Name: Lyssaviruses の検出のための普遍的な入れ子逆転写ポリメラーゼ連鎖反応の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 学ぶライサウイルス検出のための入れ子RT-PCR法。9000件以上の動物脳標本で検証され、新鮮・劣化サンプル両方で高感度・高特異性を示す。臨床診断とサーベイランスに応用可能です。

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研究は、国家キー研究開発計画 (グラント 2016YFD0500401) と中国国家自然科学財団 (グラント 31302043) によって支援されました。

このプロトコルでのマウスの使用は、軍事獣医学研究所の動物福祉に関する管理委員会によって承認されました, 軍事医学アカデミー, 中国 (実験動物のケアと使用委員会の承認, 許可番号 JSY-DW-2010-02)。実験動物のケアと使用のためのすべての制度的および国家的ガイドラインに従った。
1. RNA 抽出
<ol><li>狂犬病の疑いのある脳組織から RNA を抽出し、皮膚生検、唾液、または CSF または RABV 感染細胞培養から、グアニジニウムイソチオシアナート-フェノール-クロロホルムベースの抽出方法または市販のウイルス RNA 抽出キットを使用した。調製した RNA をすぐに使用するか、必要になるまで-80 ° c で保管してください。</li>
</ol>2. ウイルス RNA の逆転写
<ol><li>表 1に記載されている RT 試薬を冷凍庫から取り出し、氷上に保管し、使用前にそれらを解凍し、渦を止めます。</li>
	<li>表 1に記載した試薬で 0.2 mL PCR チューブに12μ l の RT 反応混合物を調製します。マスターミックスのボリュームを必要以上に少なくとも1つの反応サイズを作成することによって、ピペットで変化させることができます。</li>
	<li>テンプレートルーム内の PCR ワークステーション内の RT 反応ミックスに、8μ l サンプル、ポジティブコントロール RNA、またはネガティブコントロールを追加します。RT 陽性対照は、固定 RABV 株 CVS-11 (チャレンジウイルス標準-11) で感染した細胞培養物から抽出した RNA を-80 ° c で保存した。ネガティブコントロールには、RNase フリーの ddH2O が含まれています。</li>
	<li>ボルテックスによって RT チューブの内容を混ぜる;その後、簡単に遠心分離する。</li>
	<li>サーマル・サーマルサイクラーにリアクションチューブをロードします。CDNA 合成プログラムを設定するには、42° c で90分、95° c を5分間、4° c 保留状態にします。反応量を20μ l に設定します。 RT 実行を開始します。</li>
</ol>3. 第1ラウンド PCR
<ol><li>表 2に記載されている PCR 試薬は、使用するまでクリーンルームで氷上に保管してください。その後、それらを解凍し、渦。</li>
	<li>表 2に記載されている試薬を使用して、0.2 mL pcr チューブに1回戦の pcr ミックスを準備します。</li>
	<li>CDNA またはプラスミドの2μ l サンプルを、テンプレートルーム内の PCR ワークステーション内の第1ラウンド PCR ミックスに追加します。PCR 陽性コントロールは、上記の RT 法のステップ2.3 で述べたように、CVS-11 cDNA を準備したものです。PCR 陰性コントロールは ddH です。</li>
	<li>表 3に記載されているパラメータを使用して、密封されたチューブを PCR サーマルサイクラーに移し、サイクルします。</li>
</ol>4. 第2ラウンド PCR
<ol><li>表 4に記載されている試薬を使用して、0.2 mL pcr チューブ内に2回戦の pcr ミックスを用意します。</li>
	<li>第2次 PCR ミックスに、第1ラウンド PCR 製品の3μ l を加えます。また、第2ラウンドPCR のネガティブコントロールとして ddH を含む。</li>
	<li>ステップ3.4 で示されているのと同じパラメータを使用して PCR 熱循環を実行します。</li>
</ol>5. アガロースゲルでの電気泳動による PCR 産物の分析
<ol><li>1.5% のアガロースゲルに 1.5 g のアガロースを 100 mL のトリス-アセテート-EDTA (テコンドー) に添加し、電子レンジで加熱して徹底的に溶解させることによって準備します。</li>
	<li>臭化エチジウム (EB) を追加 (最終濃度は 0.01%)または別の商業的 EB 置換。ゲルを鋳型に注ぎ、周囲温度で少なくとも30分間固化させるようにしておきます。</li>
	<li>各 PCR 製品の5μ l を1μ l のローディングバッファと混合して、ローディングサンプルを準備します。</li>
	<li>サンプルと適切な DNA マーカーをウェルに別々にロードし、120 V で約30-45 分間ゲルを泳動し、染料のラインがゲルの約 75%-80% になります。</li>
	<li>電源を切り、電源から電極を取り外し、ゲルボックスからゲルを慎重に取り外します。</li>
	<li>UV ゲルを文書化したデバイスを使用して、DNA 断片を視覚化して撮影します。</li>
</ol>6. ネスト型 RT-PCR の特性評価
<ol><li>
6.1のlyssaviruses プラスミドの検出に対する特異性と感度
	<ol>
<li>PCR のための各オーストラリアコウモリリッサウイルス (16 ICTV 種および2つの新規種) の完全な N 遺伝子を含む18の商業的プラスミドを注文する。</li>
