Name: 病原性細菌に対する免疫学的応答を評価するための Opsonophagocytic 殺害アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 学ぶ Opsonophagocytic killing assay（OPKA）を用いて、Streptococcus pneumoniaeに対する免疫細胞の貪食活性と抗体効果を評価する方法。このアッセイは免疫治療薬の開発において細菌排除能力を測定する金標準です。

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当研究室の OPKA 試金の確立に彼の非常に貴重な援助ありがとう博士月 Nahm (アラバマ大学バーミンガム)。この作品は、FYA を国内機関の健康の付与 1R01AI123383 01A1 によって支えられました。

1. 文化、差別化、および HL ‐ 60 細胞の検証

<ol><li>HL 60 細胞培養媒体 500 mL RPMI L-グルタミンと 50 mL の熱不活化牛胎児血清との構成を準備します。HL ‐ 60 細胞の分化に影響を与える可能性がありますこれとは、抗生物質を追加しないでください。</li>
	<li>伝搬/HL ‐ 60 細胞の維持のため 75 cm2 HL 60 細胞培地 10 mL に 5 x 10 の文化6セルは 37 ° C、5% CO2でフラスコ ベント。最適な細胞濃度を維持するためにセルごとに 3−4 日間の通路します。 注:細胞濃度が 5 × 106/mL を超えない。</li>
	<li>1 mL クライオ チューブに 10% ジメチルスルホキシド (DMSO) HL60 文化メディアで早かった約 1 × 106セル/ml で HL ‐ 60 細胞の株式を働いているを生成します。 注:株式を働いているは-80 ° C で保存されるかもしれないマスター ストック-120 ° C で保存します。</li>
	<li>OPKA の前に 3 日間の無菌フィルター キャップ 75 cm2フラスコで CO2を 37 ° C、5% で養殖の 1.5 倍の 0.6 %n, n-ジメチルホルムアミド (DMF) と HL 60 細胞の培養基の 15 mL の 10 の7セルで HL ‐ 60 細胞を区別するため。</li>
	<li>HL ‐ 60 細胞正常に分化されている生存率および確立された流れ cytometry のプロトコル16,17によるとセル表面のマーカーをテストすることによって OPKA の試金で使用に適していることを確認します。 18,19。分化後 HL ‐ 60 細胞を収穫し、CD71、CD35、アネキシン V propidium ヨウ化物に約 1 × 104細胞蛍光標識抗体/汚れを染色します。 注:分化した細胞は、≥65%、≥55 %cd35 をする必要があります+、および CD71 引時間: 20%+によって決定された確立検証プロトコル14 (図 1)。</li>
</ol>
2. OPKA バッファーおよび試薬の調製

<ol><li>滅菌ゼラチン Ca2 +/Mg2 +、熱不活化牛胎児血清の 5 mL、0.1% の 2.5 mL 滅菌 1 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 42.5 mL を混合することによって滅菌オプソニン化バッファー B (OBB) の 50 mL を準備します。4 ° C でのストア</li>
	<li>赤ちゃんウサギの補数を取得し、-80 ° C で保存</li>
	<li>取得または細菌の培養皿 (すなわち、15 × 100 mm2 5% 羊血液寒天培地プレート) を準備します。</li>
</ol>
3. 細菌の在庫の準備をサンプルします。

