Name: 肺胞マクロファージおよびCD4+T細胞免疫フェノタイピングおよびHIV貯蔵所評価のための気管支藻胞洗浄液および一致血液の処理 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: 学ぶ気管支肺胞洗浄液処理法により、肺由来の肺胞マクロファージとCD4陽性T細胞を高純度に分離し、HIV貯蔵所評価や免疫フェノタイピングを行う方法です。HIV治療戦略の研究に応用可能です。

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著者らは、カナダ保健研究所(CIHR)(CC、MAJ、NCに#153082を付与する)の資金提供者を認めしたいと考えています。レソー・シダらマラディ感染症は、CCとMAJとCCに資金を与えたマギル大学医学部に資金を与えたデュ・フォンス・デ・レチェルチェ・デ・ケベック・サンテ(FRQ-S)です。この研究はまた、カナダ保健研究所(CIHR)-資金提供カナダHIVキュアエンタープライズ(CanCURE)チームグラントHB2 - 164064 MAJ、CCおよびNCに一部でサポートされました。MAJは、免疫学とCCとNCのCIHRカナダ研究委員長層2を保持し、それぞれFRQ-Sジュニア1とジュニア2研究給与賞を保持しています。ETはRI-MUHC学生シップ修士賞を受賞しています。
さらに、著者は、ホセ・ジルアードとサンプルの調整と取得に関与するすべての臨床スタッフ、ならびに呼吸療法士を認めしたいと考えています。RI-MUHC免疫フェノタイピングプラットフォームのエカテリーナ・イウルチェンコ、ヘレーヌ・パジェ=ヴェイレット、マリー=ヘレーヌ・ラコンブ。そして、顕微鏡写真の提供のためのマリアンナ・オルロヴァ博士。最も重要なことは、著者は、この研究が不可能であろう多くのボランティアに感謝したいと考えています。

<ol><li>Chun, T. W., Fauci, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latent+reservoirs+of+HIV%3A+obstacles+to+the+eradication+of+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Latent reservoirs of HIV: obstacles to the eradication of virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 10958-10961 (1999).</li>
<li>Finzi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latent+infection+of+CD4%2B+T+cells+provides+a+mechanism+for+lifelong+persistence+of+HIV-1%2C+even+in+patients+on+effective+combination+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Latent infection of CD4+ T cells provides a mechanism for lifelong persistence of HIV-1, even in patients on effective combination therapy.</a> Nature Medicine. 5, 512-517 (1999).</li>
<li>Costiniuk, C. T., Jenabian, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lungs+as+anatomical+reservoirs+of+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">The lungs as anatomical reservoirs of HIV infection.</a> Reviews in Medical Virology. 24, 35-54 (2014).</li>
<li>Center for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cluster+of+Kaposi%27s+sarcoma+and+Pneumocystis+carinii+pneumonia+among+homosexual+male+residents+of+Los+Angeles+and+Orange+Counties%2C+California%5BTitle%5D)+AND+%22Morbidity+and+Mortality+Weekly+Report%22%5BJournal%5D)">A cluster of Kaposi's sarcoma and Pneumocystis carinii pneumonia among homosexual male residents of Los Angeles and Orange Counties, California.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 31, 305-307 (1982).</li>
<li>Fitzpatrick, M., Crothers, K., Morris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Future+directions%3A+lung+aging%2C+inflammation%2C+and+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Chest+Medicine%22%5BJournal%5D)">Future directions: lung aging, inflammation, and human immunodeficiency virus.</a> Clinics in Chest Medicine. 34, 325-331 (2013).</li>
<li>Kunisaki, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Will+expanded+ART+use+reduce+the+burden+of+HIV-associated+chronic+lung+disease%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+HIV+and+AIDS%22%5BJournal%5D)">Will expanded ART use reduce the burden of HIV-associated chronic lung disease?</a> Current Opinion in HIV and AIDS. 9, 27-33 (2014).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22WHO+%7C+Tuberculosis+and+HIV%22">WHO | Tuberculosis and HIV</a>. , https://www.who.int/hiv/topics/tb/en (2018).</li>
<li>Jambo, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+alveolar+macrophages+are+infected+preferentially+by+HIV+and+exhibit+impaired+phagocytic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Small alveolar macrophages are infected preferentially by HIV and exhibit impaired phagocytic function.</a> Mucosal Immunology. 7, 1116-1126 (2014).</li>
<li>Yeligar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+Alveolar+Macrophage+PPAR%CE%B3%2C+NADPH+Oxidases%2C+and+TGF%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Research+and+Human+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of Alveolar Macrophage PPARγ, NADPH Oxidases, and TGFβ.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 33, 1018-1026 (2017).</li>