		<li>アボガドロの数 (NA) と次の式を用いてプラスミドのコピー数を計算します。 [(g/μ l プラスミド DNA)/(bp x 660 のプラスミド長) x 6.022 x 1023 = 分子数/μ l</li>
		<li>DdH2O のすべての18のプラスミドの原液 (2.24 x 109分子/μ l) を調製します。</li>
		<li>DdH2o における全18プラスミドの 9 10 の連続希釈を行い、ddH2o の90μ l の各プラスミドストックの10μ l を希に希釈します。</li>
		<li>セクション3-5 で説明されているように PCR 増幅を行います。</li>
		<li>一連のオーストラリアコウモリリッサウイルスプラスミドを検出することにより、入れ子になった PCR の特異性と感度を分析します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
D の決定etectionlimit
	<ol>
<li>狂犬病ウイルス株 CVS-11 細胞培養の力価を 105.5 TCID50/mL (OIE マニュアルに従って決定されたウイルス力価)5に調整してください。</li>
		<li>ステップ6.1.4 で説明されているように CVS-11 (原液は 105.5 TCID50/mL) の 5 10 の連続希釈を行います。</li>
		<li>セクション1-5 に記載されているように、すべてのウイルス希釈物の RNA 抽出および枝分かれ RT-PCR 増幅手順を実行します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
示の isonはネストされたRT-PCR「ゴールドスタンダード」の脂肪
	<ol>
<li>入れ子になった RT-PCR によってすべての臨床サンプルを試験し、次いで、脂肪5および N 遺伝子配列9を用いて結果を確認する。</li>
		<li>SAS 9.1 の統計分析には、正規化されたデータを使用します。診断テスト (SAS コマンド: proc 周波数、テーブル/同意) の統計的比較のためのκテストとマクネマーのカイ二乗検定を使用します。Abinomial 分布を仮定して信頼区間を計算します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
劣化サンプルの試験における有効性の評価
	<ol>
<li>37° c で狂犬病になった犬の臨床脳組織サンプルを2つ明らかにします。</li>
		<li>アッセイは、ネストされた RT − PCR、脂肪、および MIT5によって37° c での曝露の各日に2つのサンプルを測定する。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+rabies%3A+a+disease+of+complex+neuropathogenetic+mechanisms+and+diagnostic+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges.</a> Lancet Neurology. 1 (2), 101-109 (2002).</li>
<li>Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taxonomy+of+the+order+Mononegavirales%3A+update+2018%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2018.</a> Archives of Virology. 163 (8), 2283-2294 (2018).</li>
<li>Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tentative+novel+lyssavirus+in+a+bat+in+Finland%5BTitle%5D)+AND+%22Transboundary+and+Emerging+Diseases%22%5BJournal%5D)">Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland.</a> Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).</li>
<li>Hu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyssavirus+in+Japanese+Pipistrelle%2C+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan.</a> Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).</li>
<li>World Organization for Animal Health (OIE). Chapter 2.1.17 - Rabies (infection with rabies virus and other lyssaviruses). Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2018. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.pdf">http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.pdf</a> 2-14 (2018).</li>
