Name: 直接急速な免疫組織化学試験を用いた狂犬病サーベイランスの強化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 学ぶ直接急速免疫組織化学試験（DRIT）による狂犬病診断法。現場での迅速なサーベイランスを可能にし、約1時間で結果が得られる経済的なツールです。

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我々は、現在または以前に強化された狂犬病の監視サンプルを収集し、狂犬病診断のためのDRITを実施したすべてのUSDA野生生物サービススタッフを認めます。同様に、我々は強化狂犬病監視コレクションで私たちを支援する多くの協力者を認めます。また、DRITの実施に必要な重要な試薬へのアクセスとトレーニングの機会を提供するために、疾病管理予防センターとウィスター研究所に感謝します。さらに、疾病管理予防センターとニューヨーク州保健省のワズワースセンターが提供する確認診断と技術支援に感謝します。商用製品の使用は比較のみを目的としており、推奨を構成するものではありません。

狂犬病診断検査を行う各人は、標準的な曝露前狂犬病ワクチン接種シリーズを受け取り、必要に応じてブースター免疫を伴う定期的な血清抗体評価を受けるべきである。予防接種を受けていない個人は、そのような作業が行われる実験室や領域に入ってはならない。組織およびスライドのすべての操作は、液体をエアロゾル化したり、空気中の粒子を生成しないように行われるべきです。ヒュームフードは必要ありませんが、可能な場合には、臭気、エクトパラサイト、および骨片から余分な保護を提供することができます。手袋や目の保護を含む最小限の個人用保護具は、サンプルの収集とテスト中に常に着用する必要があります。
1. ブレインステムコレクション
<ol><li>死体採取直後に脳幹サンプルを採取するか、死体が後で検査するまで冷凍庫に保管されていることを確認します。動物の死体が凍結されている場合は、収集を容易にするために、脳幹収集の前に周囲温度で解凍します。状況によっては、サンプルは凍結動物から直接採取されます。</li>
	<li>
新たに採取された動物や周囲温度に解凍された動物の場合は、子宮頸椎を検査官に向かってわずかに回転させた平らな表面に動物のスパインを配置します。子宮頸椎の側面に対するアトラント後頭関節を同定する触診。
	<ol>
<li>まだ完全に凍結している死体の場合は、実用的であれば、上記のように動物のスフィンを配置します。のこぎり、ナイフ、骨せん断または同様の機器を使用して、頭部を体から完全に分離します。 注:1回限り使用しないすべての機器は、サンプル間で十分に洗浄する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>メスブレードを使用して、気管および食道を含む筋肉および軟部組織のすべての層を切断し、腹部の側面でアトラント後頭関節のレベルで切開を行う。頸椎椎の前部の側面を近似するまで続けます。凍結組織の場合は、メスブレードを使用して筋肉と軟部組織の残りの層を除去し、前頭骨を露出させます。</li>
	<li>脳幹が見えるまで、動物の頭部をエンドレンジ延長に移動します。メスブレードを使用して、サンプリング用のすべての可視脳幹/中枢神経系(CNS)組織を除去します。凍結サンプルの場合は、メスブレードを使用して、頭蓋骨の内部からできるだけ多くの凍結脳幹/CNS組織を除去します。</li>
	<li>脳幹サンプルを壊れない容器(金属のチントスズ、クライオバイアルなど)に入れ、それに応じてラベルを付けます。</li>
	<li>DRIT試験を介して収集直後に脳幹サンプルを検査し、試験前に最大24時間冷蔵(4°C)、またはサンプル収集後24時間以上の検査が行われるかどうかのテスト時まで凍結(-20°C)を確認してください。</li>
</ol>2. DRIT用材料の準備
<ol><li>
スライド染色皿10枚の設定(図1) 注:染色皿はスライドの完全な浸漬を可能にするのに十分な深さである(直径96のmm、高さ72のmm、深さ42のmm、容積250 mL)。6<ol>
<li>10%リン酸緩衝ホルマリンで皿1を充填します。2 回のテスト実行後または毎週、ホルマリンを交換してください。</li>
		<li>皿2、4、5をリン酸緩衝生理食生を1%の1%の12en-80(TPBS)で満たします。各テストの前に、新鮮な TPBS に置き換えます。</li>
		<li>皿3を3%過酸化水素で満たします。各試験の前に過酸化水素を交換してください。</li>
		<li>皿6、8、9、および10を蒸留水または脱イオン水で充填します。各テストの前に水を交換してください。</li>
		<li>ジルヘマトキシリン製剤で皿7を充填#2蒸留水6で1:1比で希釈した。2 回のテスト実行または毎週のテストの実行後にヘマトキシリンを交換します。. 注:CDC12によって開発された元のDRITプロトコルによると、逆染色が暗すぎる場合、水に対するギルスヘマトキシリンの1:2の比率が使用されてもよい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
アミノエチルカルバゾール(AEC)ストックソリューションの調製
	<ol>
<li>ガラスピペットを使用して、5 mLのN-ジメチルホルミドをガラス容器に入れます。</li>
		<li>3-アミノ-9-エチルカルバゾールの20mg錠剤を1錠加え、完全に溶解するまで振ります。瓶に「AEC在庫」と在庫が作られた日付にラベルを付けます。 注:AECのストックソリューションは、冷凍(4°C)の下で保存し、1〜2ヶ月間使用することができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
AEC作業希釈の準備
	<ol>
<li>15 mL遠心管にアセテートバッファーの7 mLを追加します。</li>
