Name: マウス卵母細胞における定量化するため、Localize Mrna に単一分子蛍光そのままの交配 (SM 魚) の使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: 学ぶ単一分子RNA-FISH法を用いたマウス卵母細胞におけるmRNAの定量化と局在解析。低変動で再現性の高いデータを得る最適化プロトコルを解説し、発生生物学研究への応用可能性を示します。

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博士ダニエル ・ r ・ ラーソンは、インストールとスポットを見つけると追跡プログラム13の使用と共焦点顕微鏡イメージングのためのネブラスカ大学リンカーン顕微鏡コアの技術的なサポートの彼の寛大な助けを感謝いたします。本研究は、UNL ハッチ資金 (NEB-26-206/受入番号-232435 とくちばし-26-231/受入番号-1013511) によって支えられ、ネブラスカ州農業研究部、リンカーン、ネブラスカの大学の貢献を表します。

動物の手続き、審査し、承認機関動物ケアおよび使用委員会ネブラスカ大学リンカーン校と関連するガイドラインと規制に従ってすべての方法を行った。この研究のため CD 1 ザイモグラム マウス通常齧歯動物の食事、水にアドリブのアクセスしていた彼らは暗い、12:12 で維持された: 光のサイクル。
1. 必要なメディアの準備
<ol><li>基本メディア (OMM)、100 mL の滅菌水に 100 mM の NaCl、KCl 5 mM、0.5 mM KH2PO4、および 1.7 mM CaCl2-2 H2O を追加します。 注: OMM 媒体は 1 ヶ月保存できます。</li>
	<li>完全なメディア (OMOPS)、追加 20 mM 3-morpholinopropane-1-スルホン酸 (モップ)、1.2 mM MgSO4-7 H2O、0.5 mM グルコース, L-乳酸 6 mM 1 mM, gln、タウリン、0.1 mM 1 x 非必須アミノ酸 (NEAA) 0.01 mM エチレンジアミン四酸 (EDTA)、10 μ M の α-リポ酸、10 μ g/mL 原液ゲンタマイシン、21 mM 1 M 水酸化ナトリウム、5 mM NaHCO3、0.2 mM ピルビン酸、クエン酸、0.5 mM を 1:10 に 4 mg/mL FAF BSA オム 100 mL の容量の滅菌水での希釈。0.22 μ M のフィルターで培地を滅菌します。 注: OMOPS は、1 週間まで保存できます。</li>
	<li>開催中 (HM) 5% ウシ胎児血清を OMOPS に追加します。マウスあたり 2 mL HM を作る。</li>
	<li>ヒアルロニダーゼのソリューションは、0.1 mg/1 mL HM にウシ精巣から派生したヒアルロニダーゼの mL を追加します。</li>
	<li>固定バッファーの 10 mL を 0.1% 胚グレード ポリビニルピロリドン (PVP)14と一緒に 1x PBS で 4% パラホルムアルデヒドを組み合わせます。</li>
	<li>50 mL 洗浄バッファー (WB) を準備する追加 0.1% 非イオン性界面活性剤や 0.1 %1 × PBS14する PVP。</li>
	<li>準備 10 mL 透過バッファーに 1 × PBS14に 1% 非イオン界面活性剤を追加します。 メモ: 上記洗浄と透過のバッファーは、市販のキットで独自のバッファーを交換します。</li>
</ol>2. 雌マウス排卵卵子の収集
<ol><li>準備:<ol>
<li>5 IU ひと絨毛性ゴナドトロピン (hCG) 44-48 h に続いて 5 IU 馬絨毛性ゴナドトロピン (eCG) 腹腔内 (IP) 投与による 5-8 週齢の雌マウスを刺激後15,16。</li>
		<li>37 ° C の温暖化のプレートに HM の 2 mL を含む 35 mm のペトリ皿を維持します。1 つ、3 つ、60 mm のペトリ皿にヒアルロニダーゼなし HM 50 μ L 滴続いて希釈ヒアルロニダーゼを含む HM のドロップを 100 μ L のピペットします。37 ° C の温暖化を含む滴使用する前にプレート板を配置します。 注: ヒアルロニダーゼの滴は、蒸発とヒアルロニダーゼの有無に HM の成分濃度を防ぐために卵管の各ペアの郭清の直前に提示しなければなりません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>マウス、hCG の IP 投与後 16 時間を安楽死させる、頚部転位続いてイソフルランの過剰摂取を使用します。</li>
	<li>70% のエタノールを使用してマウスをクリーニングします。腹腔内を公開し、女性の生殖器官を視覚化します。鉗子で卵巣を押し子宮靭帯と卵巣から余分な脂肪を削除します。子宮から卵管をカットし、35 mm ディッシュで温かみのある HM で卵巣卵管のペアを配置します。</li>
	<li>卵巣とその周囲の脂肪組織を削除します。1/2 インチ 27 ゲージ針を使用して卵管の腫れの乳頭を引き裂きます。涙のサイトで卵管を押し、卵丘細胞卵母細胞複合体 (Coc) が追放されます。中期口ピペット (図 2) を使用するヒアルロニダーゼと HM メディアを含む 100 μ L ドロップする減数分裂 II (MII) であると推定されている排卵卵子を転送します。</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59414/59414fig2.jpg"> 図 2: 卵の転送に使用口 pipettor の部分。(A)口ピース(B) 0.22 um、4 ミリメートル フィルター (C)吸引チューブ(D) 1000 μ L ピペット チップ(E) 9"パスツール ピペットで移しなさい。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59414/59414fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<ol start="5"><li>卵丘細胞を除去するため口ピペットと HM を含むヒアルロニダーゼで MII 卵子卵丘細胞複合体を上下にピペットします。各卵を転送、一度洗浄に卵丘細胞に欠けているドロップのみ口のピペットを使用して含んでいる HM。各洗浄液滴のこの手順を繰り返します。断片化または透明な卵15を転送しないでください。 注: として可能な限りほとんどの HM と 35 mm ディッシュの各ドロップから卵子を転送することが重要です。これはプロトコルに送金するたびに当てはまります。MII 卵子は、1 分以上の HM 媒体を含むヒアルロニダーゼで残す必要はありません。</li>
