Name: 自己免疫の混合キメラ モデルの光活性化によって個々 の自己反応性濾胞を尋問 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: 学ぶ光活性化GFPを用いたマウス骨髄キメラモデルによる自己反応性濾胞のin vivo解析法。細胞局在と分子解析を関連付け、自己免疫疾患の病態理解と新規治療法開発に貢献する。

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SE デーグンは仲間の Lundbeckfonden とカールスバーグ財団上席研究員です。この仕事の一部また、NNF 医グラント (SE デーグン) によって支えられました。

<ol><li>Lerner, A., Jeremias, P., Matthias, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+World+Incidence+and+Prevalence+of+Autoimmune+Diseases+is+Increasing%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Celiac+Disease%22%5BJournal%5D)">The World Incidence and Prevalence of Autoimmune Diseases is Increasing.</a> International Journal of Celiac Disease. 3 (4), 151-155 (2015).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).</li>
<li>Mutoh, T., Miyata, T., Kashiwagi, S., Miyawaki, A., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+behavior+of+individual+cells+in+developing+organotypic+brain+slices+revealed+by+the+photoconvertable+protein+Kaede%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">Dynamic behavior of individual cells in developing organotypic brain slices revealed by the photoconvertable protein Kaede.</a> Experimental neurology. 200 (2), 430-437 (2006).</li>
<li>Tomura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+cellular+movement+in+vivo+with+photoconvertible+fluorescence+protein+%E2%80%9CKaede%E2%80%9D+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein “Kaede” transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (31), 10871-10876 (2008).</li>
<li>Tomura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+and+quantification+of+dendritic+cell+migration+and+antigen+trafficking+between+the+skin+and+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Tracking and quantification of dendritic cell migration and antigen trafficking between the skin and lymph nodes.</a> Scientific Reports. 4, 6030(2014).</li>
<li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nature biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).</li>
<li>Pereira, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+metastases+can+invade+local+blood+vessels%2C+exit+the+node%2C+and+colonize+distant+organs+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+NY%29%22%5BJournal%5D)">Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice.</a> Science (New York, NY). 359 (6382), 1403-1407 (2018).</li>
<li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+NY%29%22%5BJournal%5D)">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science (New York, NY). 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li>
<li>Victora, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germinal+center+dynamics+revealed+by+multiphoton+microscopy+with+a+photoactivatable+fluorescent+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Germinal center dynamics revealed by multiphoton microscopy with a photoactivatable fluorescent reporter.</a> Cell. 143 (4), 592-605 (2010).</li>
<li>Habuchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+single-molecule+photoswitching+in+the+GFP-like+fluorescent+protein+Dronpa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reversible single-molecule photoswitching in the GFP-like fluorescent protein Dronpa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9511-9516 (2005).</li>
<li>Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+protein+activity+by+fluorescent+protein+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+NY%29%22%5BJournal%5D)">Optical control of protein activity by fluorescent protein domains.</a> Science (New York, NY). 338 (6108), 810-814 (2012).</li>
<li>Degn, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+Evolution+of+Autoreactive+Germinal+Centers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clonal Evolution of Autoreactive Germinal Centers.</a> Cell. 170 (5), 913-926 (2017).</li>
<li>Berland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+7-dependent+loss+of+B+cell+tolerance+in+pathogenic+autoantibody+knockin+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 7-dependent loss of B cell tolerance in pathogenic autoantibody knockin mice.</a> Immunity. 25 (3), 429-440 (2006).</li>
<li>Chatterjee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+C4+maintains+peripheral+B-cell+tolerance+in+a+myeloid+cell+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Complement C4 maintains peripheral B-cell tolerance in a myeloid cell dependent manner.</a> European journal of immunology. 43 (9), 2441-2450 (2013).</li>
<li>Toubai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+acute+GVHD+by+sex-mismatched+H-Y+antigens+in+the+absence+of+functional+radiosensitive+host+hematopoietic-derived+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Induction of acute GVHD by sex-mismatched H-Y antigens in the absence of functional radiosensitive host hematopoietic-derived antigen-presenting cells.</a> Blood. 119 (16), 3844-3853 (2012).</li>
<li>Luzina, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+formation+of+germinal+centers+in+autoimmune+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous formation of germinal centers in autoimmune mice.</a> Journal of leukocyte biology. 70 (4), 578-584 (2001).</li>
<li>Sachs, D. H., Kawai, T., Sykes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+tolerance+through+mixed+chimerism%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+perspectives+in+medicine%22%5BJournal%5D)">Induction of tolerance through mixed chimerism.</a> Cold Spring Harbor perspectives in medicine. 4 (1), a015529(2014).</li>
</ol>