		<li>ガラスピペットを使用して、遠心管にAECストック溶液の0.5 mLを追加します。</li>
		<li>チューブに3%過酸化水素の0.075 mLを追加します。</li>
		<li>0.45 μmのシリンジフィルターを使用して、10 mLシリンジで溶液をろ過します。 注:AECの作業希釈は、2~3時間しか安定しており、各DRIT試験の直前に作成する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 直接急速免疫組織化学試験
<ol><li>
ラベルガラス顕微鏡スライドは、スミアプルーフ、防水、永久インクマーカーを使用して、各標本に固有の番号を持つ。
	<ol>
<li>メスブレードを使用して、容器から脳幹を取り出し、ペーパータオルの上に置きます。2枚目のペーパータオルで過剰な液体、血液、または毛皮をそっとふくらまして、脳幹組織13だけを明らかにする。必要に応じて、脳幹組織を切り取って断面を明らかにする。</li>
		<li>非常に穏やかに脳幹組織の断面に顕微鏡スライドに触れます。横運動なしでいくつかの点で脳幹にスライドをタッチして、脳幹の複数の領域をスライド13に転送できるようにします。細胞の1つまたは2つの層だけが穏やかなタッチで脳組織からスライドに移されることを確認してください。スライドに脳幹組織を貼り付けるために取り付け剤は必要ありません。各 DRIT 実行に正と負の両方のコントロールを含めます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>スライドを室温で約5分間空気乾燥させます。</li>
	<li>スライドを10%バッファリングホルマリンに10分間浸します(皿1)。</li>
	<li>TPBS(皿2)の溶液中のホルマリンとディップリンスからスライドを取り外します。</li>
	<li>スライドを3%過酸化水素に10分間浸します(皿3)。</li>
	<li>過酸化水素からスライドを取り出し、新鮮なTPBS(皿4)で浸す。余分な過酸化水素を除去した後、スライドを新鮮なTPBS(皿5)に入れ、他のスライドがTPBSに浸漬している間、一度に1つのスライドで作業します。</li>
	<li>TPBS(皿5)のスライドを一度に1つずつ取り、余分なバッファーを振り落とし、湿ったペーパータオルの上に置き、「湿度室」の基礎として、ラボのベンチに置きます。ピペットを使用して、CNS組織をカバーするために各スライドに十分な原発抗狂犬病ウイルス抗体をドロップします。湿度室で10分間スライドをインキュベートします(つまり、湿ったペーパータオルの上に置いている間に、ウェルプレートやその他のシンプルなカバーでスライドを覆います)(図2)。</li>
	<li>湿度室からスライドを取り外し、余分なコンジュゲートを振ってブロットし、TPBSのスライドをディップリンスします(皿5で同じTPBSを再利用します)。</li>
	<li>一度に1つのスライドで作業し、他の人がTPBSに浸漬している間 - CNS組織をカバーするのに十分なストレプトアビジンペルオキシダーゼ複合体をドロップするためにピペットを使用してください。室温で10分間湿度室でインキュベートします。</li>
	<li>湿度室からスライドを取り外し、余分な複合体を振ってブロットし、TPBS(皿5)でスライドをすすいでください。</li>
	<li>一度に1つのスライドで作業し、余分なバッファを振り落とし、他の人がTPBSに浸漬したままである間-十分なAECを落とすためにピペットを使用します(準備は上記で説明され、使用する直前に行われるべきです)CNS組織をカバーする必要があります。室温で10分間湿度室でインキュベートします。</li>
	<li>スライドを蒸留水(皿6)で浸す。</li>
	<li>スライドをギルス・ヘマトキシリン(蒸留水で希釈1:1)のカウンターステインに2分間置きます(皿7)。</li>
	<li>すぐに蒸留水(皿8)ですべてのスライドを浸す。毎回淡水で2回繰り返します(皿9と10)。</li>
	<li>一度に1つのスライドで作業し、他の人が蒸留水(皿10)に浸漬したままである間、余分な水を振って消し、カバースリップを貼り付けるために水溶性の取り付け媒体を使用します。</li>
	<li>20倍の目的を持つ小顕微鏡を使用して、スライドを表示し、詳細な検査が必要な場合は40倍の目的を見ます。</li>
</ol>

<ol><li>Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDean%2C+DJ+%22Laboratory+techniques+in+rabies%22">Laboratory techniques in rabies</a>. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. 23, World Health Organization. eds 88-89 (1996).</li>
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<li>Khalid, A., Haque, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKhalid%2C+A+%22Touch+Impression+Cytology+Versus+Frozen+Section+as+Intraoperative+Consultation+Diagnosis%22">Touch Impression Cytology Versus Frozen Section as Intraoperative Consultation Diagnosis</a>. 2, (2004).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