</ol>3. SM 魚が卵母細胞の染色
<ol><li>500 μ L の固定バッファーを含む 6 ウェル プレートの個々 の井戸の卵母細胞を修正します。20 卵が水没または井戸の少ない。室温で 20 分間インキュベートします。 注: 各 SM 魚染色手順 6 も円錐形のプレートで個々 の井戸の内で発生します。卵母細胞がバッファーに完全に水没したと、バッファー上にない浮動でことを確認します。各ステップは、20 卵母細胞で行われた、または各ウェルで以下にする必要があります。</li>
	<li>洗浄バッファー (WB 1.6 の手順で説明) の 500 μ L に固定の卵を転送で 10 分。2 回を繰り返します。</li>
	<li>室温で 30 分間透過バッファーで卵を孵化させなさい。 注: 手順 1.7 で記述されている透過バッファー妥当性透過バッファーに置き換えられます。<ol>
<li>プローブ セットを収集し、迅速にそれらを遠心機でスピンダウンします。各プローブの 40 ° C の水浴やインキュベーター 10 分セットを温めます。部屋の温度をクールします。 注: この手順は、透過潜伏中に実行する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>室温で 10 分間の WB の 500 μ L で卵母細胞を洗浄します。</li>
	<li>プロテアーゼ III のバッファー (キットから使用可能)、室温で 30 分間 1x PBS で希釈 1:8 の 80 μ L に卵子を転送します。 注: 80 μ L のボリュームは十分に 6 ウェル プレートで個々 の井戸の底をカバーしています。</li>
	<li>室温で 10 分間の WB の 500 μ L で卵母細胞を洗浄します。</li>
	<li>Nanog、Pou5f1、 DapB (ネガティブ コントロール遺伝子) に温めたプローブ セットを希釈, 1:50 プローブ希釈液で。40 ° C で 2 時間インキュベートするトラン スクリプト固有のプローブの 80 μ L の卵母細胞 注: 独自のプローブ セット (C1、C2、および C3) 3 つの蛍光チャネルの 1 つで利用可能です。NanogおよびPou5f1プローブはそれぞれ C2 と C3 は、タグ付けされました。</li>
	<li>独自のアンプ 1 (アンプ 1) アンプ 2 (AMP2) 増幅器 3 (AMP3) と常温 4-蛍光増幅器 (アンプ 4-フロリダ州) を温めます。 注: 2 時間トラン スクリプト固有プローブ潜伏中にこの手順を実行する必要があります。</li>
	<li>WB の 500 μ L に卵子を転送し、室温で 10 分間インキュベートします。</li>
	<li>増幅バッファーの順番で卵を孵化させなさい。<ol>
<li>30 分間の室温で 10 分間の WB の 500 μ L に 40 ° c. 転送卵子 AMP1 を 80 μ l 添加の卵を孵化させなさい。</li>
		<li>40 ° C で 15 分間 AMP2 を 80 μ l 添加の卵を孵化させなさい卵を室温で 10 分間の WB の 500 μ L に転送します。</li>
		<li>40 ° C で 30 分間 AMP3 を 80 μ l 添加の卵を孵化させなさい卵を室温で 10 分間の WB の 500 μ L に転送します。 メモ: アンプ FL 蛍光体が含まれるために、暗闇の中でプロトコルの残りの部分は実行されます。解剖顕微鏡の下で作業する場合は、可能な限り光を減らします。</li>
		<li>40 ° C で 15 分間 AMP4 fl 80 μ L に卵を追加します。 注: AMP4 フロリダとして提供されます代替バッファー A (alt キー-A)、Alt B または Alt Cにおいて, 発光の波長が必要な依存 AMP4 フロリダ バッファーを選択します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>室温で 10 分間の WB の 500 μ L で卵母細胞を洗浄します。室温で 20 分間 DAPI の 80 μ L で卵を孵化させなさい。室温で 5 分間 WB の 500 μ L で卵母細胞を洗浄します。</li>
	<li>試薬に泡を追加することがなくスライドの中央にフェージング マウント メディアの 12 μ L をピペットします。メディアをマウントにできるだけ小さな WB として卵を転送し、観察を適用します。<ol>
<li>傾斜角度で coverslip とゆっくりと静かにスライドに液体かぶせます。卵母細胞と気泡の導入の歪みを防ぐためにあまりにもハード、coverslip を押すことは避けてください。</li>
		<li>室温で一晩乾燥して暗いボックスで、スライドを保存します。Coverslip を密封するための明確なマニキュアのスライドのエッジをコートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>標準的な顕微鏡を使用して、永続的なマーカー スライドやサークルの卵を見つけます。 注: この手順は必須ではありませんが、スライドの位置卵母細胞を改善します。最高の結果を得るには、衰退する蛍光信号として 1 〜 5 日内のイメージのスライドが始まります。</li>
</ol>4. 画像処理
<ol><li>Z ステップ共焦点顕微鏡を用いた 3 次元の卵を画像します。 注: イメージを的確に分析、各 z ステップは 1.0 μ m/スライスをする必要があります。</li>
	<li>圧縮 nd2 または個々 の共焦点画像を保存します。各卵子の TIFF ファイルです。両方のイメージの種類は、オープン ソースの画像処理プログラム、フィジーと互換性が。</li>
	<li>ダウンロードし、オープン アクセス フィジー ソフトウェア (https://imagej.net/Fiji/Downloads) をインストールします。<ol>