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自己免疫疾患モデルマウスの数が多い、自然濾胞16多くの提示があります。ただし、利用可能なモデルの多くを抱く複雑な遺伝的背景やリンパ球の増殖や活性化、悪い記者ラインと正常リンパ球挙動の研究と地域に適したそれらをレンダリングの中央のレギュレータの変異自己免疫疾患のそれぞれ。現在のモデルでは、それどころか、自己反応性野生由来型胚中心 B 細胞によって表される現在の場合遺伝子ノックアウト、記者、必要な組み合わせを使用しての詳細な分析に「プラグ アンド プレイ」アプローチも可能します。活性型 GFP。体内のラベリング方法を使用すると、単一胚中心は explanted リンパ系組織と 2 光子顕微鏡を用いた、細胞成分センサーで視覚化できます。単一胚中心からセンサー リンパ球は、単一のセル、または一括で、分析または並べ替えられた細胞をすることができます。これらの細胞は、自己免疫の分野に新たな洞察を提供する追加の下流分子・機能解析後に受ける場合が。
このプロシージャの成功したパフォーマンスのいくつかの重要なステップがあります。代表的な結果、照射によって示されるように (1,100 Rad) ドナー骨髄再構築が正常に降伏 B 細胞コンパートメントのキメリズムのほぼ完全な受信者骨髄コンパートメントを置き換えるとします。これは重要なポイント、残留受信者由来 B 細胞が '暗い' 胚中心の人口のサブセットをレンダリングします。照射用ソースに関係なく照射の線量/タイミングは動物に最小限の巻き添え組織の損傷と最大破壊的効果をもたらす最適化するようにしました。再構成、高い溶解度を確実に屈する骨粉砕プロトコルと 2000 万合計ドナー細胞の再構成を発見されています。骨髄を抽出するため生殖不能および風邪の氷を作業骨髄ドナーの高生存率が保証されます。必要なドナー骨髄の比率に達すると、細胞は、それ自身をカウントするため、カウントするため骨髄のサブサンプルを取り出すときの因数をカウントする場合は、細心の注意を行使する必要です。混合の共同遠心分離と別々 に再混合し、代わりに、ドナーの骨髄をペレット化をドナーの比率は次の細胞数任意の傾斜を防ぐために提供しています。
混合骨髄キメラ世代のプロトコルは、単独で立つことができるし、希望の記者や遺伝子ノックアウトと自己反応性濾胞とキメラを生成できます。しかし、この 1 つの制限は留まらずドナーを使用する必要です。564Igi ひずみが c57bl/6 j コンジェニック背景あり結果として、他の寄付および受信者 2b コンジェニック背景があるべきである (または 564Igi ひずみが目印して、目的のひずみと自己免疫表現型にも新しいバック グラウンドで確認)。照射プロシージャは免疫寛容環境17を好む傾向がある、いくつかのマイナーな組織適合性の抗原不一致が容認されるかもしれない。しかし、この側面徹底的に場合考慮するべき、特に男性と女性ドナーおよび/または女性男性限定 Y 抗原反応性の可能性があるのため、受信者を混合します。
同様に、プロトコルの photoactivation の側面は、単独で立つことができるし、多くの異なった文脈で使用することがあります。ただし、PA GFP レポーターは現在では間質細胞ですがのすべての造血系統の細胞で活発である UBC プロモーターを利用ではのみ。導入で述べたように、他の活性型、スイッチング、または蛍光レポーター系統利用と実験条件の適切な調整と PA-GFP に代えることができます。
900 を上回るレーザーを維持することによって望ましくないエリアの不注意の photoactivation を避けることが重要です nm イメージング、この波長は photoactivate PA GFP いないとき。自体 photoactivation、レーザー パワーとピクセル滞留時間など、特定の設定によって異なります組織、特定の組織が使用すると、イメージング システムの深さと各アプリケーションが使用される特定のイメージング システムの最適化するようにしました。注意が必要しないように光損傷細胞が同時に下流解析の活性化細胞の十分な表現を得るために、スタック全体の効率的な光を得るために不可欠です。胚中心 B 細胞一般に構成するどこでも 0.5% から脾または皮膚リンパ節 B 細胞の ~ 2% に、センサー単一胚中心 B 細胞全体の ~ 1% を構成する (図 5) の代表の結果からわかるように、人口単一脾臓スライス内に存在します。したがって、解析に成功または細胞のかなりの数の並べ替えは、多数のイベントを処理する必要があります。