DRITは、分散型実験室エリアで使用できる狂犬病ウイルスの存在を検出するためのフィールドベースの監視に適した柔軟な方法です。トラックのテールゲートなど、フィールドベースの設定で全体のテストを行うことは可能ですが、化学、機器、供給保管の問題により、DRIT専用の小さな室内空間を持つことが理想的です。さらに、適用されるすべての連邦法、州法、および地域の法律の遵守、および化学物質の使用と廃棄に関する規制を考慮する必要があります。現在、USDA WS には 17 の州のサンプルをテストする 15 の DRIT 施設があります。USDA WS DRIT施設は、大学および州の公衆衛生研究所と連携して設立され、より大きな施設内の指定された部屋や、改装され、モバイルテストユニットとして機能するように改造され、改造されたトレーラー内に設置されています。緊急発生時の緊急発生対応の場合、即時のターンアラウンドタイムで強化された狂犬病監視テストが重要です(図5)。
この検査は可変品質の脳幹材料を用いて成功しているが、組織分解のない新鮮な脳幹組織が最適である。分解、乾燥、または液化が起こると、サンプルの品質が低下し、試験は結果を混乱させる可能性のあるより多くの非特異的染色を検出する可能性があります。この観測値は、DFA と DRIT2の間で類似しています。脳幹/CNSは、できるだけ早く収集し、試験まで凍結(-20°C)保存する必要があります。
通常、ほとんどの USDA WS 施設は、DRIT セッション中に 12 ~ 24 スライドを一度に処理します。正と負のコントロールは、テストが成功したことを確認し、テスト スライドで解釈上の質問が発生するかどうかを確認するために、DRIT 実行の各基準点を提供します。サンプルが明確な正または負の結果を持っていると判断されない場合、それは不確定としてラベル付けされ、DRITによって2回目のテストを行います。このサンプルが 2 回の DRIT テストの後に明確な正または負でない場合は、DFA または関連するテストのリファレンス ラボに送信されます。
他の診断テストと同様に、「トラブルシューティング」は予期しない発見に役立ちます。たとえば、DRIT の実行が失敗した場合(つまり、正の対照は+3 または+4 の染色強度と抗原分布を示さない)、すべての化学物質および試薬の有効期限が切れていないことを確認します。新たに開いた過酸化水素のボトルを週に1回以上使用することは、脳組織の酸化による非特異的染色を防ぐのに役立つことがわかった。また、ラベル付けされた有効期限に関係なく、少なくとも年に1回はアセテートバッファーを交換することをお勧めします。
DFAに対するDRITの多くの利点には、低コスト、集中型実験室の外でテストを行う能力、蛍光顕微鏡の代わりに光顕微鏡検査の必要性、および比較的簡単なトレーニングプロセスが含まれ、DRITの多くの利点があります。テスト2、3、4を管理し、読む人々。これらの利点は、DFA2、7、8、9に匹敵するDRITの感度と特異性と相まって、テストが広いスケールで重要なツールとして機能することをすでに証明しています強化狂犬病監視プログラム8、北米で10。さらに、DRITは、特に最近のOIE/WHOガイダンスを推奨テストとして、開発途上国や限られた資源を持つ他の地域で、監視の増加と迅速なテストを可能にする可能性があります。

DFAは、日常的な狂犬病診断1のために最も広く使用されているテストですが、蛍光顕微鏡の購入と維持のコストは、発展途上国2、3、4および広範なに制限することができます。大規模な強化狂犬病監視プログラム3,4 .さらに、DFAは、固定中にサンプルを冷蔵し、抗体抗原反応中に周囲温度以上のサンプルをインキュベートする能力を必要とし、適切なインフラのない国では大きなハードルとなる可能性があります。現代のDFA試験に関連する制限の一部により、狂犬病の世界的な影響は長い間過小評価されてきた5.
この点に関しては、特に開発途上国において、狂犬病の監視を世界的に改善するための追加の診断技術を検証する必要がある。ここで提示されるDRITプロトコルは軽い顕微鏡を使用し、テスト6の間に冷凍か実験室のインキュベーションを要求しないDFAに代わる実験室または分野ベースのテストの代わりを提供する。DRITとDFAは、両方の技術が潜在的に狂犬病の動物から収集された脳サンプルのタッチインプレッションを使用するという点で類似しています。しかし、DRITの最初のステップでは、狂犬病ウイルスを不活性化するサンプルの歴史的固定剤としてホルマリンを使用しています。これは、DFAプロトコル3のサンプルを固定するために使用されるアセトンに対して大幅なバイオセーフティの改善を提供します。現在までに、DRITはDFA2、7、8、9と同等の感度と特異性を示しています。
2005年以来、USDA WSプログラムは、包括的な野生動物狂犬病管理プログラム10の一環としてDRITを使用して、北米で大規模な強化狂犬病監視活動を実施してきました。強化された狂犬病の監視は、暴露ベースの公衆衛生監視とテストの補完として使用され、主に野生動物のメソ肉食動物種、アライグマ(プロシオンローター)、ストライプスカンク(メフィティスメフィティス)、灰色のキツネ(ウロシオン・シネレオアルジェンテウス、赤キツネ(ヴァルペス・ヴァルペス)、コヨーテ(カニス・ラトランス)は、ヒトまたは家畜の暴露に関与していない。テストで使用される動物の死体は、強化された狂犬病の監視努力を通じてUSDA WSに提出され、狂犬病ベクター種で構成されました:病気または奇妙な作用;死体、道路死亡、または迷惑が見つかりました。人間または家畜の暴露とは関連していません。DRITは狂犬病の調査を改善し、公衆衛生診断研究所の財政的負担と負荷を減らすために、研究室の経験がほとんどまたは全く訓練された分野生物学者によって採用することができる狂犬病診断テストを提供します 10.USDA WSフィールド従業員のための基本的なDRITトレーニングは、通常、バイオセーフティの基本的な原則、サンプル収集方法とDRITプロセスの方法、および>8 hをカバーする教室の指導の約4時間を含む1.5から2日かかります。テストを行う実験室の時間。トレーニングの機会は、疾病管理予防センター(CDC)、LYSSA LLC、およびウィスター研究所を通じて、USDA WSおよびプログラム協力者に提供されています。
戦略的管理分野では、USDA WSはDRITを使用して94,000以上の野生生物サンプルをテストし、疑わしい動物の暴露ベースの公衆衛生テストのみに依存して検出されなかった可能性が高い1,850以上の狂犬病のサンプルを検出しました。DRITの結果によって提供される強化された狂犬病の監視データは、米国全体の野生動物のための口腔狂犬病ワクチン接種プログラムをサポートするために、風景上の狂犬病のより完全な時間的および空間的表現を提供するために重要です10, 11.同様に、カナダの州の野生動物機関は、DRITを大規模な野生動物狂犬病の監視活動に組み込み、成功8を持つ公衆衛生プログラムと並行して取り組んでいます。USDA WSとカナダのDRIT監視プログラムの両方が、DFAによって狂犬病を確認し、適切な8としてウイルス変異型タイピングを実行するために、国家参照研究所を使用しています。さらに、USDA WSフィールド生物学者は、DFA確認のための陰性標本の10%を参照ラボに送り、2008年以来、標準の一部としてウィスコンシン州衛生研究所が提供する二年に一度のDRIT能力試験に参加しています。品質保証対策を実施します。
この方法の目的は、分散型の実験室、現場、または電子顕微鏡への日常的なアクセスのない領域で行うことができる狂犬病診断検査のための代替アプローチを提供することです。