<li>Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+techniques+in+rabies%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Laboratory techniques in rabies.</a> World Health Organization. , 74-195 (2018).</li>
<li>Mani, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+real-time+Taqman+PCR+for+antemortem+and+postmortem+diagnosis+of+human+rabies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Utility of real-time Taqman PCR for antemortem and postmortem diagnosis of human rabies.</a> Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).</li>
<li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+technologies+for+the+detection+of+rabies+virus%3A+challenges+and+hopes+in+the+21st+century%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Emerging technologies for the detection of rabies virus: challenges and hopes in the 21st century.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (9), 530(2009).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+outbreak+of+pig+rabies+in+Hunan+province%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">An outbreak of pig rabies in Hunan province, China.</a> Epidemiology and Infection. 136 (4), 504-508 (2008).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+complete+genome+of+the+first+Irkut+virus+isolate+from+China%3A+comparison+across+the+Lyssavirus+genus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Phylogenetics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Analysis of the complete genome of the first Irkut virus isolate from China: comparison across the Lyssavirus genus.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 69 (3), 687-693 (2013).</li>
<li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+Transmission+of+Irkut+Virus+from+Dogs+to+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+and+Environmental+Sciences%22%5BJournal%5D)">Possible Transmission of Irkut Virus from Dogs to Humans.</a> Biomedical and Environmental Sciences. 31 (2), 146-148 (2018).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+outbreaks+caused+by+steppe-type+rabies+viruses+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Disease outbreaks caused by steppe-type rabies viruses in China.</a> Epidemiology and Infection. 143 (6), 1287-1291 (2015).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Livestock+rabies+outbreaks+in+Shanxi+province%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Livestock rabies outbreaks in Shanxi province, China.</a> Archives of Virology. 161 (10), 2851-2854 (2016).</li>
</ol>

