Name: DREADD制御神経活動の慢性操作に対する非侵襲的戦略 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 s
Description: 学ぶDREADDによるマウス神経活動の非侵襲的慢性制御法。点眼薬と飲水によるCNO投与により動物のストレスを最小化し、長期的な神経活性化を実現する実験プロトコルを解説します。

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この研究は、国立精神衛生研究所(ZIA MH002964-02)の内部研究プログラムによって支援されました。NIMH IRPげっ歯類行動コア(ZIC MH002952)のサポートに感謝します。

全ての動物は、国立精神衛生研究所(NIMH)の動物ケア・使用委員会のガイドラインに従って取り扱われました。痛みと使用される動物の数を最小限に抑えるためにすべての努力がなされました。
1. 海馬におけるアデノ関連ウイルス注射
注:混合背景の野生型雄マウス(B6/129 F1ハイブリッド、生後3ヶ月)は、海馬にM3ムスカリン受容体(hM3Dq)をコードするAAVを定体的に注入した。全体の実験の間、マウスは、通常の12時間の光の下で、単一の収容された:12時間暗い(T24)サイクル、食物および水のアドリビタムへのアクセスと。
<ol><li>立体手術を行う前に、ステレオタキシックフレームとすべての必要な器具をきれいにし、殺菌します。 注:外科ドレープは、無菌フィールドを維持し、マウスの熱損失を減らすために使用することができます。</li>
	<li>イソファランを用いてマウスを深く麻酔する。これを行うには、まず酸素流量計を約1.5L/分に調整し、次にイソファリン気化器を誘導で約3~5%、メンテナンス用に約1~3%に調整します。<ol>
<li>動物が完全に意識不明であることを確認するには、マウスの足をつまみます。ピンチに対するフリンチング応答が存在しない場合、動物は適切に麻酔される。</li>
	</ol>
</li>
	<li>マウスの体温の安定性を維持するために、加熱パッドにマウスを置きます。</li>
	<li>頭の上を剃り、マウスの頭部をステレオタキスティックフレームに固定します。次いで、眼保護潤滑剤を目に塗布し、ポビドンヨウ素と70%エタノールで洗って表面をきれいにし、無菌メスを使って頭蓋骨を露出させる。</li>
	<li>フレームをブレグマポイントに調整し、2.9 mm の中間横座標と前部座標 -2.7 mm でドリルして海馬をターゲットにします。 注:他の脳標的を注入する必要がある場合は、Paxinosとフランクリンマウスアトラス16を使用して注射のための所望の座標を決定します。</li>
	<li>脳が露出したら、マイクロインジェクターを用いて海馬に-3.0mmの背部腹部深さでAAVの90nLを一方的に注入し、マイクロキャピラリーピペットを引っ張る(図1A)。 注:この実験で使用したAAVのツタについては、材料の表を参照してください。他の脳領域については、必要に応じて注射の AAV ボリュームを調整します。</li>
	<li>外科的処置の終わりに、ナイロン縫合糸で切開を閉じ、創傷部位に局所抗生物質を適用する。</li>
	<li>手術直後に全身的に鎮痛薬(ブプレノルフィン、0.1mg/kg)を投与し、4~6時間後に投与する。</li>
	<li>注射後4週間を開始し、以下のセクションに記載の任意のパラダイムにマウスを対象化し、デザイナー興奮性受容体を発現するニューロンを慢性的に制御する。</li>
</ol>2. 点眼薬を用いて反復的なCNO送達
<ol><li>点眼剤の投与前に3〜4日間、各マウスを毎日3分間スクラッフィンで取り扱いに順応させる。</li>
	<li>無菌0.9%生理液の1mLにクロザピン-N-酸化物(CNO,5mg)を溶解する(ストック溶液:5mg CNO/mL)。溶液を4°Cで冷蔵しておきます。</li>
	<li>実験を開始する前に各マウスの重量を量り、配信する CNO の量を決定します。1-3 μL ドロップ(眼あたり)を使用して、1.0 mg CNO/kg の体重を達成します。 注:例として、20gのマウスは、両側(各2μL)点眼薬を受け取る必要があります。</li>
	<li>マウスの不活性(光)相の間に点眼剤を送送り、2時間前にライトが消灯する前に(ツァイトゲーバー時間(ZT)10)を送る)マウスのアクティブな(暗い)段階でCNOを送達する必要がある場合は、適切な動物の取り扱いのために薄暗い赤色光の存在を確認してください。 注:実験動物の概日(および明るい/暗い)サイクルを混乱させないように注意する必要があります。<ol>