<table><tbody><tr><td>3-アミノ-9-エチルカルバゾール (AEC 錠剤; 50 錠)</td><td>Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)</td><td>A6926</td><td></td></tr><tr><td>アセテート緩衝液、0.1M、5.2 pH、32 oz</td><td>Poly Scientific R&D Corp. (https://www.polyrnd.com/)</td><td>s140</td><td></td></tr><tr><td>Ag Tek MiniScalpel, PN110, Non-sterile #10, 40 per package</td><td>Patterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/)</td><td>PN110</td><td>サンプルタッチインプレッションのための補助装置;また、クリッパー配布(http://www.clipperdist.net/)</td></tr><tr><td>BDルアーロック使い捨てシリンジ(針なし)、10 cc</td><td>フィッシャーサイエンティフィック(サーモフィッシャーサイエンティフィック https://www.fishersci.com/us/en/home.html の一部)</td><td>14-823-2A</td><td>BDメーカー番号309604</td></tr><tr><td>サイデントップヘッド付き双眼光学顕微鏡または同等の</td><td>複数のベンダー</td><td></td><td></td></tr>ブルー<tr><td>長方形UN定格廃棄を通じても入手可能コンテナ、5G</td><td>Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)</td><td>1147T01BLU</td><td>化学廃棄物の保管/処分用補助装置(ギルヘマトキシリンおよびAEC溶液)</td></tr><tr><td>コーニングスクエアおよび長方形カバーガラス、24x60</td><td>Fisher Scientific(Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html の一部)</td><td>12-553-465</td><td>コーニング メーカー番号 2975246</td></tr><tr><td>コーニングユニバーサルフィットピペットチップ:ラック付き、非滅菌(1-200ul)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック(サーモフィッシャーサイエンティフィック https://www.fishersci.com/us/en/home.html の一部)</td><td>07-200-300</td>コー<td>ニングメーカー番号4863</td></tr>ファ<tr><td>ルコン15mLコニカル遠心分離チューブ、ポリプロピレン</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック(サーモフィッシャーサイエンティフィック https://www.fishersci.com/us/en/home.html の一部)</td><td>14-959-70C</td>コー<td>ニングメーカー番号352097</td></tr><tr><td>Falcon 96ウェルアッセイプレート(組織培養プレートの蓋)</td><td>Fisher Scientific(Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html の一部)</td><td>08-772-5</td><td>Corning メーカー番号 353910</td></tr><tr><td>Fisher Brand 25mm シリンジフィルター、ナイロン、0.45 &mu;m、滅菌フィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック(サーモフィッシャーサイエンティフィック https://www.fishersci.com/us/en/home.html の一部)</td><td>09-719D</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーケミカルギルメソッドヘマトキシリン染色(ギル-2)、4L</td><td>フィッシャーサイエンティフィック(サーモフィッシャーサイエンティフィック https://www.fishersci.com/us/en/home.html の一部)</td><td>CS401-1D</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランドシャープス-A-ゲイターポイントオブユースシャープスコンテナ、5クォート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック(サーモフィッシャーサイエンティフィック https://www.fishersci.com/us/en/home.html の一部)</td><td>14-827-122</td>トリスバッファー(ゲル/マウントメディア)、20 mL VWR、アバンターの一部(https://vwr.com)102092-122バイオメダ&トレードのフルオロゲル代替品を備えた<td>適切なBSL-2ラボセットアップ</td></tr><tr><td>フルオロゲル</td><td></td><td></td>のための補足機器<td>。ゲルマウント、電子顕微鏡科学</td></tr><tr><td>ホルマリン、緩衝、10%、4L</td><td>フィッシャーサイエンティフィック(サーモフィッシャーサイエンティフィック https://www.fishersci.com/us/en/home.html の一部)</td><td>SF100-4</td><td>それぞれまたは4</td></tr>ギ<tr><td>ルソンピペットマンP200ピペットの場合、50-200 &mu;L</td><td>Daigger Scientific (https://www.daigger.com)</td><td>EF9930E</td><td></td></tr><tr><td>Hy-Clone Phosphate Buffered Saline, 1x Solution, 1 L (PBS)</td><td>Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html の一部)</td><td>SH30256LS</td><td>代替の乾燥粉末製品を使用できます</td></tr><tr><td>過酸化水素、3%</td><td>複数のベンダー</td><td></td><td>薬局や店舗ブランドなど、市販の供給元。