<ol><li>テストする細菌の系統の株式を取得します。 注:このプロトコルでは、血清型の肺炎球菌3 (WU2、博士月 Nahm が提供する豊富) を使用します。</li>
	<li>約 2−4 37 ° C で h を適切なスープ (すなわち、トッド ・ ヒューイット スープ + この WU2 株の 0.5% 酵母エキス) の細菌株を成長します。 注:600 の光学濃度 0.6、0.8 の間文化の nm (外径600) 必要があります。</li>
	<li>2 分間 6,000 × gで遠心分離によって細菌をペレットし、適切なスープで 15% のグリセロールの 10−30 mL の細胞を再懸濁します。因数滅菌 1.5 mL 遠心チューブにストア-80 ° C で培養 (因数あたり 500 μ L)</li>
	<li>37 ° C の水浴中細菌の在庫の 1 つのバイアルを解凍します。細菌細胞のペレットし、無菌条件下で OBB の 500 μ L で再懸濁します。</li>
	<li>OBB (すなわち、10 μ L の希釈、1:10 の 10 μ、10 μ L の 1: 100 など) で細菌の在庫の異なる希釈液を準備します。未処理の細菌の在庫の様々 な希釈液を使用して下記のとおり OPKA の試金 (セクション 4-6 HL-60/補完共培養を含む) を実行します。一晩で 30 ° C (CO2) 板の文化. 注:温度 30 ° C; 増殖を防ぐために WU2 に固有のものその他の系統/血清型は 37 ° C で最適な成長可能性があります。</li>
	<li>HL ‐ 60 細胞や補体と共培養未処理の細菌の在庫の各希釈のコロニーをカウントします。細菌のどの希釈生成可算コロニー (HL ‐ 60 細胞と共培養未処理の細菌の約 80−120 CFUs) の最適な数を決定します。この細菌の在庫を含む将来の OPKAs のこの希釈に注意してください。</li>
</ol>
4. 細菌治療と文化

<ol><li>3.3 準備した細菌の在庫の 1 つの管を解凍します。細菌 (6,000 x gを 2 分間) をペレットし、3.6 の手順で決定したとおり最適な希釈で OBB で細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>丸底 96 ウェル細胞培養プレートのウェルあたりの再懸濁の細菌希釈の 10 μ L をピペットします。</li>
	<li>複製の実験も適切な抗体や薬物治療の 20 μ L を追加します。 注:このプロトコルでは、マウスで生成された血清型特異的抗体が治療 X として追加され、血清型 3 多糖類のカプセルを低下させる知られている配糖体の加水分解酵素酵素は Y (図 2)4,20治療として追加されます。コントロールの井戸、井戸をトリートメントに使用するバッファーによって PBS または OBB、× 1 を使用します。</li>
	<li>サンプル プレートは、室温で 1 時間約 90 rpm で横に振る。最適温度に応じてこれらの条件またはテストされている治療法の振動条件を調整します。</li>
</ol>
5. HL 60 細菌培養

<ol><li>HL ‐ 60 細胞を準備するには、15 mL の円錐管に DMF で 3 日前に (手順 1.4 参照) を治療している区別 HL ‐ 60 細胞を収穫します。Cells (500 × g, 3 分) をペレット、上澄みを廃棄し、少なくとも 10 mL の 1x PBS で洗浄します。</li>
	<li>ペレット洗浄セル (500 × g、3 分)、上澄みを廃棄し、OBB の細胞を再懸濁します (1 ml OBB 開始し、細胞数後 1 x 107/mL の最終濃度の調整)。</li>
	<li>1:5 の最終巻で赤ちゃんウサギ補完 (滅菌、原液の赤ちゃんウサギ血清、年齢 3−4 週間) を追加します。 注:HL 60 補完混合物の最終濃度は、1 x 107/mL をする必要があります。補完の熱不活化とアクティブな HL ‐ 60 細胞を含む 2 番目のソリューション可能性があります使用する補体依存関係をテストする場合 (補完で水浴に培養されると不活性化が > 少なくとも 30 分の 55 の ° C)。</li>
	<li>1 h の細菌培養が完了 (手順 4.4) と、2 つのグループ (すなわち、使用のみ 20 μ L ピペット誤差を考慮する元 30 μ L 培養) の重複する井戸に各サンプル (すなわち、2 つの新しい井戸にも各 30 μ L のサンプルの 10 μ L) を分割します。: 1 セットは HL 60 補数との共培養になり、1 つ細菌のみが含まれます。井戸の各実験セット (ステップ 5.3) から HL 60 補完混合物の 50 μ L を追加 (委任された + HL 60);細菌のみ (代理 -HL-60) の井戸に単独で OBB の 50 μ L を追加します。 注:この例では、約 800 の細菌 CFUs は 5 x 10550 μ L HL ‐ 60 細胞の初期培養に使用されます。感染症の多様性が高すぎるか低すぎる最終コロニー数によって示されるように場合、は、HL 60 細胞の数ではなく初期の細菌の希釈を調整します。</li>
	<li>96 ウェル プレートは、1 h (CO2) 37 ° C で横に振る。</li>
</ol>
6. サンプルめっきと一晩インキュベート