作者は何も開示することはありません。

現在、RABV は、中国、および他の国でほぼすべての人間と動物の狂犬病に責任を負う主要なオーストラリアコウモリリッサウイルスです。さらに、IRKV 変異体は 201210年に中国北東部の吉林省のMユリナテスター leucogasterバットから最初に同定され、201711年に遼寧省で犬の死亡を引き起こすことが報告されています。最近では、2017年に中国台湾の日本の pipistrelle バットから、TWBLV の小説オーストラリアコウモリリッサウイルスも確認された。これらの結果は、他の lyssaviruses の効果的な検出が、コウモリが媒介する lyssaviruses の流出を防ぐためにも重要であることを示唆している。この点において、最も保存された N 遺伝子領域を標的とする汎オーストラリアコウモリリッサウイルスネスト RT-PCR は非常に有用なツールであり、その結果から、これまでに同定した16個の ICTV と2つの新規オーストラリアコウモリリッサウイルス種をすべて効果的に検出できることが示され...

狂犬病は、オーストラリアコウモリリッサウイルス属1内のウイルスによって引き起こされる世界的な人獣共通病である。Lyssaviruses (ファミリー Rhabdoviridae) は、5つのタンパク質 (N、エピレギュリンタンパク (P)、マトリックスタンパク質 (M)、糖タンパク質 (G)、および大タンパクまたはポリメラーゼ (L) をコードする約 12 kb のゲノムを持つ単一陰性鎖 RNA ウイルスです。N 遺伝子、遺伝的距離、および抗原パターンのヌクレオチド配列に基づいて、lyssaviruses は、16種に分けられ、古典的な狂犬病ウイルス (RABV) および狂犬病関連ウイルス (RRV) を含む: ラゴスバットウイルス (LBV)、Duvenhage ウイルス (DUVV)、Mokola ウイルス (MOKV)、欧州バットオーストラリアコウモリリッサウイルス 1 (EBLV-1)、欧州バットオーストラリアコウモリリッサウイルス 2 (EBLV)、オーストラリアバットオーストラリアコウモリリッサウイルス (ABLV)、Aravan ウイルス (ARAV)、生駒ウイルス (IKOV)、Bokeloh バットオーストラリアコウモリリッサウイルス (BBLV)、Gannoruwa バットオーストラリアコウモリリッサウイルス (GBLV)、Irkut ウイルス (IRKV)、ホジャンドウイルス (KHUV)、西コーカサスバットウイルス (WCBV)、シモニバットウイルス (SHIBV)、およびリェイダバットオーストラリアコウモリリッサウイルス (LLEBV)2.最近、2つの追加の lyssaviruses が同定されている: フィンランドのブラントのバット (Myotis brandtii) から分離した 20173と台湾バットオーストラリアコウモリリッサウイルス (TWBLV) から孤立した KOTALAHTI バットオーストラリアコウモリリッサウイルス (KBLV) は、日本の pipistrelle (Pipistrellus abramus) 2016 年に台湾、中国で-20174.
すべての哺乳類は狂犬病に感染しやすい。しかし、総病的病変または特定の臨床徴候はその同定を許可せず、診断は実験室5でのみ行うことができる。狂犬病診断のための最も広く使用されている方法は、WHO と OIE5,6によって金本位として考えられている脂肪である。それにもかかわらず、脂肪は、劣化/autolyzed 脳組織サンプルで信頼性の低い結果を生成することができます。さらに、それは脳脊髄液 (CSF)、唾液および尿のような生物的液体の標本を測定するのに使用することができないそれにより antemortem 診断7の雇用を主に排除。代替の従来の診断試験は、狂犬病組織培養感染検査 (RTCIT) およびマウス接種試験 (MIT) など、数日6を必要とし、迅速な診断が必須である場合の大きな欠点である。
種々の分子診断試験 (例えば、RT-PCR によるウイルス RNA の検出、PCR −酵素結合免疫吸着アッセイ、「PCR − ELISA」、インサイチューハイブリダイゼーション、およびリアルタイム PCR) は、狂犬病診断のための迅速かつ高感度な技術として使用されている8.ルーチン狂犬病診断には OIE が推奨しており、heminested (hn) PCR は、地上動物が lyssaviruses5をすべて検出するための診断検査とワクチンの oie マニュアルに記載されています。ここでは、オーストラリアコウモリリッサウイルスネストされた RT-PCR を説明し、脂肪によって得られたものと同等またはそれを超えるすべての18オーストラリアコウモリリッサウイルス種の特異的および高感度検出を可能にする。この方法の原理は、標的 RNA の RT (オーストラリアコウモリリッサウイルス N 遺伝子の保存領域) を cDNA に、続いて2ラウンドの PCR による cDNA の増幅である。CDNA は、845 bp フラグメントを増幅するために、外部プライマーを含む第1ラウンド PCR を行います。次いで、第2ラウンド PCR は、第1ラウンド PCR 産物を鋳型として使用して、内部プライマーを有する 371 bp フラグメントを増幅する。PCR の2つのラウンドは、アッセイの感度を有意に増加させる。