</td></tr><tr><td>レンズ顕微鏡対物レンズ 20x および 40x</td><td>複数のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lysol IC Quarternary 消毒クリーナー、1G</td><td>Daigger Scientific (https://www.daigger.com)</td><td>EF8481</td><td>適切な BSL-2 実験室消毒のための補足資料</td></tr><tr><td>Miltex ブランド 使い捨てメス サイズ 22 (MiniScalpel の代替サイズ)</td><td>AMD Next (www.amdnext.com)</td><td>999112314</td><td>サンプルタッチ印象のための補助装置。Ag Tek MiniScalpel</td></tr><tr><td>N,N-ジメチルホルムアミド、琥珀色のガラス包装、500 mL</td><td>フィッシャーサイエンティフィック(サーモフィッシャーサイエンティフィック https://www.fishersci.com/us/en/home.html の一部)</td><td>D119-500</td><td></td></tr>ペル<tr><td>オキシダーゼ標識ストレプトアビジン、50 mL</td><td>セラケア(https://www.seracare.com/)</td><td>5550-0001</td><td>KPLイムノアッセイおよびキットの代替サイズ 参照番号71-00-38</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水粉末(代替品フィッシャーリキッドPBS)</td><td>シグマアルドリッチ(https://www.sigmaaldrich.com/)</td><td>P3813</td><td>1 L蒸留水で調製する必要があります。1、10、50パックの量で利用可能</td></tr><tr><td>一次抗体:ポリクローナル抗核タンパク質または抗リッサウイルスビオチン化抗体</td><td></td><td></td>のカクテル <td>4°Cで保存します。C</td></tr><tr><td>PYREXディスポーザブルセロジカルピペット、ガラス、滅菌、プラグ付き、コーニング、1.0 mL</td><td>VWR、アバントールの一部 (https://vwr.com)</td><td>7078D-1</td><td>VWR メーカー番号89091-220</td></tr><tr><td>PYREXディスポーザブルセロロジカルピペット、ガラス、滅菌、プラグ付き、コーニング、10.0 mL</td><td>VWR、アバントールの一部 (https://vwr.com)</td><td>7078D-10</td><td>VWR メーカー番号89091-106</td></tr><tr><td>PYREXディスポーザブルセロロジカルピペット、ガラス、滅菌、プラグ、コーニング、5.0 mL</td><td>VWR、Avantor の一部 (https://vwr.com)</td><td>7078D-5</td><td>VWR メーカー番号 89091-484</td></tr><tr><td>Richard-Allan Scientific Gills Hematoxylin Stain No. 2、1PT (上記に代替)</td><td>Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html の一部)</td><td>22-050-201</td><td>Thermo Scientific メーカー番号 72504</td></tr><tr><td>スライドホルダー、24 プレース</td><td>VWR、Avantor (https://vwr.com) の一部</td><td>25608-868</td><td>さくら&reg;Finetekサプライヤー番号4465;複数のベンダーを通じて入手可能</td></tr><tr><td>標本ブリキボックス、1/2オン</td>ス<td>VWR、アバンターの一部 (https://vwr.com)</td><td>101412-452</td><td>脳組織サンプルの保管のための補助機器</td></tr><tr><td>テイラー2イベントデジタルタイマー/クロック</td><td>複数のベンダー</td><td></td><td>補助機器</td></tr><tr><td>ティッシュテックスライド染色キット</td><td>VWR、アバンターの一部 (https://vwr.com)</td><td>25608-902</td><td>さくら&reg;Finetekサプライヤー番号4551;複数のベンダーを通じて入手可能</td></tr><tr><td>TWEEN 80、ポリエチレングリコール、500mL</td><td>シグマアルドリッチ(https://www.sigmaaldrich.com/)</td><td>P1754</td><td>25mL、1L、1Gの容量でも利用可能</td></tr><tr><td>VWR FLIPピペットフィラー(0.05-100mL)</td><td>VWR、アバントールの一部(https://vwr.com)</td><td>53497-055</td><td></td></tr><tr><td>VWRソフトニトリル検査手袋、L(100個/箱)</td><td>VWR、アバントールの一部(https://vwr.com)</td><td>89038-272</td><td>適切なPPE水の補助装置</td></tr><tr><td>、脱イオン(20 L)</td><td>VWR、Avantorの一部(https://vwr.com)</td><td>10806-022</td><td></td></tr><tr><td>ウィートン透明ガラスサンプルバイアル、8 mL</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック(サーモフィッシャーサイエンティフィック https://www.fishersci.com/us/en/home.html の一部)</td><td>06-408C</td><td>DWKライフサイエンスメーカー番号224884</td></tr><tr><td>ホワイトコーティング、ダブルウェルパターン顕微鏡スライド、14 mm</td><td>Tekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html)</td><td>2-140</td><td></td></tr><tr><td>白い長方形の国連レート処理容器、5G</td><td>Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)</td><td>1147T01WHT</td><td>化学廃棄物の保管/処分のための補足機器 (ホルマリン)</td></tr></tbody></table>