<ol><li>OBB でもそれぞれ 1:5 を希釈すると、各サンプルは、少なくとも 50 μ L のボリュームを持っています。</li>
	<li>サンプル間の十分な間隔を確保する細菌培養プレートの指定された領域に直接各サンプルの 50 μ L をピペットします。15 × 100 mm2の寒天版、1 つのプレートにピペットで移しなさい約 4 サンプルのラウンドします。</li>
	<li>カバーし、室温で約 15 分間乾燥するサンプルを許可します。</li>
	<li>プレートと一晩で 30 ° C (CO2) 文化を反転します。また、文化プレート嫌気細菌の成長に影響するかどうかをテストするのには嫌気性の瓶または形態の制御に。</li>
	<li>一晩培養後各指定サンプル領域のコロニーをカウントします。それぞれに対応するコントロールおよび/またはサンプル HL 60 細胞共培養を受信しない設定の生きているセルの数を比較することによってデータを分析 (0% 100% 細胞の存続を示すセル殺害)。</li>
</ol>

<ol><li>Romero-Steiner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+an+opsonophagocytic+assay+for+the+measurement+of+functional+antibody+activity+against+Streptococcus+pneumoniae+using+differentiated+HL-60+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).</li>
<li>Nanra, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsular+polysaccharides+are+an+important+immune+evasion+mechanism+for+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+and+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus.</a> Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).</li>
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</ol>

著者が明らかに何もありません。

OPKAs は、予防接種6,8抗体による免疫反応を評価する上で重要な役割を果たします。この簡略化された OPKA の主要な意義はテストされる条件の適応性 (すなわち、抗体、酵素治療、等)。この意味で、このアッセイは、貪食、オプソニン (すなわち、抗体) の貢献をテストする使用できますがそれも使えます通常貪食経路を阻害する病原因子 (すなわち、莢膜多糖類) を克服する方法を評価します。潜在的多重 OPKA で使用される通常の手順の数を最小限に抑える実験の結果に影響を与えることができる、トラブルシューティングや使用可能なデータを取得するための最適化の量を減らす技術的なエラーの可能性を最小限に抑えます。このプロトコルは、処理条件のバリエーションに適していますと汎用性の偉大な取引が可能です。
HL 60 の文化と細菌の在庫の確立を通じてアッセイを予め、OPKA を実行するとき、余分な最適化の手順を防ぐために重要です。時間はすべての試薬を確認し専用する必要があり、細胞の種類は...