<li>Cribbs, S. K., Lennox, J., Caliendo, A. M., Brown, L. A., Guidot, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healthy+HIV-1-infected+individuals+on+highly+active+antiretroviral+therapy+harbor+HIV-1+in+their+alveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Research+and+Human+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Healthy HIV-1-infected individuals on highly active antiretroviral therapy harbor HIV-1 in their alveolar macrophages.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 31, 64-70 (2015).</li>
<li>Holt, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+immune+and+inflammatory+cells+from+human+lung+parenchyma%3A+evaluation+of+an+enzymatic+digestion+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Extraction of immune and inflammatory cells from human lung parenchyma: evaluation of an enzymatic digestion procedure.</a> Clinical & Experimental Immunology. 66, 188-200 (1986).</li>
<li>Brenchley, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequencies+of+polyfunctional+HIV-specific+T+cells+are+associated+with+preservation+of+mucosal+CD4+T+cells+in+bronchoalveolar+lavage%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">High frequencies of polyfunctional HIV-specific T cells are associated with preservation of mucosal CD4 T cells in bronchoalveolar lavage.</a> Mucosal Immunology. 1, 49(2007).</li>
<li>Mwandumba, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis%3B+Resides+in+Nonacidified+Vacuoles+in+Endocytically+Competent+Alveolar+Macrophages+from+Patients+with+Tuberculosis+and+HIV+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis; Resides in Nonacidified Vacuoles in Endocytically Competent Alveolar Macrophages from Patients with Tuberculosis and HIV Infection.</a> The Journal of Immunology. 172, 4592(2004).</li>
<li>Gordon, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhaled+delivery+of+23-valent+pneumococcal+polysaccharide+vaccine+does+not+result+in+enhanced+pulmonary+mucosal+immunoglobulin+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Inhaled delivery of 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine does not result in enhanced pulmonary mucosal immunoglobulin responses.</a> Vaccine. 26, 5400-5406 (2008).</li>
<li>Costiniuk, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+persistence+in+mucosal+CD4%2B+T+cells+within+the+lungs+of+adults+receiving+long-term+suppressive+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">HIV persistence in mucosal CD4+ T cells within the lungs of adults receiving long-term suppressive antiretroviral therapy.</a> AIDS. 32, 2279-2289 (2018).</li>
<li>American Thoracic Society. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22American+Thoracic+Society+-+Bronchoalveolar+Lavage%22">American Thoracic Society - Bronchoalveolar Lavage</a>. , https://www.thoracic.org/professionals/clinical-resources/critical-care/clinical-education/critical-care-procedures/bronchoalveolar-lavage.php (2004).</li>
<li>King, T. E. Jr <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKing%2C+TE+%22Basic+principles+and+technique+of+bronchoalveolar+lavage+-+UpToDate%22">Basic principles and technique of bronchoalveolar lavage - UpToDate</a>. , https://www.uptodate.com/contents/basic-principles-and-technique-of-bronchoalveolar-lavage?topicRef=105799&source=see_link (2018).</li>
<li>Lea, S., Dungwa, J., Ravi, A., Singh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophage+size+is+increased+in+COPD+patients+compared+to+controls%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophage size is increased in COPD patients compared to controls.</a> European Respiratory Journal. 50, (2017).</li>
<li>Kuse, R., Schuster, S., Schübbe, H., Dix, S., Hausmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+lymphocyte+volumes+and+diameters+in+patients+with+chronic+lymphocytic+leukemia+and+normal+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Blut%22%5BJournal%5D)">Blood lymphocyte volumes and diameters in patients with chronic lymphocytic leukemia and normal controls.</a> Blut. 50, 243-248 (1985).</li>
<li>Heron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchoalveolar+lavage+cell+pattern+from+healthy+human+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Bronchoalveolar lavage cell pattern from healthy human lung.</a> Clinical & Experimental Immunology. 167, 523-531 (2012).</li>