<table><tbody><tr><td>50 &times;TAE</td><td>Various</td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>6 &times; ローディングバッファ</td><td>TakaRa</td><td>9156</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>US Everbright&reg;株式会社</td><td>A-2015-100g</td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td>各種</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DL 2,000 マーカー</td><td>タカラ</td><td>3427A</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs (10 mM)</td><td>タカラ</td><td>4019</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs (2.5 mM)</td><td>タカラ</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>電気泳動システム</td><td>タノン</td><td>EPS300</td><td></td></tr><tr><td>Ex-Taq (5 U/&mu;L)</td><td>TakaRa</td><td>RR001</td><td></td></tr><tr><td>ゲルイメージングシステム</td><td>UVITEC</td><td>ファイヤーリーダー</td><td></td></tr><tr><td>マイクロセンティフュージチューブ</td><td>各種</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M-MLV逆転写酵素 (200 IU/&micro;L)</td><td>タカラ</td><td>2641A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 分光光度計</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>ND1000</td><td></td></tr><tr><td>オリゴ (dT)15</td><td>TakaRa</td><td>3805</td><td></td></tr><tr><td>PCRマシン</td><td>BIO-RAD</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>PCRチューブ</td><td>各種</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フュージョン ハイフィデリティDNAポリメアラーゼ</td><td>NEW ENGLAND BioLabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Pipettors</td><td>Various</td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>Random Primer</td><td>TakaRa</td><td>3801</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor (40 IU/&micro;L)</td><td>TakaRa</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>RNaseフリーddH2O</td><td>TakaRa</td><td>9102</td><td></td></tr><tr><td>Taq Buffer (10回)</td><td>TakaRa</td><td>9152A</td><td></td></tr><tr><td>のヒント</td><td>各種</td><td></td><td></td></tr><tr><td>各種ボルテックスミキサー</td><td>各種</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

lyssaviruses の検出のための普遍的な入れ子逆転写ポリメラーゼ連鎖反応の評価

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

ファミリー Rhabdoviridae内のオーストラリアコウモリリッサウイルス属の狂犬病ウイルスおよび他のメンバー種を検出するために、汎オーストラリアコウモリリッサウイルス入れ子逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (入れ子型 RT − PCR) を開発し、保存領域を検出した。lyssaviruses の核タンパク質 (N) 遺伝子の。この方法は、ウイルス RNA を鋳型として用いた逆転写 (RT)、およびオリゴ (dT)15およびランダム hexamers を、ウイルス相補 DNA (cDNA) を合成するためのプライマーとして適用する。次いで、このウイルス cDNA を、外部プライマーを用いた第1ラウンド PCR で 845 bp N 遺伝子断片を増幅させる鋳型として使用し、その後、第2ラウンドのネスト化 PCR を行い、内側のプライマーを用いて最終 371 bp フラグメントを増幅する。この方法は、狂犬病ウイルス (RABV) の異なる遺伝的クレードを検出することができます。この検証により、中国での臨床狂犬病診断およびサーベイランスの10年間における8つの家畜種からの9624の脳標本を用いて、その方法が直接蛍光と比較して 100% の感受性および 99.97% の特異性を有することを示した。抗体検査 (FAT) は、世界保健機関 (WHO) と世界動物衛生機構 (OIE) が推奨する金本位法です。さらに、この方法は、合成の模倣検出によって評価される、ウイルスの分類に関する国際委員会 (ICTV) の第10の報告書において、15件の他の承認された、および2つの新規オーストラリアコウモリリッサウイルス種の標的 N 遺伝子断片を特異的に増幅することもできる全ての lyssaviruses の N 個の遺伝子プラスミド。この方法は、狂犬病診断のための脂肪に代わる便利な手段を提供し、中国の国家標準 (GB/T36789-2018) として承認されています。

18個のオーストラリアコウモリリッサウイルス種を検出するための枝分かれ RT-PCR の結果を図 1に示す。すべての PCR 陽性コントロールは、第2ラウンド増幅の第1および 371 bp で予想される 845 bp を示し、ネガティブコントロールにはバンドがありませんでした。全ての 18 lyssaviruses が予想された845および/または 371 bp バンドを生産し、入れ子になった RT-PCR が全 18 lyssaviruses を検出したことを示した。16の lyssaviruses プラスミドは PCR の2つのラウンドで効率的な増幅を有していましたが、2、すなわち ARAV および IKOV は、第1または第2ラウンド PCR のいずれかで増幅していました。この方法の感度は、表 6に示すように、異なるオーストラリアコウモリリッサウイルスプラスミドの検出において変化し、2.24 x 100から 2.24 x 105分子/μ l までの範囲である。これらの違いは、ウイルス配列の多様性...