<li>フィジーに nd2 ファイルをドラッグし、 hyperstackを選択します。場合は共焦点画像として保存されています。TIFF ファイルは、4.4 のステップに進みます。 注: フィジーに nd2 ファイルをドロップするとき hyperstack ドロップダウンが表示されます自動的に。</li>
		<li>[イメージ] タブをクリックして、色を選択し、nd2 ファイルの蛍光のチャンネルを分離するチャンネルの分割] をクリックします。</li>
		<li>個々 を生成します。各蛍光チャネルにおける卵母細胞のそれぞれの z スライスの TIFF ファイルです。[イメージ] タブをクリックし、スタック画像にスタックをクリックします。[イメージ] タブをクリックして、種類を選択し、 Rgb各 z スライスを個々 の RGB カラー画像に変換する] をクリックします。 注: RGB カラーは人工に選ばれる各発光波長の希望することができます。</li>
		<li>各変換された画像を保存します。TIFF ファイルです。ステッチ (ステップ 4.3) の間に混乱を避けるために新しいフォルダーに蛍光チャネルごとに 1 つの卵からイメージを配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>それぞれを正規化します。TIFF イメージPou5f1のNanog陰性対照画像 (DapB) を用いたします。 メモ: 写真編集プログラムを使用して、正規化は実行されます。各コントロールのイメージから背景の蛍光性の同じレベルを削除することを確認します。</li>
	<li>開いている各を正規化します。各波長における各卵子のすべての z スライスを一緒にステッチするフィジーの TIFF ファイルです。<ol>
<li>プラグインタブをクリックして、ステッチを選択し、グリッド/コレクション(図 3 a) をクリックします。ドロップダウン ・ メニューとOK をクリックして(図 3 b) から連続する画像を選択します。</li>
		<li>ディレクトリを参照し、すべての 1 つの波長で個々 の卵の z スライス画像を含むフォルダーを選択 (ステップ 4.3.4 参照)。[Ok]をクリックします。</li>
		<li>ステッチの画像の下にあるスライダーを使用する波長に対して適切な色チャネルに移動し画像の種類を選択をクリックして最終的な RGB ステッチ イメージを作成し、 RGB 色をクリックします。 注: このイメージは、蛍光定量ステップ 4.6 以下に記載されているため使用されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ステッチの画像を 32 ビットの最大投影図に変換します。画像をクリックして、タイプを選択し、 32 ビット(図 3) をクリックします。新しいとしてこのイメージを保存します。TIFF ファイルです。</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59414/59414fig3.jpg"> 図 3: 卵母細胞の共焦点 z シリーズ画像のつなぎ合わせ。(A)卵母細胞の合成画像を生成する使用されたフィジーでプラグイン グリッド/コレクション ツールを示すスクリーン ショット。(B)連続画像蛍光重なり順序を使用します。TIFF ファイル合成画像を生成します。(C)合成画像は、32 ビットとして保存されました。TIFF ファイルです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59414/59414fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<ol start="7"><li>ダウンロードし、インストール、スポットを見つけると追跡プログラム13、d. r. ラーソン、国立機関の健康国立がん研究所 (https://ccr.cancer.gov/Laboratory-of-Receptor-Biology-and-Gene-Expression/daniel-r-larson) で探偵のウェブサイトから入手可能であります。ダウンロードして、スポットを見つけると追跡プログラム (http://www.spacewx.com/pdf/idlvm.pdf) を実行するために必要な対話型のデータ言語 (IDL) オペレーティング システムのオープン アクセスの仮想マシンをインストールします。</li>
	<li>スポットを見つけると追跡プログラムで 4.6 (図 4 a) の手順で生成された 32 ビット、ステッチの画像を開きます。Localize ドロップダウンを選択し、 Localize (図 4 b) イメージの数のスポットを計算するをクリックします。 注: カウント各スポットは、個々 の mRNA を表します。バンド パスと光子のしきい値の設定は、(図 4 b) のスクリーン ショットで表示されます。このプロトコルの各閾値設定の既定値が使用されました。肯定的な代表および背景スポット (図 4) を示しています。</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59414/59414fig4.jpg"> 図 4: スポット ・ ファインダーを用いた Mrna の定量化と追跡。(A)個々 の z シリーズ画像が図 3で説明したように一緒にステッチし、投影される 32 ビットの最大値として保存します。TIFF ファイルです。(B)合成画像をスポット検索と追跡に開設ローカライズする輝点 (赤い箱) をカウントする使用されました。バンドのパスと光子のしきい値は、青色のボックスで示されます。(C)青の矢印が指す (しきい値) 肯定的な信号。白い矢印は、しきい値を下回るスポット蛍光を示しています、したがって、カウントされません。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59414/59414fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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著者申告するものがあります。

