ヒト脂肪由来間葉系幹細胞の単離・増殖のための酵素フリー法
2019年12月16日
このプロトコルは、腹筋形成術および脂肪吸引試料から間葉系幹細胞を切除するための酵素フリーの方法をexplant法を用いて提供する。過酷な酵素または遠心分離ステップの欠如は、インビトロの研究に使用したり、クリニックに戻って転送することができる臨床的に関連する幹細胞を提供します。
このプロトコルは、粗い酵素や遠心分離ステップを使用せずにASCを分離するための簡単な費用対効果の高い方法を提供し、細胞の表現型や挙動を変化させる可能性があります。過酷なステップの欠如は、酵素と遠心分離を使用して単離されたものよりも操作された細胞を少なくし、実験的観察が単離法のアーティファクトであるかどうかについての質問を最小限に抑えます。この外植法は、様々な疾患を治療したり、研究用途を提供する生活の中で拡大するために患者に導入される臨床関連ASCを生成することができます。
言葉でミンチ法を完全に説明することは困難です。視覚的なデモンストレーションは、他の科学者に組織自体を分解することを学ぶ面倒を提供することができます。同様の外植法は、臍組織から例えば、MSCの他の集団を分離するために使用することができる。
腹腔形成組織サンプルをミンチするには、まず滅菌100ミリメートル板の蓋に組織を移す。その後、滅菌針を使用して組織の一部を所定の位置に保持し、滅菌メスを使用して組織を1ミリメートル未満に切断します。組織を新鮮なチューブに移し、サンプルを5〜6回反転または振って、すべての層の混合を確実にします。
次いで、無菌ヘラを用いて、2.5~5ミリリットルの組織を100ミリ真空ガスプラズマ処理組織培養板に移す。新鮮な遠心管に注いでサンプルの体積を測定します。次に、プレートに相当量の組織培養培地を加え、プレートを軽く旋回して内容物を混合する。
プレートの基部に十分な数の細胞が見られるまで、5%の二酸化炭素で37°Cでプレートをインキュベートします。十分な数の細胞がプレートに記載されるか、または7日後のいずれか早い場合は、残りの組織部分をすべて除去する。次に、組織培養培地中のASCを70%合流に達するまで、または細胞が通過する時点でクラスターが密になるまで培養する。
1Xリン酸緩衝生理食塩紙でプレートをそっとすすります。接着性細胞をトリプシン化するには、リン酸緩衝生理食塩水を吸引し、各プレートに0.25%EDTAを加えたトリプシンを1ミリリットル加え、摂氏37度で5分間インキュベートする。プレートに少量のメディアを追加して、トリプシンを無効にします。
その後、プレートの上から下にメディアトリプシンをそっとピペットし、プレートから弱く取り付けられた細胞を失います。細胞をシードするには、まずプレートにメディアを追加します。次に、ドロップワイズで細胞を追加し、プレート全体に均等に分布を確保するためにプレートを旋回します。
3つの通路の後、サイトメトリーおよび分化アッセイを流すに進む。3回の通過の後、リポアストロシンおよび腹部形成術サンプルからの単離されたASCは、酵素消化後の単離されたASCと同様に、MSC形態および表現型を有することが判明した。他の MSC と同様に、外植分離 ASC は CD45 では負数、CD73、CD90、および CD105 では正になります。
組織を細かく切り取るとき、各部分の表面積は、ASCが組織から移行するのに十分な大きさでなければならない。これらは、幅広い用途に使用できる基本的な幹細胞です。分離されたASCは、インビボまたはインビトロの任意のダウンストリームアプリケーションに使用できます。
概要
本プロトコルでは、外植え（エクスプラント）法を用いて、腹壁形成術および脂肪吸引のサンプルから脂肪由来幹細胞（ASC）を分離するための酵素フリーの手法について説明します。このアプローチは細胞への操作を最小限に抑え、さまざまな用途に適した臨床的に有用な幹細胞を確保することを可能にします。
研究の主要構成要素
科学分野
- 幹細胞生物学
- 再生医療
- 細胞分離技術
背景
- ASCsを単離する従来の方法では、強力な酵素の使用や遠心分離が行われることが多いです。
- これらの方法は、細胞の表現型や挙動を変化させる可能性があります。
- 外植片法（エクスプラント法）は、より低刺激な代替手段となります。
- 視覚的な実演は、組織の細切工程の理解に役立ちます。
研究目的
- コスト効率が高く簡便なASCの分離法を開発すること。
- 過酷な分離手法によって生じる、実験的観察におけるアーティファクトのリスクを低減すること。
- 治療への応用に向けた、臨床的に有用なASCを生成すること。
使用された手法
- 細切した腹壁形成術組織を組織培養プレートで培養します。
- 細胞を37°CのCO2環境下でインキュベートします。
- 細胞が十分に増殖した後、残存している組織片を除去します。
- 細胞を継代し、幹細胞マーカーを用いて特性評価を行います。