直接急速な免疫組織化学試験を用いた狂犬病サーベイランスの強化

Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test

ラボベースの監視は狂犬病の予防、制御および管理の努力のために不可欠である。DFAは狂犬病診断のゴールドスタンダードですが、特に開発途上国では狂犬病の監視を改善するための追加の診断技術を検証する必要があります。ここでは、DFA と比較して光顕微鏡を使用する代替、実験室またはフィールド ベースのテスト オプションとして DRIT の標準プロトコルを示します。疑わしい動物から採取された脳組織のタッチインプレッションは、10%緩衝ホルマリンで固定される。DRITは狂犬病ウイルス特異的モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体(ビオチンに結合)、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ酵素、およびクロモゲンレポーター(例えば、アセチル3-アミノ-9-エチルカルバゾール)を使用して、感染組織内のウイルス包含物を検出します。約1時間で、脳組織サンプルをDRITによってテストおよび解釈することができる。北米、アジア、アフリカ、ヨーロッパの様々な種から試験された疑わしい動物の脳の評価は、DRITがDFAと比較して100%に近づいていることで高い感度と特異性を示しています。2005年以来、米国農務省野生生物サービス(USDA WS)プログラムは、DRITを使用して大規模な強化狂犬病監視活動を実施し、戦略的狂犬病管理地域で野生生物から収集された94,000サンプルをテストし、94,000サンプルをテストしました。.DRITは狂犬病の診断のための強力で経済的な用具を提供し、現在の狂犬病の監視、予防および制御プログラムを世界的に改善するために実験室および分野生物学者によって使用することができる。

DRITからの肯定的な結果は青みを帯びた細胞体の細胞質内の形およびサイズ(図3)で変化することができる赤い細胞質内のウイルス包含物を示す。包含物は非常に明るい余白およびより集中的に染色された中央区域と滑らかに見える。強度および抗原分布は、包含物が検出されたときに記録されます。強度は+4から+1に等級付けされます。肯定的な制御スライドは+4の強さと呼ばれる強烈な、輝くマゼンタの輝きを持っている必要があります。特にサンプル処理が最適でない場合(サンプル組織がわずかに分解している)、これらは+3としてグレーディングする必要がある場合に、わずかな色の損失が発生する可能性があります。顕著に鈍い染色は+2から+1として等級付けされ、狂犬病ウイルス感染の診断とは見なされず、不確定として標識される。
さらに、抗原分布は+4から+1にグレードされ、+4はサイズと形状が変化する大小の包含物の豊富さで構成される抗原分布を表し、CNS組織内のあらゆる視野(またはほぼすべての分野)に存在する。タッチインプレッション。陽性対照は、通常、+4抗原分布を有する。+3 の抗原分布は、ほとんどの場合、すべての視野にさまざまなサイズの包含がある場合に割り当てられます。顕微鏡分野の10%~50%に含有物が見つかった場合、+2抗原分布が割り当てられます。顕微鏡分野の&lt;10%に含有物が見つかった場合、+1抗原分布が割り当てられます。
狂犬病ウイルスを有するほとんどのCNS組織は、+3または+4強度および抗原分布として等級付けされた典型的なウイルス包含物を示す。結果が+2または+1強度または+2または+1抗原分布を示す場合、サンプルは「不確定」と宣言され、繰り返しテストが保証されます。同じサンプルに繰り返し不確定試験結果がある場合、サンプルはDFAまたは関連する確認試験のリファレンスラボに送られるべきです。
DRITを用いた試験サンプルは、CNS組織を含むスライドが200X以上の倍率でスキャンされ、典型的なウイルス包含物が検出されなかった後、狂犬病ウイルス抗原に対して陰性と見なされる(図4)。陰性サンプルは、非特異的染色をほとんどまたは全く伴う青みを帯びた細胞体を示す。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig1.jpg"> 図1:試験用試薬を用いた10枚のスライド染色皿のセットアップ。皿はプロトコルに従うために必要な順序で試薬名でラベル付けされる。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig1large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig2.jpg"> 図2:湿ったペーパータオルと細胞培養プレートで作られた単純な湿度室。 湿ったペーパータオルおよび細胞培養版を使用する簡単な湿気の部屋は分野ベースの適用を可能にする。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig2large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig3.jpg"> 図3:+4強度および+4抗原分布を有する狂犬病陽性ウイルス包含物の代表的なスライド。(AおよびB)は、200倍の倍率で陽性狂犬病ウイルス包含を示す。 (CおよびD)は、400倍の倍率で陽性狂犬病ウイルス包含を示す。 スケールバー = 5 μm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig3large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig4.jpg"> 図4:狂犬病ウイルス含有物のない陰性サンプルの代表的なスライド。(AおよびB)は、200倍の倍率で狂犬病ウイルス包含物に対して陰性のサンプルを示す。 (CおよびD)は、狂犬病ウイルス包含物に対して400倍の倍率で陰性のサンプルを示す。 スケールバー = 5 μm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig4large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59416/59416fig5.jpg"> 図5:USDA WSが使用するDRIT試験施設の代表的な写真。(A) 輸送用の密閉されたトレーラー内のモバイル試験施設。(B) DRITテスト用に改造されたレクリエーション車両。(C) DRIT試験施設は、大学の研究室と連携しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59416/59416fig5large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