自己免疫疾患の発症率は、過去数十年の西部の社会で特に急速に上昇しています。今日、西部の世界1死亡率と罹患率の最も一般的な原因の一覧で第 3 ランク付けする自己免疫疾患です。開発および自己免疫疾患の進行に関する基本的な質問は未解答に残る。病機構と細胞動態の理解の進歩のための 1 つの要件は、下流の分子または機能解析と細胞のサブセットの microanatomical の場所の正確な結合です。正確な microanatomical ラベル付けと追跡携帯の過去 10 年間で安定した蛍光、活性型、またはスイッチング生物 fluorophores と記者系統への統合の数の開発が有効になってマウスモデルでのサブセット。
楓、イシサンゴ, 発蛍光蛍光タンパク質は、紫や紫外線ライト2への露出に赤い蛍光グリーン蛍光から不可逆的な光電を経る。脊髄脳スライス3の開発に個々 の細胞の動的挙動に従う採用当初、ノックアウトのマウスはその後、生体内で細胞の動きを監視許可楓とシステムの生成は分析に適用しました。免疫細胞の移動してリンパ節4から。このアプローチは、その後第二世代記者5洗練されました。似たような記者は Dendra6、最近 vivo7でリンパ節転移の追跡に使用されました。
開発最初の活性型タンパク質は、緑色蛍光タンパク質 (GFP) 単一の点突然変異 (T203H)、設計波長域で非常に低い吸光度に 550 nm8450 からのリードだった。紫外光による光後、この活性型緑色蛍光タンパク質 (PA-GFP) スイッチ 〜 400 から最大吸収 〜 500 nm、おおよそ 100 強さを降伏を高める波長 488 の興奮すると nm。トランスジェニック マウスすべての造血細胞が PA GFP を表現の生成は最初の時間のため、胚中心9の解剖学的定義の明るい部分と暗いゾーンで B 細胞の選択の詳細な分析を許可しました。
スイッチング タンパク質が両方の条件10 間シャトルに対し、光は蛍光状態に非蛍光状態から不可逆変換、光電は別の 1 つの波長からの一方向移行、.この後者の能力は最近蛋白質活動11の光制御のエンジニアに活かされました。
PA GFP レポーターを活用し、我々 は最近の自発のループスのような自己免疫12の新しいモデルの 1 つの胚中心 B 細胞レパートリーを特徴付けられます。このモデルは 1部骨髄、自己反応性 B 細胞受容体ノックアウトの ribonuclear 蛋白質複合体 (14564Igi13,) に特異的な 2 つの部分から骨髄の併用をかくまっていると混合キメラに基づく目的ドナー。約 6 週間ポスト再構成する自発的な自己反応性濾胞脾臓とリンパ節の皮膚に存在している恒常性の条件が達成します。特に、胚中心 B 細胞の人口はほとんど専ら (~ 95%)非 564Igi コンパートメント由来の細胞から成る、これら野生型派生の B 細胞は、自己反応性をなっています。したがって、モデル、様々 な遺伝子があり、ノックアウト、記者を用いた自己反応性胚中心 B 細胞の解析に「プラグ アンド プレイ」のアプローチです。ここでは、自発的な自己反応性濾胞 PA GFP レポーターを運ぶリンパ球移入と混合キメラを生成するための手順をについて説明します。体内のラベリング方法を使用すると、単一胚中心は explanted リンパ系組織と 2 光子顕微鏡を用いた、細胞成分センサーで視覚化できます。その後この単一胚中心からセンサー リンパ球できますフローサイトメトリーで分析したまたは螢光色素アクティブ セル (FACS) を並べ替えで並べ替えられ、下流解析分子と機能追加を受けます。単一の胚中心から自己反応性リンパ球を分析する能力は、自己免疫の分野に新たな洞察を提供する直接適用可能性がありますが、技術や手法の説明はさらに、研究に関連するアプリケーションを検索感染症、腫瘍の転移。