試金 (OPKA) を殺す opsonophagocytic は細菌の構造や機能の変化を免疫反応と機能の後の変化にリンクするための重要なツールです。など、それは頻繁に相補的なアッセイとして抗体治療、ワクチン候補、酵素の最適化などの免疫系の有効性を判断する使用されます。細菌の細胞死への免疫の最も基本的なコンポーネントを評価するために、OPKA を使用できます in vivo アッセイは効果的なクリアランスや細菌感染症モデルの保護を確認する必要が、: 細菌、免疫細胞、および実験トリートメント。前の研究は、OPKAs の変更および様々 な細菌と肺炎球菌1、2黄色ブドウ球菌、緑膿菌3を含む血清型に使用できることを示しています。さらに、これらの最適化されたアッセイは細菌を改善するために免疫細胞の補体を介した4と抗体治療をよりアクセシブルにする酵素の機能を含むさまざまな実験的治療法を評価するために使用できます。オプソニン化5。古典的な OPKA のアッセイは正常に基礎および臨床研究で使用されている病原体特異的抗体6,7,8,9による保護のための強力な指標として設定.
免疫細胞の種類は、opsonophagocytic の殺害の評価のために使えます。1 つの一般的に使用される貪食人口は HL 60 ひと白血病細胞株である.この細胞株は文化で不活化前骨髄球として保つことができます。しかし、彼らは、異なる薬物治療10,11を介してさまざまな活性化状態に区別できます。N HL60 の治療、ジメチルホルムアミドは、強い貪食能11活性化好中球に細胞を区別します。HL ‐ 60 細胞に最適化されている、これらの食作用の試金10によく使用されますが、他のプライマリの多形核白血球は免疫実験12の腕として使用できます。
さらに、これらの試簡体字13または14を見てテストする細菌の抗生物質耐性菌の複数を多重化します。多重はより効率的に寒天プレート15スポットあたり単位 (CFUs) を形成する細菌のコロニーを数えることができるソフトウェアの開発を可能にしました。ここでは、1 つの菌株、HL 60 細胞、赤ちゃんウサギ補完、血液寒天培地プレートを使用して合理化された手法について述べる。この方法では、複数の治療法を特定細菌感染に対する自然免疫応答を変調することができますどのように疑問に対処するため迅速に評価できます。

<table><tbody><tr><td>アネキシンV(APC標識)</td><td>BioLegend</td><td>640919</td><td></td></tr><tr><td>抗CD35、ヒト(PE標識)</td><td>BioLegend</td><td>333405</td><td></td></tr><tr><td>抗CD71、ヒト(PE標識)</td><td>BioLegend</td><td>334105</td><td></td></tr><tr><td>使用する細菌株(すなわち、Streptococcus pneumoniae, WU2)</td><td>細菌呼吸器参照研究室(Dr. Moon Nahm)&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血液寒天プレート</td><td>ハーディ 診断</td><td>A10</td><td></td></tr><tr><td>胎児クローン 血清</td><td>HyClone</td><td>SH30080.03</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma</td><td>G9012-1L</td><td></td></tr><tr><td>HL-60 細胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-240</td><td></td></tr><tr><td>IgG アイソタイプコントロール (PE 共役)</td><td>BioLegend</td><td>400907</td><td></td></tr><tr><td>N,N-ジメチルホルムアミド (DMF)</td><td>フィッシャーL</td><td></td>-グルタミンCorning 10-040-CVが付いている化学UN2265<td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウムのヨウ化プロピジウム</td><td>ΣP4864</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI媒体</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

病原性細菌に対する免疫学的応答を評価するための opsonophagocytic 殺害アッセイ

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

ホストの細菌の定着に対する免疫応答の重要な側面は、貪食能です。Opsonophagocytic 殺害アッセイ (OPKA) は、貪食細胞が細菌の単位との共培養実験手順です。免疫細胞が貪食し、補体依存的に細菌文化を殺します。免疫細胞の殺害の効率はいくつかの要因に依存して、どのように異なる細菌を決定する使用ことができます細胞死への抵抗についての文化を比較します。この方法では、血清型および/または特定の菌株に対して潜在的な免疫治療の有効性を評価できます。このプロトコルでは基本的な培養条件と細胞治療条件および HL 60 免疫細胞との共培養後細菌の細胞の生存率を決定するカウントを利用して簡易 OPKA をについて説明します。このメソッドは、正常に数の異なる肺炎球菌血清型、被膜と acapsular 株と他の細菌種に利用されています。この OPKA プロトコルの利点は、そのシンプルさ、汎用性 (このアッセイは、オプソニンとして抗体治療に限定されない)、時間および基本的な実験グループを評価するために試薬の最小化。