<li>Rheinländer, A., Schraven, B., Bommhardt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD45+in+human+physiology+and+clinical+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">CD45 in human physiology and clinical medicine.</a> Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).</li>
<li>Yu, Y. R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometric+Analysis+of+Myeloid+Cells+in+Human+Blood%2C+Bronchoalveolar+Lavage%2C+and+Lung+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54, 13-24 (2015).</li>
<li>Geiser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+Macrophage+Clearance+of+Inhaled+Micro-+and+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Aerosol+Medicine+and+Pulmonary+Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Update on Macrophage Clearance of Inhaled Micro- and Nanoparticles.</a> Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 23, 207-217 (2010).</li>
<li>Costiniuk, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+predictors+of+airflow+obstruction+in+an+HIV+tertiary+care+clinic+in+Montreal%2C+Canada%3A+A+cross+sectional+study%5BTitle%5D)+AND+%22HIV+Medicine%22%5BJournal%5D)">Prevalence and predictors of airflow obstruction in an HIV tertiary care clinic in Montreal, Canada: A cross sectional study.</a> HIV Medicine. , (2019).</li>
<li>Balfour, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altruism+motivates+participation+in+a+therapeutic+HIV+vaccine+trial+%28CTN+173%29%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Care%22%5BJournal%5D)">Altruism motivates participation in a therapeutic HIV vaccine trial (CTN 173).</a> AIDS Care. 22, 1403-1409 (2010).</li>
<li>Vandergeeten, C., Fromentin, R., Chomont, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cytokines+in+the+establishment%2C+persistence+and+eradication+of+the+HIV+reservoir%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+%26+Growth+Factor+Reviews%22%5BJournal%5D)">The role of cytokines in the establishment, persistence and eradication of the HIV reservoir.</a> Cytokine & Growth Factor Reviews. 23, 143-149 (2012).</li>
<li>Rennard, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+volume+of+epithelial+lining+fluid+recovered+by+lavage+using+urea+as+marker+of+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Estimation of volume of epithelial lining fluid recovered by lavage using urea as marker of dilution.</a> Journal of Applied Physiology (1985). 60, 532-538 (1986).</li>
<li>Twigg, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+highly+active+antiretroviral+therapy+on+viral+burden+in+the+lungs+of+HIV-infected+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Effect of highly active antiretroviral therapy on viral burden in the lungs of HIV-infected subjects.</a> The Journal of Infectious Diseases. 197, 109-116 (2008).</li>
<li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Macrophage+Subpopulations+Characterize+Acute+Infection+and+Chronic+Inflammatory+Lung+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Distinct Macrophage Subpopulations Characterize Acute Infection and Chronic Inflammatory Lung Disease.</a> The Journal of Immunology. 189, 946(2012).</li>
<li>Garn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+aspects+of+flow+cytometric+analysis+of+cells+from+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Specific aspects of flow cytometric analysis of cells from the lung.</a> Experimental and Toxicologic Pathology. 57, 21-24 (2006).</li>
<li>Szaniawski, M. A., Spivak, A. M., Bosque, A., Planelles, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+influences+SAMHD1+activity+and+susceptibility+to+HIV-1+in+primary+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Sex influences SAMHD1 activity and susceptibility to HIV-1 in primary human macrophages.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li>
<li>Avalos, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+Productively+Infected+Monocytes+and+Macrophages+of+Simian+Immunodeficiency+Virus-Infected+Macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Quantitation of Productively Infected Monocytes and Macrophages of Simian Immunodeficiency Virus-Infected Macaques.</a> Journal of Virology. 90, 5643-5656 (2016).</li>