<table><tbody><tr><td>抗体、9D11-A568</td><td>自社生成</td><td></td><td>9D11ハイブリドーマ、提供:MC Carroll提供、標識キット:Biotium 92255</td></tr><tr><td>抗体、9D11-A647</td><td>自社生成</td><td></td><td>9D11ハイブリドーマ、提供:MC Carroll提供、キット標識:Nordic Biosite ABD-1031</td></tr><tr><td>抗体、FITC 抗マウスCD45.1</td><td>Biolegend</td><td>110705</td><td></td></tr><tr><td>抗体、パシフィックブルー抗マウス/ヒトGL7抗原(T細胞およびB細胞活性化マーカー)</td><td>バイオレジェン</td><td>ド144613</td><td></td></tr><tr><td>抗体、PE抗マウスCD169(Siglec-1)</td><td>バイオレジェンド</td><td>142403</td><td></td></tr><tr><td>抗体、PE/Cy7抗マウスCD38</td><td>バイオレジェンド</td><td>102717</td><td></td></tr><tr><td>抗体、PerCP/Cy5.5抗マウス/ヒトCD45R/B220</td><td>バイオレジェンド</td><td>103235</td><td></td></tr><tr><td>毛細血管、マイラーラップ、ヘパリン処理</td><td>されたフィッシャーサイエンティフィック</td><td>211766</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー、70 & マイクロ;m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>円錐形チューブ、50 mL</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>カバー スリップ、正方形、22x22 mm、0.13-0.17 mm</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>22X22-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>メルク</td><td>1,084,180,250</td><td></td></tr><tr><td>エタノール、70%</td><td>VWR</td><td>8301.360</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメーター、FACS Canto II</td><td>BD Biosciences 338962</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメーター、LSRFortessa SORP</td><td>BD Biosciences-4</td>つの<td></td><td>レーザー(405 nm、488 nm、561 nm、640 nm)の特別注文製品 グリース</td></tr><tr><td>、高真空、ダウコーニング</td><td>VWR</td><td>DOWC1597418</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤、Burker-T&uuml;rk</td><td>VWR</td><td>630-1544</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン、IsoFlo獣医。</td><td>Orion Pharma</td><td>9658</td><td></td></tr><tr><td>リンパ球分離培地 (Lympholyte-M Cell Separation Media)</td><td>Cedarlane</td><td>CL5035</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube, 1.5 mL (Eppendorf)</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.550</td><td></td></tr><tr><td>Microscope, Two-photon</td><td>Prairie Technologies (now Bruker)</td><td>-</td><td>Special order Ultima In Vivo Two Photon Microscope</td></tr><tr><td>Mortar w. lip, uncreed, 75 ml</td><td>VWR</td><td>410-0110</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>1063290500</td><td></td></tr><tr><td>Needle, 18 gauge</td><td>BD Medical</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>VWR</td><td>87,769,290</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>d8537</td><td></td></tr><tr><td>乳棒ホモジナイザー</td><td>VWR</td><td>47747-358</td><td></td></tr><tr><td>乳棒, 素焼き, 175 mm</td><td>VWR</td><td>410-0122</td><td></td></tr><tr><td>ピペット、血清学的、10 ml</td><td>VWR</td><td>612-3700</td><td></td></tr><tr><td>ピペット、トランスファー、プラスチック</td><td>Sarstedt</td><td>861,172,001</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック パラフィン フィルム (パラフィルム M)</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>プレート、96 ウェル</td><td>ファルコン</td><td>353910</td><td></td></tr><tr><td>外科用鉗子、学生 Dumont #5 鉗子</td><td>FST - Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>外科用鉗子、学生デュモン#7鉗子</td><td>FST - ファインサイエンスツール</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>外科用ハサミ、学生ファインハサミ、ストレート</td><td>FST - ファインサイエンスツール</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ、10 mL</td><td>テルモ</td><td>SS-10ES1</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ、20 mL</td><td>テルモ</td><td>SS-20ES1</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ、5 mL</td><td>テルモ</td><td>SS-05S1</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ、インスリン、0.3 cc</td><td>BD Medical</td><td>324827</td><td></td></tr><tr><td>Tribrissen vet. 24% inj.、スルファジアジン 200 mg と 40 mg トリメトプリム/ml</td><td>MSD アニマルヘルス</td><td>431577</td><td></td></tr><tr><td>トリパン ブルー溶液、0.4%</td><td>VWR</td><td>K940-100ML</td><td></td></tr><tr><td>生存率染料、eBioscience 固定生存率染料 eFluor 780</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>65-0865-14</td><td></td></tr></tbody></table>