汎オーストラリアコウモリリッサウイルス入れ子逆転写ポリメラーゼ連鎖反応は、すべての既知の lyssaviruses を特異的に検出するために開発されました。異なる動物種の狂犬病脳サンプルを用いたバリデーションは、この方法が、金標準蛍光抗体検査と同等の感受性および特異性を有し、日常的な狂犬病診断に使用できることを示した。

Lyssaviruses の検出のための普遍的な入れ子逆転写ポリメラーゼ連鎖反応の評価

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

ネストされたRT-PCRは、承認されたすべての16のICTVおよび2つの新しいリッサウイルス種を含むすべてのリサウイルスを検出するために開発されました。この方法の検証は、中国における臨床狂犬病の診断と監視の10年間で9000以上の動物の脳標本を使用することによって証明されています。入れ子になったRT-PCRは、新鮮な脳組織サンプルだけでなく、劣化したサンプルにも信頼できる結果を生み出すことができます。この方法の浸潤は、脳脊髄液、唾液、尿などの生体液検体をアッセイするために使用することができ、それによりこの方法を最後通告診断に適用することができる。PCRの持ち越し汚染を最小限に抑えるためには、負および肯定的なコントロールを準備することが重要です 対策を講じるのは本当に重要です。例えば、各RNA抽出の必要な準備、PCRのセットアップ、ゲル電気泳動は物理的に別々の領域で操作する必要があります。また、ペプチド鎖への狂犬病汚染を防ぐために、RNA抽出および逆転写にスパイラルテープを使用することも推奨されます。氷上での薬剤の調製、手袋の交換、リボヌクレアーゼフリー材料の使用などの適切な取り扱いにより、リボヌクレアーゼの導入を防止し、RNAの分解を排除します。この手順を開始するには、狂犬病の疑いのある組織、皮膚生検、唾液、脳脊髄液またはRABV感染細胞培養からRNAを抽出する。準備ができたら、必要な試薬を冷凍庫から取り出し、氷の上に保管します。使用前に各試薬を解凍し、渦を出してください。ウイルスRNAのcDNAへの逆転写については、清浄な状態でのテキストプロトコルの表1に概説されているように、氷上の各サンプルに対して12マイクロリットルの反応ミックスと1.5ミリリットルの遠心分離管を調製する。ピペッティングのバリエーションを考慮するために、マスターミックスの少なくとも1つの必要以上の大きさの反応を準備し、その後、0.2ミリリットルのPCRチューブに反応ミックスを分割します。テンプレートルームのPCRワークステーションで、サンプルまたはコントロールの1つの8マイクロリットルを反応ミックスに追加します。陽性対照は、固定RABV株CVS11に感染した細胞培養物から抽出されたRNAであり、陰性対照にはRnaseフリーの二重蒸留水が含まれる。最初の渦を、次に短い遠心分離によって各管の内容物を混ぜます。この後、反応管をサーモサイクラーに積み込みます。テキストプロトコルで概説されているように、cDNA合成プログラムを設定して実行します。まず、必要な試薬を取り出し、使用できる状態になるまで、クリーンルームで氷の上に保管します。準備ができたら、試薬を解凍し、渦を出します。次に、テキストプロトコルの表2に示すように、各サンプルに対して48マイクロリットルの第1ラウンドPCRミックスを1.5ミリリットル遠心管で調製し、反応ミックスを0.2ミリリットルPCRチューブに分割します。