一連のプロトコル間のマイナーなステップは、成功した蛍光・ Mrna の正確な数を確保します。まず、プロトコルはコレクションおよび卵子の固定後すぐに行う必要があります。PVP が卵母細胞が互いに付着するを防ぐために 4% パラホルムアルデヒド固定バッファーに追加されることに注意してください。コレクションおよび卵子の固定後すぐに実験を行うことが必要だとわかった。任意の遅延は、大いに低い蛍光シグナルの成績証明書の社格になるの結果します。これは RNA の劣化部分で予定です。以上 20 卵母細胞に転勤させる 6 ウェル プレートで 1 つも一度に、それぞれよくする必要があります一度だけ使用します。インキュベーション時間には、各ステップの延長または短縮することがなく正確に従ってください。例外は、洗浄バッファーの手順;卵母細胞は、実験の結果を変更することがなく長時間洗浄バッファーの左することができます。3 つの蛍光チャネル C1、C2、および C3 の SM 魚プローブがあります。多重化のためにチャネルの同じタグを持つプローブを混在させないでください。これは不可能な同じ発光波長のレンダリング解析に蛍光を発するプローブ セットを区別する方法はないだろ...

逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) mRNA 定量の金の標準となっています。2 つの試金、デジタル PCR (dPCR)1および定量的なリアル タイム PCR (qPCR)2現在使用されます。2 つの PCR 技術の dPCR は qPCR 示唆それは単一細胞における mRNA 量測定に使用することができるよりも高い感度です。しかし、私たちの手で各実験サンプルあたり 5 に 10 卵母細胞のプールで低豊富 dPCR 解析は低再現性と高いバリエーション3データを生産しています。これは RNA の抽出および逆のトランスクリプションの効率性に関連する実験的なエラー可能性があります。RNA シーケンスも単一のマウスと人間の卵子4,5を使用して行われています。この手法には、ライブラリを生成可能性が実験群内変動を増加させるために必要な cDNA 増幅手順が必要です。さらに、低豊富な成績証明書を検出できない場合があります。シーケンスの価格は、ここ数年ダウンしている、バイオインフォマティクス解析のコストが高いため法外なコストすることができます。最後に、mRNA の局在は、タンパク質機能6に貢献して空間的変化とダイナミックなプロセスです。そのため、正確かつ再現可能な量的および単一卵母細胞個々 の mRNAs のローカリゼーションを生成する手法を採用に着手しました。
蛍光 in situ ハイブリダイゼーションと結合した分岐 DNA 増幅蛍光信号ではなく、個々 のセル7,8,9の単一の Mrna の増幅の RNA/cDNA 有効に検出します。アッセイは、一連のハイブリダイゼーション、増幅 (分岐 DNA を使用)、および蛍光蛍光信号7を増幅するための手順によって行われます。技術は、特定の mRNA3,8,10を補足 18-25 ベース オリゴヌクレオチド プローブ ペアの結合に始まります。15 ~ 20 プローブ ペアはターゲット トラン スクリプトの各トラン スクリプトの特異性確保のために設計されています。MRNA 固有の交配には分岐の構成を形成する前置増幅器と増幅器のプローブが続きます。約、400 ラベル fluorophores が付いては、各増幅器、蛍光は、個々 の mRNAs (図 1)11の検出の 8000-fold 増加の結果にバインドします。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59414/59414fig1.jpg"> 図 1: SM 魚のプロトコルの概略図。トラン スクリプト特定のプローブの連続交配が枝分かれしたは、DNA 増幅器、蛍光 mRNA を示すターゲットに。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59414/59414fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
個々 のニューロン12及び子宮頚癌におけるひと乳頭腫ウイルス DNA にその場交配 (SM 魚) ローカライズされた β-アクチン Mrna の 1 分子蛍光を使った過去の研究は、ライン7 をセルします。ソフト スポットを見つけると追跡プログラム個々 の点状蛍光信号を識別し、正常に各セル3,13における Mrna の数を定量化するために使用されています。
ニューロン12の mRNA の検出の結果に基づき、我々 は SM 魚、マウス卵子および胚など低豊富な Mrna の転写レベルを量的に便利なツールを証明することを仮定しました。しかし、付着固定細胞用技術に最適化されて、ホルムアルデヒド固定パラフィン包が (FFPE) ティッシュ セクションを埋め込んだ。卵母細胞は、ポリ L リジン コーティングしている場合でも、スライドに従うことはできません。さらに、彼らは体細胞およびティッシュ セクションのセル換散市販キット3で独自のバッファーの一部を受けたときの結果より壊れやすい。これらの課題を克服するために卵母細胞は固定され手動でバッファーの滴間で転送されます。さらに、キットに透過し、洗浄バッファーは、セル換散を減らすために取り替えられました。あらかじめデザインされたプローブは魚キットと一緒にご購入または特定のコピーを要求することができます。独自のプローブ セットは、3 つの蛍光チャンネル (C1、C2、および C3) を可能にする多重化の一つで利用可能です。現在の実験では、マウス卵母細胞がデュアル染色と定量化された C2 Nanogプローブと C3 Pou5f1プローブを使います。これらのプローブは、卵子および胚のNanogおよびPou5f1の報告された式に基づいて選ばれました。交配の手順の最後に、卵母細胞は組織学的のスライド用耐フェード マウント メディアの滴に置かれました。共焦点画像は、個々 の mRNAs を表す点状蛍光信号の数を定量化するために使用されました。定量化、Mrna イメージングも、セルの特定の mRNA の分布を示した他の RNA 定量メソッドもない達成することができます。この手法は、実験群3の重要な違いを識別するために各実験群の卵母細胞の小さい数字の使用を許可する実験群内変動の少ないを持っている証明しました。

