iPSC由来筋前駆体におけるジストロフィン発現の回復に関するCRISPR/Cas9技術

デュシェンヌは筋ジストロフィーで、筋肉前駆細胞の早期排気を引き起こす。これは、最も重度の筋ジストロフィーの一つです。機能的な筋肉再生を促進するために、CRISPR/Cas9媒介遺伝子編集を用いて、誘導多能性幹細胞由来筋前駆細胞におけるジストロフィン発現を回復させます。

CRISPR-Cas9遺伝子編集は、ジストロフィン遺伝子発現を回復する可能性を秘めています。自己iPSC由来の筋前駆細胞は、幹細胞の毛穴を補充し、損傷を修復し、免疫応答を引き起こすことなくDMDのさらなる合併症を防ぐことができます。筋原性前駆細胞へのiPS細胞の異なる薬剤は、iPS細胞における腫瘍再発生のリスクを減少させた。

自家誘導多能性幹細胞由来の筋前駆細胞とCRISPR-Cas9媒介性遺伝子矯正を組み合わせたいくつかの治療法は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー治療戦略を有望である。この技術は、心臓、脳、血液疾患を含む自己幹細胞を遺伝的に編集することによって、多くの先天性疾患を治療するために使用することができます。我々は、このアプローチのデモンストレーションは、読者に細胞リプログラミングと遺伝子編集の取り扱い経験を提供できることを示した。

逆顕微鏡の下で、感染したマウス胚性幹細胞のコロニーを調べる。皿の底にあるコロニーを自己インクオブジェクトマーカーでマークします。マークされた細胞コロニーを覆うためにグリースクローニングリングを適用します。

各クローニングリングに0.05%トリプシン-EDTAの100マイクロリットルを加え、5分間摂氏37度のインキュベーターにプレートを置きます。次に、100マイクロリットルのピペットチップを用いて消化した細胞を、250ミリリットルのMES増殖培地を含む48ウェル培養プレートに移す。5%の二酸化炭素と85%の湿度で37°Cインキュベーターで細胞をインキュベートします。

彼らは70%合流を読むとき, よく成長した細胞を持つ井戸を選択し、30分間消化するためにTVP溶液の250ミリリットルを追加します。次に、各ウェルから6センチメートルの皿に細胞培養を移す。クローニングリングとインキュベーションを繰り返し、均一で寮状のクローンが得られるまで繰り返します。

次に、1ミリリットルのTVP溶液を加えて、準備したマウスiPSCを消化します。フィブロネクチンとゼラチンでコーティングされた24ウェルプレートに細胞培養液を移し、5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベートする。細胞が50%合流した後、ポリブレン当たり8マイクログラムを含む500マイクロリットルの新鮮な培養培地に切り替えます。

次に、マウスiPSCにレンチウイルス粒子溶液の100マイクロリットルを加える。5%の二酸化炭素で摂氏37度で3日間細胞をインキュベートする。次に、24時間以内に殺滅率が半分であるブラストシジンおよびハイグロマイシンBの最小濃度を決定する。

1ミリリットルブラストシジンあたり2.5マイクログラム、1ミリリットルハイグロマイシンBあたり100マイクログラムの培地を細胞に加え、3日間待ち、感染細胞を刺すように付着したままの細胞を選択します。選択したマウスiPSCを0.5ミリリットルのTVP溶液で消化し、それぞれが新しい24ウェルプレートで、セルを摂氏37度で30分間インキュベートし、5%の二酸化炭素を加えます。次いで、iPSCを単一細胞にピペットし、細胞計数チャンバーを有する細胞を数える。

約150個の消化単一細胞を選択し、MES培地で10センチメートル皿に希釈し、5%の二酸化炭素で摂氏37度で培養する。約10日後、逆顕微鏡の下で、10マイクロリットルの無菌ピペットチップを使用して単一のコロニーを選び、各コロニーを96ウェルプレートのTVP溶液の50マイクロリットルに移します。37°Cで30分間消化します。

CRISPR/Cas9編集による多能性幹細胞の収穫を成功させるためには、信頼性の高い手動クローニングピッキングが不可欠です。その後、消化した細胞を各ウェルから別の2つの96ウェル培養プレートに移して分割します。70%コンフルエントまで摂氏37度でインキュベート。

70%合流の細胞コロニーで、96ウェルプレート内の培地を取り除きます。1%のプロテイン酵素K溶液を含む25マイクロリットルの溶解試薬を各ウェルに加え、溶解液を別の96ウェルPCRプレートに移します。PCRプレートを粘着シールで密封し、サーマルサイクラーでプレートを摂氏55度で30分間インキュベートし、摂氏95度で45分間摂氏95分で細胞を溶性し、プロテネラーゼKを変性させる。、およびDMD Exon23プライマーの1マイクロリットル。

原稿に従ってPCR反応を開始します。次いで、2.2マイクロリットルの負荷バッファーを供給したPCR反応を2%アガロースゲルにロードします。ゲルを100~150ボルトで30分間実行し、UV光下でゲルを検査します。

このプロトコルでは、変異体Exon23に隣接する2つのガイドRNAが設計されました。Cas9媒介性二本鎖破断および非相同的な終末結合後、変異体Exon23が削除され、切り捨てられたが機能的なジストロフィン産生を可能にした。トリプシン溶液の漏れを避けるために、我々はリングの底に均等にグリースを適用する必要があります。

CRISPR/Cas9ゲノム編集とトットオンMyoD活性化システムの組み合わせは、遺伝子回収基底前細胞を有するデュシェンヌ型筋ジストロフィー患者における自己移植のための安全で実現可能かつ効果的な戦略を提供します。