テンプレートルームの PCR ワークステーションで、cDNA の 2 マイクロリットルサンプルを 1 回目の PCR ミックスに追加します。正の対照としてCVS11 cDNAの2マイクロリットル、負の対照として二重蒸留水の2マイクロリットルを含める。次に、テキストプロトコルの表3に示したパラメータを使用して、密封チューブをPCRサーモサイクラーに移し、サイクルします。まず、テキストプロトコルの表4に示すように、サンプルごとに48マイクロリットルの第2ラウンドPCRミックスを1.5ミリリットル遠心管に調製し、反応ミックスを0.2ミリリットルPCRチューブに分割します。第 1 ラウンド PCR 産物の 2 マイクロリットルを第 2 ラウンド PCR ミックスに追加します。この PCR ラウンドの負のコントロールとして二重蒸留水を含めます。次に、テキストプロトコルの表3に示したパラメータを使用してPCRサーモサイクリングを実行します。まず、1.5グラムのアガロースをトリス酢酸EDTAの100ミリリットルに加え、電子レンジで加熱して十分に溶解します。次に、0.01%の最終濃度で臭化エチジウムを加え、ゲルを金型に注ぎ、少なくとも30分間周囲温度で固化させます。各PCR産物の5マイクロリットルを6xローディングバッファの1マイクロリットルと混合して、ローディングサンプルを準備します。別にサンプルと適切なDNAマーカーをウェルにロードし、染料ラインがゲルを約75〜80%下げるまで120ボルトで約30〜45分間ゲルを実行します。実行が完了したら、電源を切り、電源から電極を取り外します。その後、ゲルボックスからゲルを慎重に取り除きます。UVゲルの文書化装置を使用して、DNA断片を可視化し、撮影します。テキスト プロトコルで説明されているように、入れ子になった逆転写 PCR を特徴付けます。18種のリサウイルス種を検出する代表的なネストされたRT-PCRの結果をここに示す。PCR陽性制御は、第1ラウンド増幅で845塩基対、第2ラウンドの371塩基対で予想されるバンドを示す。負のコントロールにはバンドが表示されません。18個のリサウイルスはすべて、陽性対照と同じ2つのバンドを産生することが分かっているため、入れ子になったRT-PCRが18個のリサウイルスすべてを検出したことを示している。プラスミドの16は2ラウンドのPCRで効率的な増幅を有するが、そのうちの2つ、アラバンウイルスおよび生駒ウイルスは、それぞれ第1または第2のラウンドでのみ増幅される。この方法の感度は、異なるリサウイルスプラスミドの検出において、マイクロリットル当たり2.24~240分子の範囲の値からさまざまです。これらの違いは、ウイルス配列の多様性によるプライマーとテンプレートの間の不一致に起因する可能性があります。入れ子になったPCRによってテストされた臨床検体の9,624個の脳組織とFATでテストされた組織の比較は、ネストされたRT-PCRが100%の感受性および99.97%の特異性であることを示し、2つの方法間の適合性は99.07%の他の狂犬病研究所がネストされたRT-PCRをさらに検証するためにテストを行うように招待された。10の研究所は、すべて、偽陰性や偽陽性を持たないFATに従って100%の入れ子になったRT-PCRの結果を得て、入れ子になったRT-PCRは高い特異性と再現性を有することを示す。狂犬病技術を使用するために、OIEがRT-PCRを推奨するようになりました。そして、私たちの入れ子になったRT-PCRは、2018年に中国の狂犬病技術の国家標準として証明されています。