直接急速免疫組織化学検査(DRIT)は、狂犬病診断のための直接蛍光抗体(DFA)検査に代わる世界動物衛生・世界保健機関(OIE/WHO)に代わる方法を提供しています。このテストは軽い顕微鏡を使用して脳の印象に約1時間で行うことができる分野ベースの適用を可能にする。

Laboratory-based surveillance is integral for rabies prevention, control and management efforts. While the DFA is the gold standard for rabies diagnosis, ...

DRITは、現場の分散ラボや電子顕微鏡検査に日常的にアクセスできない領域で行うことができる狂犬病診断テストを提供するため、重要です。DRITの主な利点は、単純な光顕微鏡のみを利用し、約1時間で結果を得ることができるということです。DRITは、世界中の狂犬病の監視、予防、制御プログラムを改善するためにラボや現場生物学者が使用できる狂犬病診断のための強力な経済的ツールを提供します。採取した動物や周囲温度まで解凍された動物の場合は、子宮頸部脊椎を審査官に向かってわずかに回転させて平らな表面に動物の上を置きます。頸椎の側面にアラント後頭関節を同定するパルパテ。メスの刃を使用して、気管および食道を含む筋肉および軟部組織のすべての層を切断する腹側の腹側のアトラント後頭部の関節のレベルで切開を行う。頸椎椎の前側面に近いところまで続ける。次に、脳幹が見えるまで、動物の頭部をエンドレンジ拡張に移動します。メスの刃を使用して、サンプル用の目に見える脳幹と中枢神経系組織をすべて除去します。脳幹サンプルを壊れない容器に入れ、それに応じてラベルを付けます。まず、サンプルスライドの完全な浸漬を可能にするのに十分な深さの染色皿を設定します。10%リン酸緩衝ホルマリンで皿1を充填します。TPBSで料理2、4、5を満たします。3%過酸化水素で皿3を充填します。その後、蒸留または脱イオン水で6、8、9、10の料理を満たします。蒸留水と1:1の比率で希釈したギルのヘマトキシリン製剤番号2で皿7を充填します。アミノエチルカルバゾールストック溶液を調製するために、ガラスピペットを用いて、5ミリリットルのN、N-ジメチルホルムアミドをガラス容器に入れる。ガラス容器に3-アミノ9-エチルカルバゾールの120ミリグラムの錠剤を加え、完全に溶解するまで振る。AECの働き希釈を調製するには、15ミリリットルの遠心分離管に7ミリリットルの酢酸バッファーを加えます。ガラスピペットを使用して、遠心管に0.5ミリリットルのAECストック溶液を加えます。0.75ミリリットルの過酸化水素3%溶液を加えます。0.45マイクロメートルのシリンジフィルターを使用して溶液をフィルター処理します。まず、スミアプルーフ防水永久インクマーカーを使用して、各標本に固有の番号でガラス顕微鏡スライドにラベルを付けます。メスの刃を使って容器から脳幹を取り出し、ペーパータオルの上に置きます。2番目のペーパータオルを使用して、余分な液体、血液、毛皮を静かに消し去り、脳幹組織だけを明らかにします。必要に応じて、脳幹組織を切り離して断面を明らかにする。横の動きをせずに脳幹のいくつかのポイントに顕微鏡スライドを非常に穏やかに触れて、脳幹の複数の領域をスライドに移し、脳組織からスライドに1つまたは2つの層の細胞のみが転送されるようにします。スライドを室温で約5分間乾燥させます。その後、10%緩衝ホルマリンにスライドを10分間浸します。ホルマリンからスライドを取り出し、皿2のTPBS溶液で浸す。3皿に含まれる過酸化水素溶液にすすいスライドを10分間浸します。この後、過酸化水素からスライドを取り出し、皿4に含まれる新鮮なTPBSに浸します。余分な過酸化水素を除去した後、スライドを皿5に含まれる新鮮なTPBSに入れます。皿5からスライドを一度に1つずつ取り、余分なバッファを振り払ってしみ、ラボベンチの湿らせたペーパータオルの上にスライドを置きます。すべてのスライドが転送されたら、スポイトまたはピペットを使用して、CNS組織を覆うのに十分な一次抗狂犬病ウイルス抗体を各スライドにドロップします。ウェルプレートまたは別の簡単なカバーでスライドを覆い、湿度チャンバーを作成し、チャンバー内の室温でスライドを10分間インキュベートします。この後、湿度チャンバーからスライドを取り出し、余分なコンジュゲートを振ってブロットし、皿5のTPBSのスライドをすすぎます。一度に1つのスライドで作業し、TPBSからスライドを取り外し、スポイトまたはピペットを使用して、CNS組織をカバーするのに十分なストレプトアビジンペルオキシダーゼ複合体をドロップします。すべてのスライドを覆ったら、室温で10分間湿度室にインキュベートします。その後、湿度チャンバーからスライドを取り出し、余分な複合体を振ってブロットオフし、皿5に含まれるTPBSでスライドをすすぎます。