主な結果
- 単離されたASCは、酵素消化法で得られたものと同様の形態および表現型を示す。
- 外植片から単離されたASCは、CD45陰性であり、CD73、CD90、およびCD105陽性である。
- この手法では細胞への操作が少なくなるため、実験の信頼性が向上する。
- ASCは、in vivoおよびin vitroの両方において、さまざまなダウンストリームアプリケーションに使用できる。
結論
- 外植片法は、ASCを単離するための実行可能な代替手段である。
- この手法は、従来の法よりも細胞特性を良好に維持することができる。
- 単離されたASCは、研究および臨床応用の幅広い可能性を有している。
よくある質問
業界における実用的な重要性
この酵素フリーの分離法は、再生医療における重要な課題である、過酷な酵素処理や機械的処理によるアーティファクトを導入することなく、臨床的に有用な間葉系幹細胞を得るという点に対処するものです。細胞本来の表現型と機能を維持することで、この手法は疾患モデリングや治療スクリーニングなどの後続のアプリケーションにおける予測信頼性を高めます。本手法は、生物学的なリスク低減とターゲットバリデーションが、信頼性の高い最小限の操作で得られた細胞源に依存する初期探索ワークフローを支援します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 多分化能と表面マーカープロファイルを維持した脂肪由来幹細胞を用いて、治療仮説の検証を可能にする。
- 実用的価値： 酵素による表現型の変化を排除することで、実験結果のばらつきを低減する。
- 予測的価値： ターゲット検証アッセイ向けに低操作化された細胞を生成することで、生物学的リスクの低減を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 一貫した間葉系表現型を必要とする標準化されたin vitroアッセイに適した脂肪由来幹細胞を作製できる。
- 実用的価値： CD73、CD90、およびCD105の陽性性を維持する外植片ベースの増殖により、アッセイへの迅速な移行を促進する。
- 拡張性： 化合物スクリーニングやメカニズム研究のための再現性のある細胞製造をサポートする。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性： 再生医療への応用と整合した、臨床的に有用な細胞源を提供する。
- 前臨床モデル： 他種由来酵素への曝露なしに、疾患関連システムのための脂肪由来幹細胞の作製を可能にする。
- メカニズム的なリスク軽減： 分化や免疫調節機能の評価に影響を及ぼす分離アーティファクトに関する懸念を軽減する。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、初期の幹細胞分離から前臨床検証に至るディスカバリー・コンティニュアム（探索的な一連の流れ）に適合し、細胞源の完全性がデータの信頼性やgo/no-go判断に影響を与えるワークフローをサポートします。
- 探索生物学： 生体内に近い形態と表現型を持つ脂肪由来幹細胞を提供し、仮説検証をサポートします。
- スクリーニング： 間葉系ストローマ細胞の特性を必要とするアッセイプラットフォーム向けに、標準化された増殖可能な細胞を提供します。
- 分析： 3代の継代後にフローサイトメトリーおよび分化アッセイを実施し、幹細胞のアイデンティティを確認することが可能です。
- トランスレーショナルリサーチ： 臨床的に重要な細胞特性を維持することで、分離から治療への応用の可能性へと繋げます。
- エンタープライズ再利用： 複数のプロジェクトにわたって利用可能な、酵素を用いない脂肪由来幹細胞製造のための再利用可能なプラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：幹細胞実験における分離誘起アーティファクトを最小限に抑えることで、予測の信頼性を向上させます。
- 運用的価値：高価な酵素や遠心分離に依存しない、コスト効率の高いシンプルなプロトコルを提供します。
- 戦略的価値：細胞ベースのアッセイ結果に対する信頼性を高めることで、Go/No-go判断を改善します。
- ポートフォリオへの影響：前臨床評価のための信頼性の高い間葉系幹細胞を提供し、リスク調整後の開発推進を支援します。
実施上の検討事項
- 機械的な細断および外植体培養のための無菌操作および基本的な組織培養設備が必要です。
- 組織調製のために、メス、針、スパチュラなどの滅菌器具を使用します。
- 最適な細胞増殖のため、37°C、5% CO2という標準的なインキュベーション条件が必要です。
- 初期の組織除去後、コンフルエンシーまたはクラスター密度に基づいた手動での継代を行います。
- 分離後の表現型確認のために、フローサイトメトリーおよび分化アッセイを用います。