evaluation-universal-nested-reverse-transcription-polymerase-chain

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

このビデオでは、リアルタイムの逆転写PCRを使用してウイルス感染を検出するための定量的な方法を示しています。逆転写ステップでは、RNAがcDNAに変換され、PCRサイクルによって増幅されます。サンプル中のウイルスRNAの存在は、PCRから得られたDNAの増幅曲線と解離曲線を分析することによって確認されます。...

ウイルス感染の診断のためのリアルタイム定量的逆転写PCR

このビデオでは、2つのプライマーセットを使用した2つの連続的なPCR増幅プロセスで構成される手法であるネストポリメラーゼ連鎖反応について説明しています。プライマーの第1のセットは、第2のセットの上流の配列にアニーリングすることを意図しており、その結果、特定の遺伝子配列の選択的増幅がもたらされます。このPCRは、通常のPCRよりも感度と特異性が高く、さまざまな疾患の検出技術として広く使用されています。...

特定のウイルスゲノム配列を検出するためのネストPCR

初期 3' 末端の公平な測定だけでなく、単一座礁させた DNA の分子の変異プロファイルを提供するディープ シーケンス アプローチをご紹介します。メイン アプリケーションは、初期のレトロ ウイルス相補的 Dna (Cdna)、レトロ...

決定の 3' 末端と HIV-1 の間に初期の一本鎖のウイルス DNA 分子のシーケンスを逆に感染細胞における転写

このプロトコルは、台湾のコウモリにおけるリッサウイルス抗原の診断試験のための標準的な実験室操作手順を導入する。...

台湾におけるコウモリ集団のリッサウイルスサーベイランスに関する標準的な手術手順

dsDNAインターカリング色素を用いてこのリアルタイムRT-PCRは、リサウイルス感染の診断に適しています。この方法は、狂犬病から抽出されたRNAから始まり、マンテモーテムまたは死後サンプル、マスターミックス調製、RNA添加、リアルタイムマシンのセットアップ、結果の正しい解釈を詳細に説明します。...

狂犬病診断のためのパンリサウイルスリアルタイムRT-PCR

脳生検サンプリングから最終解釈まで、迅速な免疫クロマトグラフィー診断検査(RIDT)を用いて、現場条件下での動物狂犬病の死後診断のための完全なプロトコルを提示する。また、分子解析やウイルス遺伝子作成用の装置を用いたさらなる応用についても説明する。...

フィールド死後狂犬病は、さらなる分子用途を用いた資源限定設定のための迅速な免疫クロマトグラフィー診断試験

プロトコルは間違いが傾向があるPCRおよび逆の遺伝学を使用して完全長の突然変異体のRNAの統合の結合によって肝炎のウイルスのゲノムの制御可能な遺伝の多様性をもたらすための方法を記述する。この方法は、表現型選択のモデルを提供し、長さ10...

ポジティブセンスRNAウイルス変異体を改変するためのリバースジェネティクス

ここでは、逆転写ループ媒介等温増幅(RT-LAMP)によりヒトサンプル中のSARS-CoV-2ウイルスを検出する方法を標準化し、実装するための完全なプロトコルを提供します。この方法は60分以内に完了し、低コストで安価な機器を使用して、あらゆる検査室やポイントオブケアに適応できます。...

逆転写ループを介した等温増幅によるSARS-CoV-2ウイルスの検出

一般的な呼吸器系ウイルス用の2つのプローブベースのワンステップRT-qPCRキットを紹介します。最初のアッセイは、SARS-CoV-2(N)、インフルエンザA(H1N1およびH3N2)、およびインフルエンザBに対するものです。2つ目は、SARS-Cov-2(N)とMERS(UpEとORF1a)です。これらのアッセイは、あらゆる専門ラボでうまく実施できます。...

SARS-CoV-2、インフルエンザA/B、MERS-CoVを検出するためのマルチプレックスリアルタイムRT-qPCRアッセイの開発

このプロトコルは、一部の非狂犬病リッサウイルスおよびラゴモルフのアッセイ性能を改善するためのプライマー配列および製剤の更新を含む、組織収集から結果の解釈までの汎リッサウイルスLN34リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)アッセイを実証しています。また、シングルウェルLN34マルチプレックス(LN34M)フォーマットのアッセイセットアップのデモも行います。...

更新されたマルチプレックスLN34リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応アッセイによる動物の狂犬病の死後診断

学ぶライサウイルス検出のための入れ子RT-PCR法。9000件以上の動物脳標本で検証され、新鮮・劣化サンプル両方で高感度・高特異性を示す。臨床診断とサーベイランスに応用可能です。

Lyssaviruses の検出のための普遍的な入れ子逆転写ポリメラーゼ連鎖反応の評価

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