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著者は何も開示していない。

ここでは、BAL液を処理してCD4 T細胞およびAMを得る方法を説明し、一致したPBMCと共に、肺内のHIV貯留部を調べるために研究することができる。我々は最近、一致した末梢血およびBALサンプルからのCD4 T細胞におけるHIVDNA定量について報告し、我々のグループは、HIVが末梢血15のものよりも肺CD4 T細胞に13倍多く存在することを実証した。しかし、AMにおけるHIV DNAのレベルはドナー依存であり、これまでのところ、マクロファージ15と比較してリンパ球中のHIV DNAレベルとの間に一貫した相関関係は存在しない。しかし、これらの主要なマクロファージ細胞サブセットへのアクセスは、この質問を尋問し、HIV貯蔵所の文脈で肺のウイルス負荷のより良い理解を得るための重要なツールとなります。
ART前の時代およびBAL流体を利用した他のいくつかの研究では、参加者は疑わしい病理を診断するか、呼吸器症状3の微生物学的診断を得るために気管支鏡検査を受けた。しかし、我々は、任意のアクティブな肺症状や病理なしで参加者を募集することができ、すべての参加者は、倫理的な同意フォーム15に署名しました.閉塞性肺疾患24のスピロメトリースクリーニング研究など、他の研究に参加した当センターから参加者を募集することができました。大腸 内視鏡 検査。HIVと一緒に住んでいる人々の間で以前の研究は利他主義が研究研究への参加を動機づける重要な要因であることを実証しました 25.多くの人間の標本と同様に、我々は人と人のばらつきの多くを指摘した。良好な細胞収率と低い細胞収率でBALを得る参加者を「予測」する方法はありませんでした。リンパ球のかなり一貫した数を生み出す末梢血とは異なり、BAL流体の細胞数は非常に変動する。肺に通常の生理食べ物のより多くの量を注入する(BAL液のより大きなリターンを得ることを期待して)通常の生理食生活の大きなボリュームは、多くの場合、より多くの咳と発熱後の気管支鏡検査のリスクが高いと関連しているので、常に可能ではありません。直径が小さい(大きい)気管支鏡を使用することで、呼吸器科医は気管支の奥深くに到達し、より多くの細胞を含む流体を得ることができることに気づきました。一貫した発見は、タバコ喫煙者はBAL流体内のリンパ球よりもはるかに大きな割合を持っていたというもので、これはAMが破片や粒子状物質を巻き込むと予想される。さらに、喫煙者からのBAL流体には、PCR装置や流量計などの機器を遮断する破片が含まれていることを観察しました。同様の問題は、汚染の多い地域や、大気の質の悪さにさらされる頻度が高い個人でも見られる可能性があります。
HIV貯留槽の確立とウイルス持続性における役割に関しては、CD4 T細胞およびAMの純度が重要な考慮事項である。このため、蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いて、高純度の細胞集団を得ることを選びました。また、気管支鏡検査中に軽度の出血が予想されるため、採取されたBAL液が血液で汚染される可能性もある。ナイーブB細胞の存在はこれを示し、この問題を回避するために赤血球リシスバッファーで細胞を洗浄することができる。BAL流体を研究するもう一つの課題は、HIV持続性26を理解するために重要である炎症マーカーおよびサイトカインの定量化に関する。インスティファインされた生理食液がBAL液を希釈するにつれて、炎症性メディエーターおよびサイトカインのレベルを測定することは困難である場合がある。希尿素補正因子は希釈を考慮して提案されているが、その使用を説明する文献は比較的少ない27,28である。
AMは高度に自己蛍光性であり、細胞の選別とフローサイトメトリーのプノティピック解析中に問題を引き起します。特に、AMが完全に黒色で、自己蛍光に大きな影響を与える喫煙者では、その効果がより顕著です。標準的な青色の488 nmレーザーによって励起されると、AMの自己蛍光は約540 nmでピークにあり、FITCおよびPE29、30のような一般的に使用されるコンジュゲートの蛍光スペクトルと重なる。2つの別々のレーザーは、FITCとPEを励起するために使用することができることは注目に値します(例えば、青い488レーザーによって黄色/緑とFITCによるPE)。FITCで固有の自己蛍光を克服するために、染色されていないAMを使用して自己蛍光の背景を決定しました。さらに、蛍光マイナス1(FMO)制御の使用は、これらの技術的な問題に対処するために非常に有用であることができます。より大きなビーズ(例えば、7.5 μm)を使用することができ、これは、リンパ球集団の補償に使用できる小さなビーズ(例えば、3.0 μm)と比較して、マクロファージ集団を補償するためのサイズが近い。さらに適切なアプローチは、HLA-DRやCD45などのサブセット上の既知の高発現マーカーを使用して、単一染色コントロールとして細胞のごく一部を使用することです。ビーズで達成することができるよりも正確な補償。喫煙者のサンプルの場合、マクロファージがはるかに大きく、より自己蛍光性が高いため、この戦術は特に有用である。さらに、調製工程から、BALサンプル全体を、プロトコルのセクション3に記載されているようにソートする前にプレート内で培養することができ、接着により集団の分離を可能にする。このようにして、付着性マクロファージは、リンパ球などの他の非付着細胞から単離することができる。リンパ球とAM集団が一緒に調べるのではなく分離されている場合、補償ははるかに困難です。ただし、付着に頼るとマクロファージが失われ、セル数が既に制限されている場合に重要な考慮事項となります。また、付着ステップは、これらの細胞を使用して生成された下流の結果に影響を与える可能性があり、付着性単球の不要な活性化をもたらす可能性があります。細胞を効率的に純粋な集団に分類する価値は、その後の実験のためにそのような細胞を少なくするという制限に対して重み付けされなければならない。
他のモデル、特にマウスモデルは、マクロファージ免疫学的特性および生物学を研究するために使用されてきた。これらのモデルは非常に便利であり、操作が困難なセルタイプに対する大きな洞察を可能にしますが、制限があります。細胞表面マーカーの多くはマウスとヒトの間で変化し、ヒトAMの免疫表現型が完全に理解されていない。しかし、このモデルシステムは、各動物から入手可能な低い細胞数のためにアッセイのためにいくつかのマウスのプールを必要とします。さらに、標本をプールする必要性は、遺伝的素因と性別の考慮を排除します。近年、制限因子SAMHD-131の異なる発現に起因するHIV-1によるマクロファージの感染性において性が役割を果たすることが示されている。非ヒト霊長類(NHP)は、ヒトに最も近いモデルを表し、シミアン免疫不全ウイルス(SIV)感染の研究と免疫系への影響を促進し、組織常駐マクロファージの役割に関する洞察を提供した。単球由来マクロファージ。カゲサスマカクでは、肺マクロファージがBAL港から複製性の高いウイルスを単離することも示されている。ウイルス増殖アッセイ(VOA)は、組織常駐細胞32におけるSIVの挙動を分析するために用いた。このような知見は重要な研究価値であるが、適用する前にヒトで検証する必要があり、HPを使用するコストが高いため、大規模なサンプル集団の使用が妨げられます。さらに、ヒトAMは、インビトロウイルス/微生物感染アッセイなどの他の多くの用途や、結核/HIV共感染などの他の病原体の研究に役立ちます。

HIV感染の治療に直面する最も重要な課題の1つは、抗レトロウイルス療法(ART)1、2の中断後に血漿ウイルス血症のリバウンドを引き起こす潜伏HIV貯蔵所の存在である。長期ART中のHIV貯蔵所は、二次リンパ球器官、腸関連リンパ組織(GALT)、中枢神経系(CNS)を含むいくつかの組織区画でよく文書化されているが、肺は研究の領域として見落とされてきた。プレアート時代から3.しかし、肺はHIVの病因において中心的な役割を果たしている。実際、肺症状はエイズ関連の日和見感染症の最初の指標の一つであった4.現代のART時代でさえ、HIVを持つ人は、HIVを持たない人よりも感染性および非感染性肺疾患の両方を発症するリスクが高い。例えば、HIV感染者は、侵襲性連鎖球菌性肺炎感染症、ならびに慢性閉塞性肺疾患(COPD)5、6のリスクが高い。さらに、結核(結核)とHIVの共感染は、世界の特定の地域、特にサハラ以南のアフリカでは、HIV感染者がHIV7を持たない人よりも結核を有する可能性が16~27倍高いため、公衆衛生上の重要な課題である。肺感染症や慢性疾患に対するこの感受性に関するいくつかの説明が提案されているが、HIVを抑制した個人による正確な細胞機構は8、9、10である。血漿ウイルス負荷は、肺合併症のリスクが高いままで、完全には解明されていない。重要なことに、HIVは肺感染症および慢性疾患の非常に強い危険因子であり、喫煙状況6とは無関係である。