<table><tbody><tr><td>(&plusmn;)- アルファ;-リポ酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1395</td><td>アルファ リポ酸</td></tr><tr><td>アルブミン、ウシ血清、低脂肪酸</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>199899</td><td>FAF BSA</td></tr><tr><td>BD 10mL TB シリンジ</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309659</td><td>10 mL シリンジ</td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide ニードル</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305109</td><td>27 1/2 ゲージ針</td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td>CaCl2-2H2O</td></tr><tr><td>クエン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2404</td><td>クエン酸</td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6152</td><td>グルコース</td></tr><tr><td>リン酸</td><td></td><td></td>二ナトリウム <td>Na2HPO4</td></tr><tr><td>イージーグリップ ペトリ皿</td><td>ファルコン コーニング</td><td></td><td>351008 35 mm ディッシュ</td></tr><tr><td>エデテート二ナトリウム</td><td>Avantor</td><td>8994-01</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>エクストラファインボンはさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14084-08</td>ストレート<td>、シャープ/シャープ、非鋸歯状、13mm刃先はさみ</td></tr><tr><td>胎児ウシ血清</td><td>アトランタ生物学的製剤</td><td>S10250FBS</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン試薬溶液</td><td>gibco</td><td>15710-064</td>ゲン<td>タマイシン</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I(100X)</td><td>gibco</td><td>35050-061</td>グル<td>タマックス</td></tr><tr><td>ゴールドシールマイクロスライド</td><td>ゴールドシール</td><td>3039</td><td>25 x 75mm スライド</td></tr><tr><td>ゴナドトロピン、妊娠中の牝馬の血清</td><td>Sigma</td><td>G4877</td><td>eCG</td></tr><tr><td>hCG 組換え</td><td>NHPP</td><td>AFP8456A</td><td>hCG</td></tr><tr><td>ヒアルロニダーゼ、IV-S型から: ウシの精巣から</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3884</td><td>ヒアルロニダーゼ</td></tr><tr><td>ジュエラーズ スタイル 鉗子</td><td>インテグラ</td><td>17-305X</td><td>鉗子 4-3/8"、スタイル5F、ストレート、マイクロファインジョーL</td></tr><tr><td>-(+)-乳酸、遊離酸&nbsp;</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>190228</td><td>L-乳酸</td></tr><tr><td>マグネシウム 硫酸マグネシウム七水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td>MgSO4-7H2O</td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>25-025-CL</td><td>NEAA</td></tr><tr><td>顕微鏡カバー ガラス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-542-C</td><td>25 x 25x 0.15 mm カバースリップ</td></tr><tr><td>Mm-Nanog-O2-C2 RNAscope プローブ</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>501891-C2</td><td>Nanog Probe</td></tr><tr><td>Mm-Pou5f1-O1-C3 RNAscope Probe</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>501611-C3</td><td>Pou5f1 Probe</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3183</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>パラホルムアルデヒド</td></tr><tr><td>PES 0.22 um メンブレン - 滅菌</td><td>Millex-GP</td><td>SLGP033RS</td><td>0.22 um フィルター</td></tr><tr><td>ポリビニルピロリドン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0930</td><td>PVP</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60128</td><td>KCl</td></tr><tr><td>リン酸カリウム 一塩基性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60218</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>Prolong Gold 退色防止試薬</td><td>invitrogen</td><td>P36934</td><td>DAPI RNAscope を使用しない退色防止試薬</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>320858</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>RNAscope FL AMP 1</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>320852</td><td>Amplifier 1</td></tr><tr><td>RNAscope FL AMP 2</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>320853</td><td>Amplifier 2</td></tr><tr><td>RNAscope FL AMP 3</td><td>Advanced細胞診断</td><td>320854</td><td>アンプ 3</td></tr><tr><td>RNAscope FL AMP 4 ALT A</td><td>アドバンスト セル診断</td><td>320855</td><td>アンプ 4 ALT A</td></tr><tr><td>RNAscope FL AMP 4 ALT B</td><td>アドバンスト セル ダイアグノスティック</td>ス <td>320856</td><td>アンプ 4 ALT B</td></tr><tr><td>RNAscope FL AMP 4 ALT C</td><td>アドバンスト セル ダイアグ</td><td>320857</td>アンプ <td>4 ALT C</td></tr><tr><td>RNAscope 蛍光マルチプレックス検出試薬キット</td><td>アドバンストセルダイアグノスティック</td>ス <td>320851</td><td>FISH試薬キット</td></tr><tr><td>RNAscopeプローブ 3プレックスネガティブコントロールプローブ</td><td>アドバンストセルダイアグノスティック</td><td>ス320871</td><td>ネガティブコントロール</td></tr><tr><td>RNAscopeプローブ 3プレックスポジティブコントロール</td><td>アドバンストセルダイアグノスティック</td>ス <td>320881</td><td>ポジティブコントロール</td></tr><tr><td>RNAscopeプローブ希釈液</td><td>アドバンストセル診断</td><td>300041</td><td>プローブ希釈剤</td></tr><tr><td>RNAscopeプロテアーゼIII</td><td>アドバンストセル診断</td><td>322337</td><td>プロテアーゼIII</td></tr><tr><td>RNAscope プロテアーゼIII &IV試薬キット</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>322340</td><td>FISHプロテアーゼキット</td></tr><tr><td>RNAscope Protease IV</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>322336</td><td>Protease IV</td></tr> S<tr><td>/S Needle with Luer Hub 30G</td><td>Component Supply Co.</td><td>NE-301PL-50</td><td>鈍い30ゲージニードル</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td>NaHCO3</td></tr>塩化<tr><td>ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6191</td><td>NaCl</td></tr>水<tr><td>酸化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>306576</td><td>NaOH</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム、>= 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td>ピルビン酸</td></tr><tr><td>溶液6ウェルディッシュ</td><td>Agtechinc</td><td>D18</td><td>6ウェルディッシュ</td></tr><tr><td>タウリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8691</td><td>タウリン</td></tr><tr><td>組織培養ディッシュ</td><td>Falcon Corning</td><td>353002</td><td>60 mmディッシュ</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>Triton X-100</td></tr></tbody></table>

