マウスの外傷性脳損傷後のカエカム微生物叢の変化を調べている
2019年9月19日
ここに提示されるのは、横液パーカッション装置を用いて拡散性外傷性脳損傷を誘導するプロトコルであり、続いて腸内微生物叢分析のためのcaecum含有量の収集である。
脳と腸内微生物叢の間の同時性と線の相互作用は不明のままである。この技術を用いて、マウスにおける外傷性脳損傷後の腸内微生物叢における変化を調べることができる。この手法の主な利点は、比較的シンプルで効率的なことです。
この手順のデモンストレーションは、私の研究室の大学院生であるWendong Youです。外傷性脳損傷誘導については、麻酔をかけマウスのつまみつまみへの応答の欠如を確認し、動物の目に軟膏を適用する。剃った後、サジタル面で頭皮を切開する前に、露出した頭皮の皮膚を70%エタノールで消毒します。
鉗子を使用して、両側の切開を引き込み、骨膜をわずかに分離する。マーカーを使用して、正線から 2 ミリメートル離れた頭蓋骨の右頭頂部に直径 3 ミリメートルの円を描画します。硬膜を傷つけることなく、慎重に頭蓋骨を貫通するために電気ドリルを使用してください。
骨フラップを取り外して3ミリメートルの骨窓を露出させ、開頭術の上にプラスチック損傷カニューレを置きます。歯のアクリルで頭蓋骨にカニューレを固めた後、5ミリリットルの注射器を使用して、泡を避けるために、無菌0.9%正常生理食塩水でカニューレを充填します。オシロスコープとアンプをオンにします。
横流の流体打楽器損傷装置の高圧管に気泡が含まれ、約10個のテストパルスを供給し、安定した信号が出るまで確認します。振り子の開始位置の角度を調整して、約2つの標準雰囲気のパルス強度に達し、損傷カニューレを横流の流体パーカッション傷害装置に接続します。トリガーを引いて振り子を解放し、脳損傷を誘発する。
次に、閉じた流体充填チューブシステム全体を通して、デュラにパルスを送ります。脳損傷の誘導後、カニューレを取り除き、切開を縫合する。その後、マウスを外来になるまで監視付きの加熱パッドにマウスを置き、動物を食物と水へのアドリビタムアクセスで自宅のケージに戻します。
示された実験時に、標準的なプロトコルに従って腸を露出させ、非外傷性鉗子を使用して、他の腸管からカエカムを穏やかに分離する。組織が見つかったら、尖ったはさみでカエカムを切断し、手動で無菌ドレッシングにカエカムの内容物を抽出します。その後、マイクロバイオーム分析までマイナス80°Cの貯蔵のために、1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに内容物を移します。
16S組換えDNAシーケンシングは、外傷性脳損傷の3日後にマウスにおけるカエカム微生物叢の多様性の減少を示し、この図に示されている恥および外傷性脳損傷群のケカム内容物内で最も豊富な分類を有する。さらに、非メトリック、多次元スケーリングは、外傷性脳損傷後のカエカム微生物叢の組成の変化を明らかにする。頭蓋骨を掘削するときには硬膜をそのままに保ち、他の腸管からカエカムを見つけて分離するときに穏やかであることを忘れないでください。
この手順に従って、ヘマトキシリンおよびエオシン染色および分析を行い、外傷性脳損傷後の腸管内の組織学的変化および炎症反応を調べることができる。
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概要
本研究では、マウスにおいて側方流体パーカッション装置を用いてびまん性外傷性脳損傷（TBI）を誘導するプロトコルを提示します。損傷後、分析のために盲腸内容物を採取し、腸内細菌叢の変化を調査します。本アプローチは、脳損傷と腸内細菌叢の組成との間の相互作用を解明することを目的としています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- マイクロバイオーム解析
- 外傷性脳損傷研究
背景
- 脳と腸内細菌叢の関係を理解することは、TBI研究において極めて重要です。
- TBIが腸内細菌叢にどのように影響を与えるかについての現在の知見は限られています。
- モデル生物としてマウスを用いることで、制御された実験条件での検証が可能になります。
研究目的
- TBI（外傷性脳損傷）を誘発し、それに伴う腸内マイクロバイオームの変化を分析するための信頼性の高いプロトコルを開発すること。
- 神経学的損傷と腸内細菌叢の多様性との間の潜在的な相関関係を調査すること。
- TBIが全身の健康およびマイクロバイオームの相互作用に及ぼす影響について知見を提供すること。
使用した方法
- 麻酔下のマウスにTBIを誘発するため、側方流体衝撃装置を使用した。
- 頭蓋骨穿孔およびカニューレ挿入を含む、慎重な外科的手処置を実施した。
- 損傷後、マイクロバイオーム解析のために盲腸内容物を採取し、適切に保存した。