したがって、肺の免疫環境の分析は、健康および疾患におけるその役割を理解するために重要である。非侵襲的であるが、誘導された痰サンプルは、まれな肺リンパ球とAMを持つ大量の上皮細胞および破片を含む傾向があり、その役割は特定の用途に限定される。逆に、組織の大きな生検は、重大な出血および気胸(肺の崩壊)の関連リスクのために疑わしい疾患がない場合には得ることができない。さらに、肺免疫細胞の大部分は、主に呼吸中に抗原によって肺が継続的に刺激される粘膜レベルに位置しています。そのために、BAL液を得るための気管支鏡検査は、リンパ球およびAMへの比較的安全なアクセスを提供するという利点がある(図1参照)。マクロファージはBAL流体内の細胞の最大の割合を構成し、続いてリンパ球11が続く。したがって、免疫表現型、細胞培養、トランスクリプトミクス、またはそれ以上のアプリケーションなどの後続のアプリケーションで使用するためにBAL流体を処理する方法を確立することは有用である。ここで概説するBAL流体を処理するためのプロトコルは、前述の一般的な手順から適合され、採用される様々な下流アッセイ用に最適化されています。この方法論は、肺リンパ球と骨髄粘膜免疫細胞の両方の表現型および機能的特徴付けのための分離を可能にするだけでなく、HIVと一緒に住んでいる成人におけるHIV貯蔵所の評価を可能にする。
このプロトコルを確立するために、以下の基準を使用して、研究参加者15を募集しました。この研究に参加するには、(1)ARTに関する基準を満たすHIV感染者が少なくとも3年間、その人である必要がありました。(2)最低3年間のウイルス負荷(VL)を抑制した。(3) CD4 T セル数 ≥200/mm3;(4)スピロメトリーと気管支鏡検査の研究を受けることを喜んで。以下の基準を有する患者は、研究から除外された: (1) 気管支鏡検査への禁忌;(2)高出血リスク:凝固症またはワルファリンまたはクロピドグレル療法;(3) 血小板減少症 (低血小板);(4)活動的な肺感染症または他の急性肺プロセス;(5)妊娠/妊娠しようとしている。

<table><tbody><tr><td>70 & マイクロ;m 滅菌セルストレーナー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22363548</td><td>ナイロンメッシュフィルター 70 & マイクロ;</td></tr><tr><td>ACH-2細胞NIH</td><td></td><td>349</td><td>HIV-1潜伏T細胞クローンを1つの統合プロウイルスコピーでCD4を発現しない</td></tr>前にBALサンプルから不純物を除去するための細孔 <tr><td>BD FACSAria</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>セルソーター(16色を同時に検出するように設定)</td></tr><tr><td>BD LSRFortessa X-20</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A&nbsp;</td><td>フローサイトメーター(14色を同時に検出するように構成)</td></tr><tr><td>気管支鏡オ</td><td>リンパス</td><td>BF-1TH190&nbsp;</td><td>EEIII HD 治療用気管支鏡、チャネル幅 2.8 mm、外径 6.0 mm</td></tr><tr><td>細胞解離ソリューション</td><td>Sigma</td><td>C5914&nbsp;</td><td>接着細胞タイプをプラスチックまたはガラス表面から穏やかに除去するための非酵素製剤。</td></tr><tr><td>CD169&nbsp;BB515</td><td>BD Biosciences</td><td>565353</td><td>フローサイトメトリー用シアル酸結合分子抗体</td></tr><tr><td>CD14&nbsp;BV786</td><td>BD Biosciences</td><td>563698</td><td>フローサイトメトリー用エンドトキシン受容体抗体</td></tr><tr><td>CD206&nbsp;PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555954</td><td>フローサイトメトリーCD3に用いるマンノース受容体抗体</td></tr><tr><td>Alexa700</td><td>BD Biosciences</td><td>557943</td><td>フローサイトメトリー用T細胞共受容体抗体</td></tr><tr><td>CD4&nbsp;PE-Cy5</td><td>BD Biosciences</td><td>555348</td><td>フローサイトメトリー用T細胞共受容体抗体</td></tr><tr><td>CD45&nbsp;PE Cy-7</td><td>BD Biosciences</td><td>557748</td><td>フローサイトメトリーCD8</td></tr><tr><td>&nbsp;BV605</td><td>BD Biosciences</td><td>564116</td><td>フローサイトメトリー用T細胞共受容体抗体</td></tr><tr><td>CompBead Plus</td><td>BD</td><td>560497</td><td>Anti-mouse&nbsp;Ig、&kappa;&nbsp;フローサイトメトリーにおける蛍光補償の最適化に使用されるネガティブコントロールポリスチレン微粒子</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Invitrogen</td><td>18068015</td><td>一本鎖および二本鎖DNAを5'リン酸を含むオリゴデキシリボヌレオチドに分解して、RNA</td></tr><tr><td>dNTPセットから汚染を除去する 100 mM</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp;10297-018</td><td>PCR</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td> <td>Sigma</td><td>D8418</td><td>&nbsp;無極性、プロトン性溶媒</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Dnase I酵素活性を停止するために使用 Dnase I酵素活性を停止するために使用</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>080-150</td><td>プレミアムウシ胎児血清を補うために培地</td></tr><tr><td>FcRブロッキング試薬、ヒト</td><td>Miltenyi</td><td>130-059-901</td><td>細胞表面のFc受容体に結合し、フロー抗体</td></tr><tr><td>の非特異的結合を防ぎますFlowJo v10</td><td>FlowJo LLC</td><td>N/A</td><td>すべての解析に使用されるフローサイトメトリー解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>HLA-DR&nbsp;BV650</td><td>BD Biosciences</td><td>564231</td><td>フローサイトメトリーに使用されるMHCクラスII細胞表面受容体抗体</td></tr><tr><td>HyClone HEPES溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3023701</td><td>Buffer 生理学的pHの維持を提供する&nbsp;</td></tr><tr><td>ライブ/デッド&nbsp;APC-H7</td><td>Invitrogen</td><td>L34975</td><td>フローサイトメトリーに使用される生存率マーカー</td></tr><tr><td>リンパ球分離培地 (LSM)</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>350-000-CL</td><td>全血からのPBMCの単離のためのポリスクロース</td></tr><tr><td>フロスティ冷凍容器</td><td>ThermoFisher</td><td>5100-0001</td><td>凍結容器 -1 & °Cに非常に近い冷却速度を確保します。C/min、細胞保存に最適な速度</td></tr><tr><td>OneComp eBeads</td><td>Invitrogen</td><td>01-1111-41</td><td>PBMCサンプルの補償のための抗マウス、ラット、ハムスター抗体</td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>311-010-CL</td><td>細胞洗浄および染色用リン酸緩衝生理食塩水</td></tr><tr><td>PCRチューブ Corbett Rotor-Gene</td><td>Axygen</td><td>PCR-0104-C</td><td>4ストリップPCRチューブ、容量0.1 mL、Corbett Rotor-Geneと併用可能</td></tr><tr><td>PerfeCTa qPCR ToughMix</td><td>Quantabio</td><td>95112</td><td>DNAテンプレートのPCR増幅用の2倍濃縮すぐに使用できる反応カクテル&nbsp;</td></tr><tr><td>QiaAmp DNAミニキット</td> ゲノム、ミトコンドリア、細菌、寄生虫、ウイルスDNAを分離するための<td>Qiagen</td><td>51304</td><td>キットです。