX溶液を水中に使用し、エタノールに溶解した25ミリモルDEXのストックから調製した。2~3日ごとに水が誘導の所望の時間まで。浸漬によって誘導する場合は、25マイクロモル最終濃度またはDEXと模擬処理のためのDMSOの同等量で0.02%シルウェットL77とDEXを含む水の750ミリリットルで1リットルビーカーを調製します。1つの植物を誘導または模擬溶液に30秒間浸します。2~3日ごとに、望ましい撮影時間まで繰り返します。まず、テキスト プロトコルで説明されているようにシードを準備し、拡大します。発芽後6~7日後、各苗を別々の鍋に移します。茎の長さ約1センチメートルの場合、水中に10〜50マイクロモルDEX溶液を使用して蛍光SAMをスプレーします。開発の後期段階での誘導およびイメージングのために、より長い茎または側面の芽のSAMを誘導する。誘導後24~48時間、SAMを解剖し、イメージングに進みます。まず、ウオジジウムプロピジウムのミリレター溶液あたり10マイクログラムにプレートから苗を移し、それらを5分間対抗します。根を顕微鏡イメージングチャンバーに入れ、63倍の水浸し目的を持つ共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して画像化します。ヨウ化プロピジウム蛍光を可視化するには、励起波長488ナノメートルを使用し、590~660ナノメートルの発光を収集します。mTurquoise2蛍光の場合は、458ナノメートルの励起を使用し、順次スキャンを使用して460〜615ナノメートルの間の放出を収集します。まず、目的のセクションの反対側に指でステムを固定します。カミソリの刃を使用して、約3センチメートルのセグメントをカットし、いくつかの細かいカットを実行します。水道水を含むペトリ皿にカミソリの刃をすすいで、茎のセクションを収集します。セクションを汚すか、顕微鏡スライドに直接取り付けます。染色のために、反応管にヨウ化プロピジウムの1ミリリットル溶液あたり250マイクログラムの1ミリリットルを調製する。ペトリ皿から水道水をピペットで取り出し、ヨウ化プロピジウム溶液と5分間汚れに置き換えます。次にヨウ化プロピジウム溶液を取り出し、水ですすいでください。細かい鉗子か細かい絵筆を使用して、顕微鏡のスライドに染色された切片を移す。25x浸漬レンズを備えた共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して、サンプルを画像化します。561ナノメートルのレーザー光を使用して、ヨウ化プロピジウム蛍光を励起し、570〜620ナノメートルの発光を収集します。405ナノメートルのレーザー光を使用して、ドライバーライン構築物でコードされたmTurquoise2フルオロフォアエフェクターを励起し、425〜475ナノメートルの放出を収集します。まず、鉗子を使用して、シュートチップの2センチメートル下の茎を切断します。片手で茎を保持し、花の芽と大きなプリモディアを除去するために細かい鉗子を使用しています。若いプリモリアを取り除くために、3%のアガロースを含むペトリ皿の直立した位置にSAMを固定します。次に、双眼鏡と鉗子を使用して、SAMに近い若いプリモディアを取り除く。解剖したSAMをヨウ化プロピジウムの1ミリリットル溶液あたり250マイクログラムを含むチューブに移す。染色手順中にサンプルが完全に水没していることを確認しながら、サンプルを5〜10分間染色します。染色したSAMを3%のアガロース培地を含む小さなペトリ皿に入れます。SAMを二重蒸留水で覆います。25x浸漬レンズを搭載した共焦点レーザー顕微鏡を使用して、解剖されたSAMを画像化します。561ナノメートルのレーザー光を使用して、ヨウ化プロピジウム蛍光を励起し、570〜620ナノメートルの排出量を収集します。405ナノメートルのレーザー光を使用して、mTurquoise2フルオロフォアを励起し、425〜475ナノメートルの発光を収集します。Z方向に50マイクロメートルに及ぶ画像スタックを、0.5マイクロメートルのステップサイズで記録します。DEXによる誘導は、細胞型特異的mTurquoise2発現を、葉膜前駆体およびカンビウムの根内皮および、そして、シュートの中の幹細胞に由来する。トランスアクチベートの試験事例として、V16活性化ドメインに融合した第二細胞壁マスター転写因子VND7をコードするエフェクターラインが生成される。DEXまたはDMSOの15マイクロリットルで5日間の単一処理の後、ステム切片は開始シースにおける異所性批准の視覚化のために調製される。誘導サンプル中の開始シース細胞は、ヨウ化プロピジウムチャネルに対する強いシグナルを示し、いくつかの細胞は、キシレム細胞における細胞壁の典型的な網状肥厚を示す。このビデオを見た後、あなたは異なる組織で遺伝子発現を誘導する方法とイメージングのためにあなたのサンプルを準備する方法を明確に理解する必要があります。この手順に従って、確立されたドライバラインは、研究の関心に応じて他のユーザーによって生成された多種多様なエフェクター構造で使用することができます。このショートカットは、植物研究者が細胞型特異的発現または関心遺伝子のノックダウンの効果を時間予約された方法で迅速に評価するのに役立つはずです。この細胞型特異的誘導系は、コルチコステロイドデキサメタゾンの使用を必要とする。直接接触は避けるべきなので、治療中は手袋とフェイスマスクを着用することが重要です。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