マウス卵母細胞における定量化するため、localize mrna に単一分子蛍光そのままの交配 (sm 魚) の使用

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

デジタルの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (dPCR)、量的、リアルタイム RT-PCR (RT qPCR) RNA シーケンスなど日常的に卵子および胚の mRNA を定量化するために使用する現在の方法。これらの技術を実行するには、単一の卵や胚を使用して、低コピー Mrna は確実に検出されません。この問題を克服するために卵子や胚をプールできる一緒に分析。しかし、これは多くの場合サンプルの中で高い可変性に します。このプロトコルでは、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション (魚) 分岐 DNA 化学を使用しての使用を記述します。この手法は、個々 の細胞における Mrna の空間パターンを識別します。スポットを見つけると追跡コンピューター ソフトウェア技術を結合すると、細胞における Mrna の豊かさも定量化することができます。実験グループ内で減少の変動は, この手法を使用して、および少数の卵子および胚は実験群間に有意差を検出するために必要な。市販の分岐 DNA SM-魚キットは、断面化された組織またはスライド上の付着性のセルの Mrna を検出する最適化されています。しかし、卵子がスライドに効果的に準拠していない、いくつかの試薬キットであった卵母細胞の換散の結果があまりにも厳しかった。この溶解を防ぐためには、魚のキットにいくつかの変更が行われました。具体的には、卵子および胚の蛍光用に設計された卵母細胞透過および洗浄バッファーでは、独自のバッファーが置き換えられます。6 ウェル プレートで透過、洗浄、およびプローブ増幅器と孵化を行ったし、メディアをマウントを使用するプロトコルの最後にスライドに卵が置かれました。卵母細胞の換散特に、市販キットの限界を克服するためには、これらの変更ができた。正確かつ再現性をもって個々 の卵母細胞における Mrna の数をカウントする、コンピューターのソフトウェアを使用しました。一緒に、このプロトコルは PCR とシーケンスは、単一セルの特定のコピーの式を比較する方法を表します。

プロトコルの完了時に結果になります(図 4 aおよび図 5)、ステッチの画像(図 4)、共焦点の z シリーズから個々 の画像と mRNA カウント(図 4 b).多重化が実行されると、2 つの異なる Mrna (図 5)のラベルを示すイメージをマージがまたあるありますが。MRNA のカウントがフィジー (図 3)によって生成されたステッチの画像と点状蛍光スポット スポットを見つけると追跡プログラム(<strong class="xfi...

再現性をもって RNA の単一分子蛍光 in-situ 個々 卵母細胞における Mrna の数字をカウントするには、交配 (RNA 魚) 非付着性のセルの最適化を行った。卵子採取、トラン スクリプトの特定プローブとハイブリダイズし、画像定量化ソフトウェアを用いて定量化します。