- 微生物相の多様性と組成の変化を決定するため、16S rDNAシーケンシングを用いた。
主な結果
- 分析の結果、TBI後3日以内に盲腸内微生物叢の多様性が低下していることが示された。
- 非計量多次元尺度構成法（NMDS）により、損傷後に微生物叢の組成が有意に変化したことが実証された。
- 本研究は、組織の取り扱いおよび無菌状態の維持において注意が必要であることを強調している。
結論
- 本研究では、外傷性脳損傷（TBI）における腸脳軸を探索するための手法を確立しました。
- TBIが腸内細菌叢を乱す可能性があり、それが回復に影響を及ぼすことが示唆されました。
- 腸脳相互作用に関する知見を深めることで、今後のTBI治療戦略に寄与することが期待されます。
よくある質問
産業界における有用性
本プロトコルは、外傷後におけるマイクロバイオームの変化を評価するための再現性のあるモデルを提供することで、外傷性脳損傷研究におけるマイクロバイオータ-腸-脳軸のメカニズム的なリスク低減を可能にします。神経学的外傷と盲腸マイクロバイオータ組成の定量可能な変動を関連付けることで、ターゲットの検証およびバイオマーカーの探索を支援します。このアプローチは、TBI（外傷性脳損傷）の誘発およびマイクロバイオームサンプリングのワークフローを標準化することにより、前臨床研究における予測の信頼性を向上させます。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲット検証
- 科学的価値：制御されたTBI誘導後の微生物叢の多様性の変化を測定することにより、腸脳軸の仮説の検証を可能にする。
- 実用的価値：実験群全体で一貫した盲腸微生物叢の回収を行うための、標準化された手術およびサンプリング手順を提供する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値：定量的16S rDNAシーケンシング出力を生成し、盲腸サンプルにおける微生物組成の変化をプロファイリングする。
- 運用の価値：腸管標的治療薬のスクリーニングパイプラインに統合可能な、マイクロバイオーム解析の再現性のあるワークフローを確立する。
翻訳・前臨床研究
- 科学的価値： マウスモデルにおいて、TBIの重症度とマイクロバイオームの変化を相関させることで、疾患に関連するシステムモデリングを支援します。
- 運用の価値： 微生物叢の変化を縦断的に追跡することを可能にし、前臨床プログラムにおけるリスク調整後の進展決定に有用な情報を提供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、TBI（外傷性脳損傷）の誘導および腸内細菌叢解析を標準化することで、ターゲットのリスク低減を図り、探索生物学と前臨床検証を橋渡しするものです。
- 探索生物学：制御された損傷およびマイクロバイオームプロファイリングを通じて、微生物叢-腸-脳相互作用に関する仮説検証を促進します。
- スクリーニング：後続の16Sシーケンシングおよび多様性分析に適した、標準化された盲腸微生物叢サンプルを提供します。
- 分析：非計量多次元尺度構成法（NMDS）および多様性指標を用いて、微生物組成の定量的な比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：神経学的損傷モデルをマイクロバイオームバイオマーカーに結びつけ、前臨床段階での連続性を確保します。
- エンタープライズ再利用：神経疾患モデルにおける腸-脳軸調節を研究するための、再利用可能なプラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： TBI後の定量的な微生物叢リードアウトを提供することで、腸脳相関研究におけるメカニズム的な曖昧さを軽減する。
- 運用的価値： 標準化された外科的手法、サンプリング、およびシーケンシングプロトコルを通じて、再現性を確保する。
- 戦略的価値： TBIモデルをマイクロバイオームベースのバイオマーカーシグネチャーに結びつけることで、Go/No-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響： TBIからの回復における腸脳相互作用を標的とした化合物の、リスク調整後の優先順位付けを支援する。
実施上の検討事項
- マウスの外科的手技および無菌的な組織操作に関する専門知識が必要です。
- 側方流体打撃損傷（lateral fluid percussion injury）装置および16S rDNAシーケンシング・インフラへのアクセスに依存します。
- 神経科学グループとマイクロバイオーム解析グループ間でのチーム横断的な標準化が必要です。
- 異なるマウス系統や損傷モデルにおける盲腸サンプリングの適応検討が含まれます。
- 汚染を防止するため、腸管組織の解剖時に無菌操作を行う必要があります。