自己免疫の混合キメラ モデルの光活性化によって個々 の自己反応性濾胞を尋問

Interrogating Individual Autoreactive Germinal Centers by Photoactivation in a Mixed Chimeric Model of Autoimmunity

自己免疫疾患は、重大な健康負担を提示します。開発および自己免疫疾患の進行に関する基本的な質問は未解答に残る。根本的な病気のメカニズムと細胞動態の理解の進歩のための要件として、下流分子または機能解析と細胞のサブセットの microanatomical の場所の正確な結合伝統的に達成することは困難されている目標。安定した活性型生物 fluorophores のレポーターへの統合開発最近正確な microanatomical ラベルとマウスモデルでの細胞のサブセットの追跡を可能に。ここで述べる単一胚中心から自己反応性リンパ球を分析する能力が、自己免疫に新しい洞察力を提供するために役立つことがありますどのように例として活性型記者と自己免疫疾患の新規のキメラのモデルの組み合わせを使用して.混合キメラを生成するためのプロシージャ自発的な自己反応性濾胞の活性型緑色蛍光タンパク質レポーターを運ぶリンパ球移入を紹介します。生体内でのラベリング戦略を使用して、単一胚中心で視覚化すること explanted リンパ系組織とその細胞成分センサー 2 光子顕微鏡による。単一胚中心からセンサー リンパ球を分析できます単一セルまたは一括で細胞の並べ替えや追加下流分子・機能解析を受けることがあります。このアプローチは、自己免疫の分野に新たな洞察を提供する直接適用可能性がありますが、骨髄キメラと photoactivation の手順を生成するための手順は、感染症研究の広範なアプリケーションを見つけるかもしれないまた、腫瘍の転移。

混合骨髄キメラの生成
この議定書は頑健 (統計的有意性は、 12を参照してください) の代表的な結果が図 1に示すように、B 細胞コンパートメントの完全に近いキメリズムと混合骨髄キメラを実現します。血清型検査を明らかに正規化された B セル番号は 6 週間でポスト 9 11 (イディオ) の低頻度の再構成 (図 1 a)、正循環 B 細胞 564Igi コンパートメント (図 1 b) に由来します。総リンパ球ゲート内残留受信者由来細胞、~ 6% の低周波がある CD45.1 (Q1) ~ 94% (図 1) のキメリズムの全体的な程度を示します。ドナー内コンパートメント (CD45.1-、第 4 四半期 + Q3) 564Igi の比 (第 4 四半期) PA gfp (Q3) は約 23% から 77%。これは入力の 33% から 66% 率は B 細胞の重い負の淘汰によって説明されるよりもわずかに低く 564Igi コンパートメント12から派生します。B 細胞コンパートメントの実質的完全キメリズムがある図 1<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59397/59397fig1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59397/59397fig1large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59397/59397fig2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59397/59397fig2large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59397/59397fig3.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59397/59397fig3large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59397/59397fig4.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59397/59397fig4large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59397/59397fig5.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59397/59397fig5large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59397/59397fig6.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59397/59397fig6large.jpg" target="_blank"></a>

このプロトコルでは、どの自己反応性のリンパ球を運ぶ活性型緑色蛍光タンパク質 (GFP-PA) 記者自発的な自己免疫性の濾胞と混合骨髄キメラの生成について説明します。これは下流の分子・機能解析と組織の細胞の場所にリンクする機能を提供します。

Autoimmune diseases present a significant health burden. Fundamental questions regarding the development and progression of autoimmune disease remain ...