マウス卵母細胞における定量化するため、Localize Mrna に単一分子蛍光そのままの交配 (SM 魚) の使用

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

この技術は、局所化だけでなく、個々の卵母細胞および胚における候補mRNAの定量化を可能にする。PCRを含む他のアッセイと比較して、この技術の完成は、低い変動で再現可能なデータをもたらします。この手順をデモンストレーションすることは、私の研究室の大学院生であるケルシー・ティムです。テキストプロトコルに記載されているように、5〜8週齢で必要な物質および雌マウスの調製からこの手順を開始する。70%エタノールを使用してマウスを洗浄してください。腹腔を露出し、女性の生殖管を可視化します。鉗子で卵巣を保持し、卵巣の周りから子宮靭帯および過剰脂肪組織を除去する。子宮から卵管を切ります。次に、卵巣オビダクトペアを35ミリメートル皿に温かく保持する媒体に入れます。卵巣および周囲の脂肪組織を取り除く。半インチ27ゲージ針を使用して、卵管の腫れた腫れを引き裂きます。涙液の部位で卵性を押すと、cumulus細胞卵母細胞複合体が排出されます。口腔管を用いて排卵卵子をヒアルロニダーゼを含む保持媒体を100マイクロリットルに移した。乳雲細胞を外すために、口ピペットで保持媒体を含むヒアルロニダーゼ中の2つの卵母細胞を上下に代謝してピペットする。それらがcumulus細胞を欠いているら、口のピペットを使用して、各卵母細胞を保持媒体のみを含む洗浄液に移す。洗い液滴ごとにこれを繰り返します。断片化または透明な卵母細胞を転送しないでください。SM-FISH染色を行うために、最初に500マイクロリットルの固定バッファーを含む6つのウェルプレートの個々のウェルに卵母細胞を固定します。ウェルに20個以下の卵母細胞を水没する。室温で20分間固定バッファーに卵母細胞をインキュベートします。テキストプロトコルに記載されているように卵母細胞を洗浄した後、室温で30分間パーメレーションバッファーに卵母細胞をインキュベートする。別の洗浄に続いて、卵母細胞を室温で30分間、あらかじめ希釈したプロテアーゼ3バッファーの80マイクロリットルに移します。ナノグ、Pou5f1、およびDapB用の温め合ったプローブセットをプローブ希釈で1~50に希釈します。転写物特異的プローブの80マイクロリットルで、摂氏40度で2時間培養します。卵母細胞がプローブ内にあり、AMP バッファが動く傾向にあります。卵母細胞を緩やかにバッファに押し込んで水没させることが不可欠です。卵母細胞を500マイクロリットルの洗浄バッファーに移し、室温で10分間インキュベートします。さて、卵母細胞を増幅バッファーに順次インキュベートする。まず、80マイクロリットルのAMP1で卵母細胞を摂氏40度で30分間インキュベートする。その後、卵母細胞を室温で10分間洗浄バッファーの500マイクロリットルに移します。次に、80マイクロリットルのAMP2で卵母細胞を摂氏40度で15分間インキュベートする。前のように卵母細胞を洗浄した後、80マイクロリットルのAMP3で卵母細胞を摂氏40度で30分間培養し、最後の洗浄を行います。最後に、80マイクロリットルのAMP4FLに摂氏40度で15分間卵母細胞を加えます。試薬に泡を加えることなく、スライドの中央にアンチフェード実装媒体のピペット12マイクロリットル。できるだけ少ない洗浄バッファーで卵母細胞を取り付け媒体に移します。最後に、カバースリップを適用します。Zステップ共焦点顕微鏡を使用して3次元の卵母細胞を画像化し、テキストプロトコルで説明されているように画像を保存します。ND2ファイルをフィジーにドラッグし、ハイパースタックを選択します。[イメージ]タブをクリックし、[色]を選択して、[チャネルを分割]をクリックして、ND2ファイルの蛍光チャンネルを分離します。各蛍光チャネルの卵母細胞のZスライスごとに個別のTIFFファイルを生成します。これを行うには、[イメージ] タブをクリックし、[スタック] を選択して、[イメージにスタック] をクリックします。次に、[イメージ] タブをクリックし、[種類] を選択して[RGB カラー]をクリックし、各 Z スライスを個々の RGB カラー イメージに変換します。変換された各イメージを TIFF ファイルとして保存します。ステッチ中の混乱を避けるために、蛍光チャネルごとに単一の卵母細胞の画像を新しいフォルダに配置します。テキストプロトコルの説明に従ってファイルを正規化した後、「プラグイン」タブをクリックし、「スティッチング」を選択して「グリッドコレクション」をクリックします。ドロップダウンメニューから[連続画像]を選択し、[はい]をクリックします。ディレクトリを参照し、1 つの波長の個々の卵子のすべての Z スライス イメージを含むフォルダーを選択します。[はい] をクリックします。ステッチされた画像の下部にあるスライダーを、使用する波長に適したカラーチャンネルに移動します。[画像]をクリックし、[種類]を選択して[RGB カラー]をクリックして、最終的な RGB ステッチ画像を作成します。ステッチされた画像を 32 ビットの最大投影画像に変換します。これを行うには、[イメージ] をクリックし、[種類] を選択して 、[32 ビット] をクリックします。このイメージを新しい TIFF ファイルとして保存します。スポット検索およびトラッキング プログラムで、32 ビットステッチ画像を開きます。[ローカライズ] ドロップダウンを選択し、[ローカライズ] をクリックすると、画像内で見つかったスポットの数が計算されます。ここに示されているのは、スポットファインダーとトラッキングを使用した mRNA の定量です。青い矢印は、しきい値を超える正の信号を指します。白い矢印は、しきい値を下回る蛍光スポットを示し、したがってカウントされません。mRNAカウントは、その後、標準データ分析ツールを使用して分析されました。中央Zシリーズ画像の代表的な画像は、Pouf51とNanog用に示されています。メタフェーズ上に整列した染色体のDAPI染色は、2本の紡錘が白色で示されている。このプロトコルで収集されたデータは、メタフェーズ2卵母細胞における775 Pouf51転写物および113ナノグ転写物を示した。重要なことに、DapBプローブで標識された卵母細胞では検出されたスポットはなく、負の対照として役立った。非接着性細胞を使用する場合、SM-FISHキットからプロテアーゼバッファーの最適な希釈を実証的に同定することが重要です。mRNA検出は、1xPBS中の希釈されていないプロテアーゼバッファー濃度およびいくつかの希釈プロテアーゼバッファー濃度の滴定曲線を用いて試験した。このプロトコルで使用されるプロテアーゼ希釈は、2つの卵母細胞の分相中のPouf51 mRNAの平均蛍光発現の最も低い変動を示したため、1〜8であった。標的タンパク質の免疫蛍光を同時に行い、RNA結合タンパク質と共にmRNAを同局化するために行うことができる。RNA結合タンパク質とのmRNAの共存により、研究者は卵母細胞または胚内のmRNAの貯蔵、翻訳、分解を調節するメカニズムを決定することができます。

