溶媒クリア脳組織における狂犬病ウイルス感染の高解像度3Dイメージング

このプロトコルは、ウイルス感染の可視化を可能にし、感染環境とその周囲の細胞のコンテキストの時空間的な解決に深い洞察を提供します。深部組織イメージングへの免疫染色の適用性は、ウイルスの検出を可能にするだけでなく、実際にそれぞれの細胞マーカーを用いて様々な細胞亜集団の分化を可能にする。免疫染色のための組織を固定するには、脳サンプルをPBSの4%パラホルムアルデヒドの1〜10の比率に入れ、4°Cで少なくとも48時間組織体積をサンプリングする。

固定期間の終わりに、4°CでPBSの02%ナトリウムアジドにサンプルを移す前に、洗浄ごとに少なくとも30分間PBSで組織サンプルを3回洗浄します。その後、0.3〜0.5ミリメートル/秒のブレード供給速度に設定されたビブラートメを使用して、組織を1ミリメートルの厚いセクションに切り離します。新鮮な02%ナトリウムアジドで4度のPBSでセクションを保存します。

メタノール前処理の場合、穏やかな振動で室温でインキュベーションごとに1時間示されるように、上昇メタノールシリーズにサンプルを浸します。最後のインキュベーションの後、サンプルを摂氏4度に冷却します。100%メタノールを4ミリリットルの冷やした漂白液に置き換え、摂氏4度で一晩インキュベーションします。

翌朝、漂白液を新鮮な80%メタノールの4ミリリットルに置き換え、室温で1時間インキュベーションします。次に、サンプルを示したものと逆にメタノールの降順シリーズに浸し、20%メタノール浸漬後にPBSの4ミリリットルで1時間ずつサンプルを洗浄する。脳組織切片の免疫染色では、PBSで0.2%トリトンX-100の4ミリリットルで1時間サンプルを2回洗浄し、続いて0.2%トリトンX-100、20%ジメチルスルホキシド、および0.3モルグリシンで摂氏37度で2日間パーメアビライゼーションを行う。

4ミリリットルの0.2%トリトンX-100、10%ジメチルスルホキシド、および6%正常血清をPBSで37°Cで2日間ブロックします。ブロッキングインキュベーションの最後に、サンプルを摂氏37度で5日間一次抗体溶液の2ミリリットルで標識し、2日後および1/2日後に抗体溶液をリフレッシュする。次に、PBSで0.2%Tween 20と10マイクログラムの4ミリリットルで1日のサンプルを洗浄し、一日の間に少なくとも4〜5回洗浄バッファーを交換し、最後の洗浄を一晩残します。

翌日、2ミリリットルの二次抗体溶液でサンプルを摂氏37度で5日間インキュベートします。次に、サンプルをPBSで新鮮な0.2%Tween 20と10マイクログラムの新鮮な0.2%Tween 20と10マイクログラムで洗浄します。サンプルの核染色のために、核酸染色TO-PRO-3の4ミリリットルのサンプルを光から保護して5時間インキュベートする。

インキュベーションの終わりに、サンプルを0.2%Tween 20および10マイクログラムでPBSで1ミリリットルヘパリンで洗浄し、続いて浸漬ごとに2時間上昇するtert-ブタノール系列で脱水を行う。90%浸漬後、サンプルを一晩で96%tert-ブタノール溶液に移します。翌朝、サンプルをさらに100%tert-ブタノールでさらに2時間脱水し、調製したばかりのBABB-D15の組織切片を光学的に透明になるまで2〜6時間クリアする。

サンプルは、その取り付けおよびイメージングまで光から保護されたBABB-D15に保存することができます。サンプル取り付け用に、3Dプリンタを使用してイメージングチャンバーと蓋を印刷します。直径30ミリのカバースリップを、シリコンゴムを加硫させた1成分の室温で撮像チャンバーに取り付けます。

同様に、蓋に22ミリメートルのカバースリップを取り付けます。水を濡らした綿棒を使用して、両方のリングに余分なシリコーンゴムを取り除き、ゴムを一晩硬化させます。翌日、サンプルを撮像チャンバーに入れ、蓋を挿入する前に少量のBABB-D15をチャンバに加えます。

皮下注射針を使用して、入口を通してBABB-D15でチャンバーを満たし、シリコンゴムでイメージングチャンバーを密封する前に入口を差し込みます。画像取得を設定するには、使用するフルオロフォアに適したレーザーラインを選択し、各検出器の検出範囲を調整して、チャンネル間の信号の重複を防ぎます。次に、取得パラメータを設定して Z スタックの上下境界を見つけ、イメージ スタックを取得します。

画像スタックの3Dプロジェクションを生成するには、フィジーで画像ファイルを開き、画像カラーチャンネルツールその他とチャンネルを分割して、マージされた画像を個々のチャンネルに分割します。画像の漂白補正の場合、チャンネルごとに[画像調整][ブリーチ補正]を選択し、[単純な比率]を選択します。各チャンネルの明るさとコントラストを調整するには、スライダを使用して、[画像の色] と [チャンネルの結合] を選択します。

[コンポジットを作成]オプションにチェックマークを付けます。画像を RGB 形式に変換し、[イメージ スタック] と [3D プロジェクト] を選択して 3D 投影を生成します。プロジェクション方法として[最も明るい点]を選択し、取得したイメージ スタックの Z ステップ サイズに合わせてスライス間隔を設定します。

最大品質の場合は、回転角度の増分を 1 に設定し、補間を有効にします。必要に応じて、合計回転、透明度のしきい値、不透明度を変更します。次に、3D 投影を tiff ファイル形式と AVI ファイル形式の両方として保存します。

狂犬病ウイルスホスホ蛋白質複合体層の感染した神経細胞の免疫染色を使用して、マウス脳組織サンプルの厚いセクションで可視化することができる。その後、取得した画像スタックのシームレスな3D投影を再構築することができます。画像スタックが獲得される高分解能のため、感染は単一の細胞レベルまで評価することができ、例えば、関心のある細胞内の抗原の豊富さと分布に関する主張を可能にする。

マウスの脳組織に加えて、プロトコルは、他の動物種からの脳組織サンプルに適用することができる。例えば、感染したフェレット脳の異なる区画から得られたセクションは、狂犬病ウイルス感染の様々な程度を明らかにする。アストロサイトはグリアフィブリラリー酸タンパク質の発現を介して分化することができ、一方、神経突起は微小管関連タンパク質II.に特異的に染色することができ、同時に、ウイルスタンパク質は、感染細胞と強調された細胞の部分集団との関係を評価するために共染色することができる。

免疫染色のために目的のタンパク質を検出する抗体の選択は非常に重要です。標準的な免疫組織化学の濃度は、多くの場合、良い出発点であるが、いくつかの抗体は、追加の調整が必要な場合があります。このプロトコルで使用される化学物質の多くは、有害な特性を有する。

ラボコートや手袋など、適切な個人用保護具を着用したヒュームフードでそれぞれの実験を行います。