HL 60 分化の検証が、OPKA を開始する前に実行する必要があります。フローサイトメトリーを使用して細胞外アネキシン V (図 1)、CD71、CD35 CD11b 発現を決定するこの行うことができます。Propidium ヨウ化は生存率のマーカーとしても使用できます。CD35 発現の増加 3 日間 DMF で治療された後 (すべてのセルの ≥55%) CD71 の式を減少する必要があります (すべてのセルの引時間: 20%)。アネキシン V + と一緒に propidium ヨウ化 (π +) 細胞の割合にする必要があります &lt; 十分なことを確認する 35% 細胞生存率。これらのパーセンテージは、最小要件を満たしていない場合の議論で説明されているよう培養条件を調整する必要があります。
6.5 のステップから得られる CFUs の数は、図 2に示すように、コントロール群 (100% 細胞生存率) と比較して異なるグループの細菌の細胞生存率を比較する使用で...

この opsonophagocytic 殺害の試金を使用してに対応し、さまざまな治療法や条件に基づいている細菌を殺す免疫細胞の貪食能力を比較します。クラシック、この試金はオプソニンとして細菌に対する抗体のエフェクターの機能を評価するためのゴールド スタンダードとして提供しています。

病原性細菌に対する免疫学的応答を評価するための Opsonophagocytic 殺害アッセイ

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

このアッセイは、細菌構造および機能の調節を免疫細胞ベースの抗菌活性に結びつける。したがって、潜在的な治療の主要な免疫療法は、改善された細菌クリアランスの可能性を決定する際に評価することができる。眼球細胞性殺死アッセイは、伝統的に、細菌に対して提起された抗体の有効な機能を鈍化として評価するためのゴールドスタンダードとして機能する。このプロトコルは、既存の高スループットの標準化アッセイに対して、シンプルさと汎用性を提供します。このプロトコルでは、レンサ球菌肺炎に対する薬物治療の効果と、これらの効果が細菌の改善された食作用にどのように影響するかを調べる。ここでは、肺炎球菌にOPKAを適用する。しかし、このプロトコルは、免疫細胞による他の病原体の貪食性の殺害を評価するために採用することができる。細菌ストックを最適化し、カウントされる最終的なCFUsが最適な範囲内に収まるようにするために時間を捧げます。HL60細胞が生存可能で活性であることを保証するためにフローサイトメトリーを使用し、機能的に活性な細胞を確保するために異なる培養条件を試すことを強くお勧めします。視覚的なデモンストレーションでは、サンプルのメッキ方法と計数可能なサンプルの達成方法について、より深く理解できます。始めるには、L-グルタミンと15ミリリットルの熱不活化牛胎児血清を補充した500ミリリットルRPMIで構成されるHL60細胞培養培地を調製する。HL60細胞の増殖および維持のために、HL60細胞培養培地の10ミリリットルの500万個の細胞を摂氏37度および5%の二酸化炭素で75平方センチメートルのベントフラスコで培養する。HL60細胞の作業ストックを生成するには、HL60培養培地に1ミリリットル当たり約100万個の細胞を1ミリリットルの極低温チューブに10%ジメチルスルホキシドを添加した。HL60細胞を分化するために、培養1.5回10〜15ミリリットルのHL60細胞培養培地中の7細胞を、無菌フィルターで0.6%DMFを補い、75平方センチメートルのフラスコを摂氏37度、OPKAの3日前に5%の二酸化炭素を上限とした。細菌ストックサンプルを調製するには、WU2細菌株を37°Cで約2〜4時間適切なスープで成長させます。次に、6000回Gで2分間遠心分離して細菌をペレット化し、適切なスープ中の15%グリセロールの10〜30ミリリットルで細胞を再懸濁する。細菌培養物を無菌1.5ミリリットルの遠心分離チューブにアリコートし、摂氏80度で貯蔵する。次に、37°Cの水浴で細菌ストックの1バイアルを解凍します。細菌細胞をペレットにし、無菌条件下で500マイクロリットルのOBBで再懸濁した。血液寒天プレート上の未処理の細菌ストックのプレート希釈および30°Cで一晩プレートを培養する。インキュベーションステップの後、

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

我々は、蛍光抗原をコーティングしたビーズと標準化で複数のFc受容体は、提供する受容体の使用量と貪食能の測定を表す単球細胞株を利用し、臨床検体から抗原特異的抗体の食作用活性を決定するためにハイスループットフローサイトメトリーアッセイを提示し、興味のある任意の抗原のための再現可能なファッション。...