use-single-molecule-fluorescent-situ-hybridization-sm-fish-to

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

in situハイブリダイゼーション全体のマウントは、発生生物学で最も広く使用されている技術の一つです。ここで、我々は、単一の遺伝子の正確な発現パターンを解析するためと、二つの遺伝子の発現領域の重なりを判定するためのin...

ゼブラフィッシュの全マウント高分解能二重蛍光上皮内ハイブリダイゼーション

このプロトコルは、蛍光を実行するための実験手順を説明...

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em&gt;その場で</emで&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

ここでは、マウス卵母細胞で減数分裂スピンドルアセンブリと組織を評価するために、免疫蛍光分析に続いて、特定のsiRNA媒介mRNAの枯渇のためのプロトコルを提示します。このプロトコルは、転写物のin vitroでの枯渇と異なるスピンドルおよび/ ​​または卵母細胞におけるMTOC関連因子の機能評価に適しています。...

siRNA媒介サイレンシングによるマウス卵母細胞における減数分裂紡錘体の評価

本稿では、蛍光標識 DNA プローブ、エシェリヒア属大腸菌の in situハイブリダイゼーション (smFISH) 実験単一分子蛍光用と個々 のメッセンジャー RNA (mRNA) の成績証明書を表示する方法について説明します。smFISH は、同時検出、ローカリゼーション、および固定の個々 の細胞における mRNA...

単一分子蛍光In Situハイブリダイゼーション実験のため個々 の大腸菌細胞の転写物を自動ラベリング手法

人間の病気に関連する遺伝子の変異は明らかになるを開始するにつれて急速に識別された亜種の生物学的意義を評価するシステムの開発がますます重要になっております。このプロトコルでは、私はマウス卵母細胞を使用して女性の減数分裂の間人間遺伝子の働きを評価する方法について説明します。...

マウス卵母細胞を減数分裂の間に人間の遺伝子の機能を評価するために使用私

この単一分子蛍光その場で交配のプロトコルは、栄養生長と減数分裂中出芽酵母の RNA...

単一分子蛍光In-situハイブリダイゼーション (smFISH) における出芽酵母の栄養増殖と減数分裂

このプロトコルは、mRNA合成および分解のインビボ運動を測定するための一分子蛍光をその場所でのハイブリダイゼーション(smFISH)での適用について説明する。...

Situハイブリダイゼーションにおける2色単分子蛍光を用いた 大腸菌 における空間と時間におけるmRNA運動学の探査

この場合の単一分子RNA蛍光蛍光(smFISH)は、単一細胞レベルで特異的なRNAのレベルおよび局在を正確に定量する方法です。ここでは、特定のRNAの単一細胞定量化のためのウェットベンチ処理、イメージングおよび画像解析のための検証済みのラボプロトコルを報告します。...

単一分子FISHによる転写活性アレスの単一細胞解析

ショウジョウバエ は、筋形成を調節する重要な分子を研究するための確立されたモデルです。しかし、現在の方法では、mRNAの転写動態や合胞体内の空間分布を決定するには不十分です。この制限に対処するために、1分子スケールでのmRNAの検出と定量を可能にするRNA蛍光 in situ ハイブリダイゼーション法を最適化しました。...

ショウジョウバエの1分子スケールでの筋肉転写ダイナミクスの研究

このプロトコルはマウス卵母細胞系の核形そして内部膜のない細胞小器官に対する細胞骨格の物理的な影響を文書化するために実験フレームワークを提供する。このフレームワークは、他の細胞タイプやコンテキストでの使用にも適合させることができます。...

マウス卵母細胞核の細胞骨格に基づく攪拌を空間スケールで捉える

学ぶ単一分子RNA-FISH法を用いたマウス卵母細胞におけるmRNAの定量化と局在解析。低変動で再現性の高いデータを得る最適化プロトコルを解説し、発生生物学研究への応用可能性を示します。

マウス卵母細胞における定量化するため、Localize Mrna に単一分子蛍光そのままの交配 (SM 魚) の使用

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