空間固有のフィトクロム応答の分子基盤は、組織および器官特異的フィトクロムの欠陥を示すトランスジェニック植物を用いて検討されている。マイクロアレイ解析に続いてソート蛍光活性化細胞により誘導されるフィトクロム発色団の枯渇を示す特定の細胞の単離は、空間的な固有のフィトクロム反応に関与する遺伝子を同定するために活用されています。...

でFACSアシスト細胞型特異的発現プロファイリングを使用して組織と器官特異フィトクロム応答を調査シロイヌナズナ</em

特定の植物遺伝子上にヒストン修飾を検出するために信頼性の高い有用なアプローチが説明されています。アプローチは、クロマチン免疫沈降（ChIP）とリアルタイム定量PCRを兼ね備えています。それは、多様な生理学的プロセスにおいて役割を持つ特定の遺伝子のヒストン修飾の検出を可能にする。...

植物の葉におけるヒストン修飾の検出

の細胞特異的な分析<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;蛍光活性化細胞選別を使用した葉

私たちは、 シロイヌナズナの種子から種皮寝具アッセイ（SCBA）を構築する手順を紹介します。 SCBAは、遺伝的およびin vitroで探索する強力なツールであることが示されたか休眠種子中の光の合図に応答して、胚乳を制御し種子の発芽。 SCBAは胚乳が胚の成長に影響を与えることが疑われるあらゆる状況下で適用可能な原則です。...

遺伝的に探索するために種皮寝具アッセイ<em&gt;体外</em&gt;どのように胚乳コントロール種子発芽<em&gt;シロイヌナズナ</em

クロマチン免疫沈降は、DNAは、インビボでのシロイヌナズナのタンパク質の結合部位を同定するための強力な技術です。この手順は、クロマチン架橋および断片化、目的のタンパク質に対する選択的な抗体を用いた免疫沈降、および結合したDNAの定量PCR分析を含みます。私たちは、シロイヌナズナ植物用に最適化され、単純なChIPアッセイを説明します。...

シロイヌナズナタンパク質-DNA相互作用の同定のための免疫沈降アッセイクロマチン<em&gt;インビボ</em

側根誘導系で<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;とトウモロコシ

このプロトコルでは、顕微鏡下で胚パターン形成の検査続く胚珠クリアランスを介してシロイヌナズナの胚発生を観察するためのメソッドについて説明します。...

シロイヌナズナの胚発生の特性評価法

粒子衝突の後大麦アリューロン細胞の構造において、記者から一時的な遺伝子発現の測定のため改良されたプロトコルが表示されます。96 ウェル...

スループットを向上させると衝撃されたオオムギ糊粉層における遺伝子発現を測定

本論文では、免疫エリミターへの曝露後のアラビドプシス・タリアナにおける防御応答を定量化する2つの方法について、一過性酸化バーストと苗増殖の抑制について述べた。...

アラビドプシスタリアナにおけるパターン誘発酸化バーストと苗成長抑制アッセイ

リボソームアフィニティー精製(TRAP)を翻訳すると、臓器や組織の最小限の処理で開発プログラムを解剖する可能性があります。このプロトコルは、緑色蛍光タンパク質(GFP)標識リボソームサブユニットを標的とした細胞から高品質のRNAを生成します。qRT-PCR や RNA-seq...

細胞型特異的スケールでのシロイヌナズナ・タリアナの開発を調査するためのリボソーム親和性精製(TRAP)の翻訳

学ぼう、緑色ゲートクローニングシステムを用いてArabidopsis thalianaの主要な分裂組織で誘導的かつ細胞型特異的な遺伝子発現を実現する方法です。この技術は植物の発生生物学における遺伝子機能解析に有用です。

誘導、細胞型における発現シロイヌナズナLhGR を介したトランス-活性化

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