臨床抗体サンプルの貪食活性を決定する

出典: Nagre, N. ほか。 マウスにおける肺胞マクロファージの食いと細菌の除去。 J. Vis. Exp.

オプソナイズド赤血球を用いた補体媒介食噬のモデル化

出典: セマン、B. G.、 et.al。グラム陰性細菌敗血症の新生児イメージングモデル。 J. Vis. Exp.

新生マウス脾臓食細胞による細菌死のin vitro評価

このビデオは、血清中に存在する抗体の補体媒介性殺菌活性を評価する技術を示しています。このアプローチは、単離された血清を病原性細菌および外因性補体タンパク質と組み合わせます。インキュベーション後、細菌を寒天プレート上で増殖させ、産生されたコロニーを定量して血清殺菌力価を測定します。...

抗体の補体媒介性殺菌活性に関する血清殺菌アッセイ

このビデオでは、フローサイトメトリーを使用して、食作用後のヒト好中球に対する毒性のある黄色ブドウ球菌および毒性の低い黄色ブドウ球菌株の細胞毒性を検出するアッセイを実演しています。...

食作用後の好中球に対する黄色ブドウ球菌株の細胞毒性アッセイ

ビデオは、ヒト好中球と肺炎連鎖球菌の共培養を使用したin...

細菌性病原体に対するオプソノファゴサイトーの殺傷活性の評価

このビデオでは、オプソノバクテリアと免疫細胞との相互作用を調べるためのオプソノアドヒアランスアッセイを実演しています。蛍光標識細菌を抗カプセル抗体を含む試験血清で処理し、マクロファージとインキュベートします。マクロファージを蛍光染色した後、マクロファージ表面に付着した細菌を顕微鏡で観察し、可視化します。...

抗カプセル抗体によるカプセル化細菌のオプソニン化を評価するためのオプソノアドヒアランスアッセイ

ここでは、ホストとしてD. キイロタマホコリカビ(アメーバ) を用いた浮遊性や表面に接続された細菌の病原性を測定するためのプロトコルを提案する.1 時間の期間にわたって病原性を測定し、ホストを殺すは、蛍光顕微鏡、画像解析を用いた定量化されます。緑膿菌を使用してこのプロトコルを示す.

アメーバを用いた急速なイメージに基づく細菌の病原性試験

ここで生体内でワクチンの評価のためのエレガントなプロトコルの有効性と宿主免疫応答を提示します。このプロトコルは、ウイルス、細菌、ワクチンのモデルまたは寄生病原体に対する適応ことができます。...

宿主-病原体応答とマウスでワクチンの有効性の評価

血清中の抗体のShigellacidal活性を測定するためのプロトコルをご紹介します。血清は細菌培養、外因性の補足物と混合され、寒天版で反応混合物をメッキします。細菌はカウント、自動コロニー列挙子を使用して、殺菌力価を決定するために使用のコロニーを形成します。...

高スループット赤痢菌-特定の殺菌試験

オソノ付着アッセイは、ワクチン開発における抗体のオプソニック機能を評価するオソノ貪食性殺死アッセイの代替方法である。...

細菌性アン トラシス および他のカプセル化病原体に対するワクチン開発における機能性抗体を評価するオソノ付着アッセイ

学ぶ Opsonophagocytic killing assay（OPKA）を用いて、Streptococcus pneumoniaeに対する免疫細胞の貪食活性と抗体効果を評価する方法。このアッセイは免疫治療薬の開発において細菌排除能力を測定する金標準です。

病原性細菌に対する免疫学的応答を評価するための Opsonophagocytic 殺害アッセイ

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