一度に1つのスライドで作業し、TPBSからスライドを取り外し、ピペットを使用してCNS組織をカバーするのに十分なAEC作業溶液をドロップします。室温で10分間湿度チャンバにスライドをインキュベートします。この後、皿6に含まれる蒸留水にスライドをすすいで、ジルのヘマトキシリンのカウンターステインに2分間皿7に入れます。すぐに蒸留水のすべてのスライドを皿8にすすります。洗い物ごとに9皿と10の淡水を使用してこれを2回繰り返します。一度に1つのスライドを作業し、水からスライドを取り除き、余分な水を振り払って消します。水溶性取り付け媒体を使用して、スライドにカバースリップを貼り付けます。次に、20倍の目的を持つ軽い顕微鏡を使用してスライドを見ます。DRITからの肯定的な結果は、青みがかった細胞体の細胞質内の形状および大きさが変化し得る赤い細胞質内皮質ウイルス包括を示す。インクルージョンは、非常に明るいマージンとあまり集中的に染色された中央領域で滑らかに見えます。抗原分布は、CNS組織タッチ印象内のあらゆる視野に存在し、サイズと形状が変化し、存在する大小の包含の豊富さで構成される抗原分布をプラス4を加えたプラス4を伴うプラス4にグレードされる。プラス 3 の分布は、ビューのフィールドのほとんどではなく、さまざまなサイズに含まれる場合に割り当てられます。顕微鏡分野の10~50%に含まれる場合、10%未満の視野で包含が見つかるとプラス1が割り当てられる間、プラス2つの抗原分布が割り当てられます。狂犬病ウイルスを有するほとんどのCNS組織は、3以上の強度と抗原分布をプラス3またはプラスとして等級付けされた典型的なウイルス包括を示す。結果が強度または抗原分布のいずれかでプラス1またはプラス2を示す場合、サンプルは不確定であると宣言され、繰り返し検査が保証されます。DRITを用いた試験試料は、CNS組織を含むスライドを200倍以上の倍率でスキャンした後の狂犬病ウイルス抗原に対して陰性と考えられ、典型的なウイルスインクルージョンは検出されない。陰性サンプルは、既知の特定の染色をほとんどまたは全く有しない青みがかった細胞体を示す。狂犬病診断検査を行う各人は、標準的な曝露前狂犬病の予防接種を受け、定期的な血清学的抗体評価を受けるべきである。単一の個人は、そのような作業が行われている領域に入るべきではありません。ライブ狂犬病ウイルスを扱う際の予防策に加えて、テストで使用される試薬のいくつかは危険です。各試薬の安全性データシートを参照してください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオは、感染したマウス脳組織における狂犬病ウイルス抗原検出のための免疫組織化学染色を示しています。このプロセスには、脱パラフィンとアルコール処理が含まれ、その後、抗原のアクセシビリティを強化するためのタンパク質分解処理が行われます。免疫組織化学染色では、赤色の沈殿物が明らかになり、組織切片に狂犬病抗原が存在することが確認されます。...

狂犬病ウイルス抗原検出のための免疫組織化学染色

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狂犬病ワクチンの効力を評価するインビトロELISA試験

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フィールド死後狂犬病は、さらなる分子用途を用いた資源限定設定のための迅速な免疫クロマトグラフィー診断試験

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ホルマリン固定組織からのリサウイルス抗原検出のための免疫組織化学試験

各種牛脳構造における狂犬病ウイルスの定量

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狂犬病間接蛍光抗体検査を用いた狂犬病IgGおよびIgM抗体の検出

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鳥インフルエンザウイルスから守るための方法、検出し、シーケンスのRNAは、検証され、鳥類から自然な糞便サンプルを用いて延長された。この手法は、クールチェーンと感染性ウイルスの取り扱いを維持する必要性を除去し、96ウェルハイスループットセットアップに適用することができます。...

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腸管上皮細胞の腸内細菌の侵入<em&gt;インビトロ</em&gt;劇的垂直拡散室モデルを用いた強化され

学ぶ直接急速免疫組織化学試験（DRIT）による狂犬病診断法。現場での迅速なサーベイランスを可能にし、約1時間で結果が得られる経済的なツールです。

直接急速な免疫組織化学試験を用いた狂犬病サーベイランスの強化

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