QIAamp Mini Spin Columns、QIAGEN Proteinase K、試薬、バッファー、コレクションチューブを含む</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>キット 最大 100 μ の精製用キット;g 細胞、組織、酵母由来の全 RNA。RNeasyミニスピンカラム、コレクションチューブ、RNaseフリー試薬およびバッファー</td></tr><tr><td>Rotor-Gene Q</td><td>Qiagen</td><td>9001550</td><td>リアルタイムPCRサイクラー</td></tr><tr><td>RPMI 1640 1x</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>350-000-CL</td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>滅菌水</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>809-115-CL</td><td>DNase、RNase、プロテアーゼフリー</td></tr><tr><td>Superscript&trade;III ワンステップRT-PCRシステム&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>12574018</td><td>1本のチューブでcDNA合成とPCR増幅の両方を行うRT-PCRキットです。SuperScript III RT/Platinum Taq Mix、2x Reaction Mix(各dNTPの0.4 mM、3.2 mM MgSO4を含む)、硫酸マグネシウム</td></tr><tr><td>Taq DNAポリメラーゼ&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18038-042</td><td>dNTPおよびプライマーの存在下で一本鎖テンプレートからDNAを合成する耐熱性酵素。Taq DNAポリメラーゼ、10x PCRバッファー、塩化マグネシウム</td></tr><tr><td>転写因子バッファーセット</td>、<td>BD Biosciences</td>、<td>フロー</td><td>サイトメトリーの細胞内染色用バッファー 562725が含まれています。固定/透過化バッファー、希釈剤バッファー、パーマ/洗浄バッファー、</td></tr><tr><td>血球計算盤を使用して細胞をカウントするための</td><td>トリパンブルー</td><td>シグマ</td><td>T8154</td>生存率色素が含まれています&nbsp;</tr></tbody></table>

肺胞マクロファージおよびcd4+t細胞免疫フェノタイピングおよびhiv貯蔵所評価のための気管支藻胞洗浄液および一致血液の処理

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

気管支鏡検査は、正常な生理食塩水を気管支鏡を介して肺に注入し、吸引を適用し、気管支肺胞洗浄(BAL)液を除去する医療処置である。BAL流体は細胞が豊富であり、したがって、肺免疫milieuの「スナップショット」を提供することができます。CD4 T細胞は、最高の特徴を持つHIV貯蔵所であり、肺胞マクロファージ(AM)を含む組織マクロファージもウイルス貯留部として機能することを示唆する強力な証拠がある。しかし、HIV貯水池の設置とメンテナンスの文脈におけるAMの役割については、まだ多くは不明です。したがって、BAL流体を処理して、肺内の細胞集団およびサブセットを特徴付け、評価するためにウイルス学的および免疫学的アッセイに使用できる細胞を得るためのプロトコルを開発することは、HIVとしての肺の役割を理解するのに関連する。貯水池。ここでは、このようなプロトコルについて説明し、単純遠心分離およびフローサイトメトリーなどの標準的な技術を用いる。CD4 T細胞およびAMは、免疫フェノタイピングおよびHIV DNAおよびRNA定量を含むその後の用途に使用されてもよい。

ほとんどの非喫煙者では、BAL液は無菌容器で受け取られ、わずかに濁った黄色とオレンジ色の液体である。ドナーが気管支鏡検査中に気管支内生検を受け、いくつかの出血が起こった場合、流体は色がピンカーである可能性があります。ドナーが喫煙者である場合、流体は色が暗くなることがあります。遠心分離の後、BAL上清はほぼ透明でわずかにオレンジ色になり、細胞ペレットはサンプルの状態とドナーが喫煙者であったかどうかに応じて、オフホワイトから非常に暗い茶色に色の範囲をすることができます。
BALサンプル全体をカウントする場合、直径17μm前後の大きな丸いマクロファージと直径18,19の約7.3μmの小さな丸いリンパ球を含む、異なる細胞タイプを可視化することができます(図2参照)。マクロファージは喫煙者で約40まで拡大される。細胞型の区別は、マクロファージとリンパ球を別々にカウントすることを可能にする。また、特に喫煙者からのサンプルでは、フィールドに見えるいくつかの破片があるかもしれません。マクロファージはBALの中で最も豊富な細胞型であり、非喫煙者20の細胞の約85%を占めており、喫煙者に富んでいるため、ほとんど排他的に見えるかもしれません。
BAL セルは凝集する傾向があるため、すべての操作中に適切に混合する必要があります。ペレットは、いくつかの洗浄ステップの後でも暗く見えることがあります。細胞選別のために染色した後の分数に糸状の破片が明らかな場合は、細胞選別機を通してそれらを実行する前に、70 μmフィルターを通して細胞を通過します。
BAL細胞の選別は、マクロファージを収容するのに十分な大きさの液滴サイズを確保するために、低圧で行う必要があります。細胞は、最初にすべてのCD45 +21細胞を含むようにゲートされ、次に、すべての死んだ細胞が除外されることを確実にするために生存率に基づいています(図3参照)。その後、単一細胞が選択され、この中で、2つの集団は、サイズと形態、すなわちより大きな骨髄細胞とより小さなリンパ球に基づいてゲートされます(図3参照)。より大きなセル内では、細胞はCD20622、23およびCD16922でゲートされ、二重陽性細胞はAMとしてソートされ、小さなセル内ではCD3+セルが選択され、CD4およびCD8上でゲートされます。 CD4単正および CD8 単一陽性細胞がソートされます (図 3参照)。使用されたマーカーは、前述のAMの表現型に基づいて選択した、例えばマンノース受容体CD206、咽頭細胞23、およびシアロゲシン受容体CD16922に見出される。
PBMCをソートする場合、細胞は最初に前方および側散乱にゲートされ、そのすべてが均質なリンパ球集団を示す必要があり、そのすべてがゼロ軸に近いノイズを除いて撮影される(データは示されていない)。集団は生存率およびCD45にゲートされ、生きているCD45+細胞が使用される。この人口は CD3 にゲートされます。単球を単球に単離するために、CD3-集団はCD14上でゲートされ、すべての単一陽性細胞がソートされる。リンパ球サブセットを単離するために、CD3+細胞はCD4およびCD8上でゲートされ、単一陽性および細胞集団の両方がソートされる。
<img alt="超高感度PCR法を用いたHIVリザーバー分析のための肺および血球分離図" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59427/59427fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図 1: プロトコルの概要。生成されたサンプルの潜在的なダウンストリーム使用を含む、プロトコルのワークフローを示す回路図。PBMC = 末梢血単核細胞;BAL = 気管支藻胞洗浄;LSM=リンパ球分離培地。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59427/59427fig1large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="白血球(L)、単球(M)、赤血球(RBC)を示す血液塗抹顕微鏡画像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59427/59427fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 図 2:BAL液全体の顕微鏡視野。(A)非喫煙者および(B)目に見えるリンパ球(L)、マクロファージ(M)、および赤血球(RBC)を有する喫煙者からの顕微鏡画像。倍率は1,000倍(10倍眼、油浸入100倍レンズ)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59427/59427fig2large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="フローサイトメトリー図、細胞集団ゲーティング、マーカー:CD45、CD3、CD4、CD8、CD169、CD206。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59427/59427fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 図 3:BAL細胞全体の細胞選別のための代表的なゲーティング戦略。ALVEolarマクロファージ(AM)、CD4、およびCD8 T細胞をBAL細胞全体サンプルからソートするために使用されるゲーティング戦略。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59427/59427fig3large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>サンプル</td>