この生理学的に関連する自反応性発芽中心のキメラモデルは、細胞の局在を下流の分子分析とインビボで結び付け可能にする。自己反応性胚中心の混合キメラモデルの主な利点は、その汎用性と限界の性質であり、事実上任意の所望の細胞サブセットまたは分子経路の尋問を可能にする。自己免疫疾患開発のこのモデルの生理学的関連性は、新しい治療法の進歩を助けるかもしれない新しい洞察を可能にする。この骨髄キメラモデルは、免疫学、免疫腫瘍学、幹細胞研究に使用できます。光活性化成分は、組織局在化を下流細胞分析にリンクするため、幅広い使用法を有する。骨髄の準備と再構成および生体内の標識および組織の排泄ステップはすべて、視覚的なデモンストレーションに適した技術的に複雑な手順である。ドナー564Igiマウス大腿骨および脛骨を抽出するには、後肢1本から皮膚を取り除き、足を引っ張って膝関節と足首関節を飛び出す。足首関節を壊すために進みます。その後、脛脛につかまりながら足を体に向かって引っ張り、それによって脛脛筋から腱と筋肉を剥ぎ取る。膝関節を折って脛骨を解放し、大腿骨につかまりながら骨を体に向かって引っ張り、大腿骨から腱と筋肉を取り除きます。次に股関節を切開し、股関節から大腿骨を引き出す前に腱を切ります。同様の方法で対側の後肢の骨を取り除いた後、残りの筋肉と結合組織を取り除くために粗いペーパータオルで骨を慎重にこすり、氷冷骨髄緩衝液で剥がされた骨をすすいだ。その後、デュモン番号7鉗子を使用して、骨を氷上の新鮮な骨髄緩衝液の容器に移す。骨髄細胞を抽出するには、氷冷骨髄バッファーでモルタルを洗い流し、10ミリリットルの血清ピペットを使用して、洗浄バッファーを新鮮な氷冷骨髄バッファーの 10 ミリリットルに置き換えます。鉗子を使用して骨をモルタルに移し、害虫を使って骨をつぶして粉砕して骨髄を放出します。10ミリリットルのピペットを使用して骨髄抽出物を採取してから、骨髄溶液を70マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して氷上の50ミリリットルの円錐管に入ります。次に、新鮮な氷冷骨髄バッファーの追加 10 ミリリットルでモルタルをリンスし、細胞の完全な回復を確保します。ドナー懸濁液を調製するには、50ミリリットル円錐状チューブに光活性化可能なGFPおよび564Igiドナー骨髄の適切な量を混合し、遠心分離によって細胞をペレットにする。混合細胞ペレットを氷冷骨髄緩衝液1ミリリットル当たり10倍の濃度で再懸濁し、細胞を氷上の予め冷却された1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移す。次に、麻酔付きCD45.1レシピエントマウスのつまみへの応答の欠如を確認し、ドナー骨髄細胞のチューブをフリックして十分な再懸濁を確実にする。200マイクロリットルの骨髄混合物を1つの0.3ミリリットル、30ゲージのインスリン注射器にロードし、レシピエントを横にして、目の上下の皮膚を穏やかに伸ばして目をわずかに飛び出します。目と周囲の組織を避けるように注意して、目のソケットの前部に約30度の角度で注射器の先端を慎重に挿入します。針の先端が眼窩の下にある骨に触れたとき、針を約0.5ミリメートル引き込んでから、安定した圧力を使用してドナー骨髄をゆっくりと注入する。その後、完全に回復するまで監視して、アドリビタム抗生物質水でマウスをケージに戻します。ポピトリリンパ節に標識するには、PBSの18マイクロリットルでフィコエリトリン標識ラット抗マウスCD169抗体の2マイクロリットルを希釈し、抗体の2つの10マイクロリットルの液滴をプラスチックパラフィンフィルムに加える。各液滴を30ゲージ針で1本の0.3ミリリットルのインスリン注射器にロードし、麻酔付きレシピエント動物のフットパッドに10マイクロリットルの抗体を注入する。リンパ節を収穫する前に、平らな表面に正方形のカバースリップを置き、真空グリースを積んだ5ミリリットルのシリンジを使用して、各エッジから約1〜2ミリメートルのグリースでカバースリップの端を追跡します。チャンバーを冷たい平らな表面に移し、真空グリースチャンバに氷冷骨髄バッファーを充填します。