<li>P10マイクロピペットを使用して、CNO溶液の必要量(1-3 μL)をロードし、1.0 mg CNO/kgを達成します。 注:各点眼に新しい無菌ピペットチップを使用してください。この一連の実験では、CNOの両側点眼剤が行われた。しかし、より低いCNO濃度が必要な場合は、一方的な点眼薬も適用することができます。</li>
		<li>スクラフトを介してマウスを固定します。</li>
		<li>ピペット先端に安定した液滴が形成されるまで、溶液をゆっくりと排出します。</li>
		<li>溶液が提供されるまで、マウスの目の角膜に注意深く液滴を持参してください。ピペットの先端は、マウスの目に接触してはなりません。</li>
		<li>マウスを放し、ホームケージに戻します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>この手順を毎日 5 日間繰り返します。 注: この期間は、実験要件に応わせて調整できます。</li>
	<li>対照実験では、シャム処理を施したAAV/DREADD注入マウス(生理食塩水のみを含む点眼剤)を使用し、記載されたCNO点眼球プロトコルに曝露した空のベクター(例えば、AAV/mCherry)を注入したマウスを用いる。</li>
</ol>3. 飲料水による慢性CNO治療
<ol><li>50 mL(プラスチック)円錐管とゴム製ストッパースパウトを使用して小さなボトルを作ります。CNOの安定性に光媒介効果を避けるためにアルミニウム箔でカバーします。</li>
	<li>CNO治療を開始する3日前に、通常の水ボトルを10mLの通常の水を含む小さなボトルに置き換え、マウスがそれらに順応できるようにします。テープを使用してボトルをケージに固定します。</li>
	<li>各マウスの毎日の水消費量を測定します。</li>
	<li>実験を開始する前に、各マウスの重量を量ります。</li>
	<li>クロザピン-N-酸化物(CNO,5mg)を0.9%無菌生理生理液の1mLで溶解する。ストック溶液を4°Cで冷蔵します。</li>
	<li>体重と消費水の平均量を使用して、1.0 mg CNO/kg (体重) を達成するために CNO 溶液の濃度を定義します。 注:成人雄マウス(体重約20g)は1日当たり約5mLの水を消費する(図2A)。したがって、1 mg CNO/kgのCNO濃度を達成するために、CNOストック溶液の6.4 μLを水の最終体積に加える必要があります(最終濃度:4 μg CNO/mL)。したがって、1日あたり5mLの水を飲む20gの動物に対するCNOの用量は、1mg CNO/kgをもたらす。</li>
	<li>濃度の範囲をテストすることにより、最小限のCNO濃度で最大の有効性を表示する最適なCNO用量を決定します。用量応答分析を実行して、飲料水法に最適なCNO用量を決定します。 注:次のCNO用量は、この実験のためにテストされました: 1.0 mg/ mL, 0.5 mg/ mL, 0.25 mg/ mL, 0.1 mg/ mL, 生理生殖, .1.0 mg CNO/kg は、i.p. および点眼プロトコルに基づいて最初にテストされました。</li>
	<li>1日目に、通常の水の8 mLでボトルを充填し、CNOの必要量を追加します。 注:この量の水は、成人男性マウスのためのアドリビタム水アクセスの24時間のために十分です。他のげっ歯類種を使用する場合は、まず毎日消費される水の量を測定して、必要な量を決定します。</li>
	<li>プロトコル全体の動物の健康を監視し、水+CNO消費によって引き起こされる副作用がないことを確認します。</li>
	<li>24時間後、ボトルを淡水+CNO溶液に交換します。前日に消費されたボリュームを記録します。</li>
	<li>廃棄物容器に入れられなかった水+CNO溶液を廃棄する。ペットボトルを捨て、動物施設のガイドラインに従って消毒した後、毎日ゴムストッパーを交換してください。 注:有機溶剤と水性廃棄物を混ぜないでください。保管およびピックアップの手順については、化学処理サービスにお問い合わせください。</li>
	<li>ボトルを毎日5日間同じ時間に交換してください。 注: この期間は、実験要件に応わせて調整できます。</li>
	<li>手順 2.6 で説明するように、制御グループを含めます。</li>
</ol>4. スクロースに対するマウスの好みを用いての制限されたCNO治療
<ol><li>CNO処理を開始する3日前に、10mLの水+1%ショ糖を含む小さなボトルをケージに置き、好ましくは元の水ボトルから離します。 注: 手順 3.1 で説明されているのと同じ小さなボトルを使用します。</li>