			<td>抗体</td>
			<td>フルオロクロム</td>
			<td>クローン</td>
			<td>テストあたりの体積(μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">バルおよび PBMC</td>
			<td>ライブ/デッド</td>
			<td>APC-H7</td>
			<td>-</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>PE-サイ7</td>
			<td>こんにちは30</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>アレクサ700</td>
			<td>UCHT1</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4</td>
			<td>PE-サイ5</td>
			<td>RPA-T4</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>BV605</td>
			<td>SK1</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>BAL のみ</td>
			<td>CD206</td>
			<td>Pe</td>
			<td>19.2年</td>
			<td>10歳</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>CD169</td>
			<td>BB515</td>
			<td>7~239</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBMC のみ</td>
			<td>CD14</td>
			<td>バンブ786</td>
			<td>M5E2</td>
			<td>5</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:BALセル全体と単離されたPBMCのソートのためのフローパネル。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ターゲット</td>
			<td>ステップ</td>
			<td>プライマー名</td>
			<td colspan="4">プライマーシーケンス</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">HIV総DNAまたはHIV LTR-ギャグRNA</td>
			<td>プリアンプ化 PCR</td>
			<td>UR1</td>
			<td colspan="4">5'-CCA TCT CTC TCC TTC タグ C-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>ウルフ1</td>
			<td colspan="4">5'-ATG CCA CGT AAG CGA AAC TCT GGG TCT CTC TGG TTA GAC-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>リアルタイム PCR</td>
			<td>UR2</td>
			<td colspan="4">5'-CTG AGGガット CTC タグ TTA CC-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>ラムダット</td>
			<td colspan="4">5'-ATG CCA CGT AAG CGA AAC T-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>ウヒヴ・ファムゼン:</td>
			<td colspan="4">5'-//56-FAM/CA CTC AAG G/ZEN/C AAG CTT TGA GGC/3IABkFQ/-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3 DNA</td>
			<td>プリアンプ化 PCR</td>
			<td>HCD3 アウト 5'</td>
			<td colspan="4">5'-ACT GAC ATG GAA CAG GGG AAG-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>HCD3 アウト 3'</td>
			<td colspan="4">5'-CCA GCT CTG タグ GGA ACA TAT-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>リアルタイム PCR</td>
			<td>HCD3 in 5'</td>
			<td colspan="4">5'-GGCタットキャットTCT TCT TCA Agg T-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>HCD 3 in 3'</td>
			<td colspan="4">5'-CCT CTC TTC AGC CAT TTA AGT A-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>CD3 ファムゼン:</td>
			<td colspan="4">5'-/56-FAM/AG CAG AGA AGA A/ZEN/C AGT TAA GAG CCT CCA CCA T/3IABkFQ/-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>GUSB RNA</td>
			<td>プリアンプ化 PCR</td>
			<td>GUSBフォワード1:</td>
			<td colspan="4">5'-ACC タグ AAT CTG CTG GCT ACT A-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>GUSBリバース1:</td>
			<td colspan="4">5'- GTT CAAアカガットCAC ATC CAC ATA C-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>リアルタイム PCR</td>
			<td>GUSBフォワード2:</td>
			<td colspan="4">5'-TGC TGG CTA CTA CTT GAA GAT G-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>GUSBリバース2:</td>
			<td colspan="4">5'- CCT TGT CTG CTG CAT AGT タグ A-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>GUSB-HEX:</td>
			<td colspan="4">5'-/5HEX/TCGCTCACA/禅/CCAAAATCCTTGGACC/3IABkFQ/-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>表2:HIVDNAおよびRNA定量のためのプライマーおよびプローブ配列。

肺気管支胞洗浄液を処理し、慢性HIV感染者の末梢血を抗レトロウイルス療法で処理し、肺HIV貯留部を評価する方法を説明する。これらの方法は、超高感性ポリメラーゼ連鎖反応による免疫フェノタイピングおよびHIV DNA/RNA定量に使用できる、非常に純粋なCD4 T細胞および肺胞マクロファージの獲得をもたらす。

肺胞マクロファージおよびCD4+T細胞免疫フェノタイピングおよびHIV貯蔵所評価のための気管支藻胞洗浄液および一致血液の処理

Bronchoscopy is a medical procedure whereby normal saline is injected into the lungs via a bronchoscope and then suction is applied, removing ...