白モリリンパ節にアクセスするには、まっすぐで細かいはさみを使用して安楽死させたレシピエント動物の膝の下の皮膚を切開し、ハムストリングラインに沿って切り傷を股関節までほぼ伸ばします。デュモン番号5またはナンバー7鉗子を使用して、皮膚の露出したフラップのそれぞれを外側に引っ張ってポ窩の組織を露出させ、鉗子を使用して窩のちょうど内側の窩を慎重にポッテリン静脈に入れる。脚の軸に沿って鉗子を開閉して、親指と人差し指を使用して前側から膝に四頭筋をつまむ前に、下の方の頭突起リンパ節を露出させ、リンパ節をフォッサから飛び出す。リンパ節の下に鉗子をスライドさせて、周囲の組織からノードを解放し、真空グリースチャンバーに置きます。2番目のリンパ節が採取されたら、2つ目のカバースリップを真空グリースリムに置き、静かに押し下げてチャンバーを閉じ、すべての気泡を押し出します。採取した脾臓組織サンプル中の胚中心を特定するには、イメージングチャンバーを2光子蛍光顕微鏡のステージに置き、3.5ミリリットルのプラスチック転写ピペットを使用して、上部カバースリップの上に蒸留水を一滴置きます。接触点まで目的を下げ、透過光を使用して組織の上部に焦点を当てます。ダークモードと2光子励起に切り替え、レーザーを940ナノメートルに調整します。組織の表面近くに染色したCD169によって接する個々の白果円部分を見つけ、中央動脈に関連する第2の高調波発生によってペリアルテラーリンパ部鞘を同定する。周動脈膜リンパ腫鞘と限界領域の間のゾーンでは、高自己蛍光性、活性化された帯状体マクロファージの存在を特定し、これらのランドマークを使用して、単一の胚中心領域の周りに関心のある領域を描きます。その後、深さ100~150マイクロメートルのZスタックを設置し、組織の表面から始まり、約3マイクロメートルのステップサイズを使用してから830ナノメートルの励起波長に切り替えます。検出器の光の損傷を防ぐために、すべてのチャネルを遮断または暗くし、スタックをイメージします。次に、940ナノメートルの励起波長に戻り、チャネルを再び開き、スタックをスキャンして効率的な光活性化と画像スタック全体の光損傷がないことを確認します。混合骨髄キメラの血清型は、564Igiコンパートメントに由来する9D11陽性循環B細胞の低周波で、再構成後6週間で正規化されたB細胞数を明らかにする。全リンパ球ゲート内には、残存レシピエント由来細胞の低周波があり、その約6%がCD45.1由来であり、B細胞区画におけるキメラリズムの全体的な程度が約94%あり、光活性化可能なGFP骨髄由来B細胞の優位性があり、564Igi-Bの重い負選択の結果であった。観察されるように、CD169によるin vivo標識は、限界領域の強い視覚化を容易にする。第2の高調波シグナルは、コラーゲン含有構造元素および主要血管において、動脈周囲リンパ腫鞘の中央動脈および高自己蛍光性の高い、生殖中心活性に関連する活性化された帯状体マクロファージを含む明らかである。これらのデータを組み合わせることで、単一の光活性化可能な発芽中心を含む可能性が高い関心領域の同定が可能になる。下流のフローサイトメトリック評価は、正規化されたB細胞区画数、自発的な発芽中心集団、および光活性化された発芽中心B細胞のサブセットの存在をさらに確認する。十分な細胞生存率を確保するためには、出植、光活性化、および組織処理のステップの総ターンアラウンド時間を4〜6時間に制限することが重要です。この光活性化細胞は、フローソートされ、単一細胞シーケンシングを行い、例えば、単一の胚中心のB細胞受容体レパートリーを特徴付けることができる。混合キメラモデルは、例えば、エピトープ拡散のプロセスがどのように展開するかについての洞察を提供するなど、新しい深さで自己反応性発芽中心生物学の探査を可能にしました。2光子顕微鏡の光源は、目に深刻な損傷を与える可能性のある非常に強力なパルスクラス4レーザーであることに注意してください。

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自己免疫の混合キメラモデルの光活性化によって個々の自己反応性濾胞を尋問

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