HIVは、細胞および解剖学的貯水池の持続性のために不治である。この方法は、肺から単離された免疫細胞のHIV貯留層評価を可能にする。この技術は、HIVの細胞貯留部としてさらなる表現性またはウイルス学的評価のために、BAL液から肺粘膜T細胞および肺胞マクロファージを単離することを可能にする。肺胞マクロファージとCD4陽性T細胞の生物学とHIVリザーバーへの貢献を理解することは、HIV治療が直面している課題に関する重要な洞察につながる可能性があります。BALからの主要なマクロファージの分離は、喘息および結核などの炎症性または感染性肺疾患を含む様々な他の研究分野に適用することができる。標準的なプロトコルに従って人間の患者からBAL液を得た後、バイオセーフティキャビネット内の50ミリリットルのチューブにサンプルを移す前に、元のコレクションチューブ内の流体を渦液。流体が非常に濁ったり、糸状組織によって汚染されている場合は、70マイクロメートルのナイロンメッシュフィルターを通してサンプルを新しい50ミリリットルチューブにフィルターします。遠心分離後、上清を新しい50ミリリットルチューブに移し、ピペットチップを使用してBAL細胞全体を含むペレットをそっと分解します。ペレットをRPMI 1640培地の1ミリリットルに再懸濁し、10個の1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管のそれぞれの予約上清の1ミリリットルを加える。残りの上清の10ミリリットルのアリコートを15ミリリットルの円錐管に加え、すべての上清サンプルをマイナス80°Cの貯蔵に入れます。元のサンプルの25ミリリットルごとに10ミリリットルの培地でペレット細胞懸濁液を希釈し、遠心分離によってBAL細胞を収集します。その後、10%の胎児ウシ血清(FBS)を添加した培地の1ミリリットルでペレットを再懸濁し、カウントする。BALおよび末梢血単核細胞全体の選別については、5つの細胞に5倍の5倍の10を5倍の5ミリリットルの丸底ポリスチレンチューブをサブセットごとに加え、染色されていない補償制御と生存性染色補償コントロールを行い、残りのサブセットサンプルを1つの5ミリリットルチューブに1本ずつ加えます。遠心分離によって細胞を収集し、それらが使用されるまで氷の上のチューブあたりPBSの100マイクロリットルでコントロールペレットを再中断します。細胞のペレットを20マイクロリットルのFc受容体遮断バッファーの20マイクロリットルで摂氏4度で1時間ずつ再懸濁し、非特異的結合を遮断する。ブロッキングインキュベーションの最後に、摂氏4度でさらに1時間のインキュベーションを目的とする適切な抗体カクテルを追加します。一次抗体インキュベーションの終わりに、遠心分離のために各チューブにPBSを1ミリリットル加え、選別するまで氷上の選別バッファーの250マイクロリットルでペレットを再中断します。補償制御を調製するために、PBSの1ミリリットル当たりの抗マウス免疫グロブリンκ補償ビーズと陰性対照補償ビーズをマイクロ遠心チューブにそれぞれ3滴ずつ加え、各サンプルに100マイクロリットルのビーズ溶液を移して補償に使用する。カクテル中の各抗体の1マイクロリットルをビーズを含む各チューブに1マイクロリットル加え、各生存性染色補償制御チューブに1マイクロリットルの生存性染色剤を加えます。光から保護された摂氏4度で20分後、チューブあたり1ミリリットルのPBSでサンプルを洗浄し、1チューブあたり新鮮なPBSの250マイクロリットルでペレットを再中断します。BALセルの非染色対照サンプルをフローサイトメーターにロードし、補償マトリックスを設定します。次にサンプルチューブをロードし、低圧で細胞をソートし、ノイズを除外し、生細胞およびCD45陽性細胞を含み、ダブレットを除外する。より大きな骨髄系の母集団の中で、CD206およびCD169二重陽性細胞を肺胞マクロファージとして並べ替える。小さなリンパ球集団内で、CD3陽性細胞を単離し、CD4およびCD8単一陽性集団を選別する。末梢血単核細胞試料を並べ替えるために、ゲートは、ノイズおよびダブレットを除外し、実証されるように生きたCD45陽性細胞を含む。CD3をゲーティングした後、CD3陰性、CD14陽性細胞をゲートして単一陽性単球を選別し、CD3陽性、CD4、およびCD8陽性細胞をゲートして、両方の単一陽性集団を選別します。BAL全体のサンプルを数えるとき、より大きい丸いマクロファージおよびより小さく、丸いリンパ球を含む異なった細胞タイプを視覚化することができる。マクロファージはBAL液中で最も豊富な細胞型であり、非喫煙者肺の細胞の約85%を占める。これらの細胞は、ほとんど排他的に見えるほど喫煙者に富んでおり、非喫煙者で観察されたマクロファージと比較して約40%拡大する傾向がある。BAL流体サンプルから肺胞マクロファージを選別するために用いられるマーカーは、貪食細胞およびシアロシェシン受容体CD169に存在するマンノース受容体CD206のような肺胞マクロファージの以前に記載された表現型に基づいて選択された。その分離後、肺胞マクロファージおよび他の細胞タイプは、フローサイトメトリー、免疫学的機能アッセイ、または超高感度PCRによるリザーバ定量による免疫整型に使用することができる。この技術は、歴史的に達成することが困難であった非常に純粋な組織居住マクロファージへのアクセスを可能にし、重要な免疫細胞集団の以前に達成不可能な検査を可能にする。

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