	<li>活動期の最後の部分(ZT 18-24)の間に動物を水+1%ショ糖にさらす。この露出の後、ケージから水+ショ糖でボトルを取り出します。 注: CNO 配信の異なる時間枠を使用できます。さらに、マウスは、CNO送達を容易にするために夕方の時間に光の発症が起こる反転光/暗いサイクルの下に置くことができる。</li>
	<li>各マウスの毎日の水+1%ショ糖消費量を測定します。</li>
	<li>実験を開始する前に、各マウスの重量を量ります。</li>
	<li>体重と水の平均量 + 1% ショクロースを使用して、1.0 mg CNO/kg (体重) を達成するために CNO 溶液の用量を決定します。 注:ステップ3.6で説明されているように、最小限のCNO濃度で最大有効性を表示する最適なCNO用量をテストする必要があります。</li>
	<li>1日目に、ボトルに5 mLの水+1%ショ糖+CNO(1mg CNO/Kg)を充填し、決定された時間枠の間にケージ(常に同じ場所)に置きます。</li>
	<li>制限された時間枠の終わりに、ボトルを取り外し、消費される水+ショ糖+CNOの量を測定します。 注: マテリアルとソリューションは、手順 3.11 で前述したように、サニタイズまたは廃棄されます。</li>
	<li>この手順を毎日 5 日間繰り返します。 注: この期間は、実験要件に応わせて調整できます。</li>
	<li>手順 2.6 で説明するように、制御グループを含めます。</li>
</ol>5. データ分析
<ol><li>最後の反復(5日目)CNO点眼を受けた後、4%パラホルムアルデヒド(PFA)を2または6時間で心内に透過するマウスを透過する。CNOが飲料水を通して送達されるとき、マウスの活動期の終わりにCNO +水を水に置き換え、CNO後2または6時間のアクセスの後にマウスを通して注入する。 注:光暴露が対象領域のc-Fos誘導に影響を与える可能性がある場合は、実験の最終日と灌流の前に、マウスを一定の暗闇の中に保ちます。</li>
	<li>慎重に脳を解剖し、9-12hのための4%のPFA溶液に浸す。</li>
	<li>PFA固定後、30%のショ糖溶液を使用して脳組織を凍結保護し(脳が沈むまで待つ)、次いでクライオスタットを使用して脳を切り離す。</li>
	<li>冠状脳切片(35μm)を室温で1x PBS、10%ウシ血清アルブミン、0.3%トリトンX-100を含む溶液に移します。</li>
	<li>一晩4°Cの抗C-Fos(1:2500)抗体溶液で脳切片を一定の撹拌でインキュベートします。</li>
	<li>1x PBSと0.3%のトリトンX-100を含む溶液でそれぞれ5分間3回洗った後、Alexa結合二次抗体(1:500)溶液でサンプルを、光から離れ、一定の撹拌で室温で1時間インキュベートします。</li>
	<li>共焦点顕微鏡を用いてデジタル画像を取得する。写真編集および分析ソフトウェア(例えば、Adobe Photoshop)を使用して、キャプチャした画像を組み立てて処理します。</li>
	<li>データ解析では、ImageJソフトウェアを用いてAAV感染領域(mCherry(+)細胞)の輪郭と測定を行い、この領域内のc-Fos(+)細胞の数を定量化して、領域あたりの活性化細胞数を得る。動物ごとに3つの別々のセクションから得られた結果を組み合わせます。</li>
</ol>

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</ol>

著者は何も開示していない。

DREADDsは、ニューロン活動を遠隔操作する一般的で効果的なアプローチとして登場しました 17.CNO 配信の代替戦略の設計は、特定の実験設定で使用できるオプションのスペクトルを大幅に増加します。さらに、CNOの配信のための非侵襲的な戦略は、動物の健康に直接影響を与えることができる有害な副作用を減らすことによって、結果の潜在的な誤解を最小限に抑えます。ここでは、DREADDs (hM3Dq) の堅牢な活性化を与え、幅広い可能性を提供する CNO 配信の 2 つの非侵襲的な戦略について説明しました。さらに、ここで説明するプロトコルは、遺伝子操作されたムスカリンまたはオピオイド受容体を含む、神経操作のための異なるDREADD変異体にも有用である可能性があると考えています。
反復的な点眼薬を用いたCNO送達は、CNO送達の投与量とタイミングを正確に制御する力を維持しながら、繰り返しの経皮内CNO注射に対する痛みのない代替手段を表す。したがって、繰り返し DREADD アクティベーションが必要な場合は、このプロトコルを使用することをお勧めし...

神経科学の分野における技術的進歩により、科学者は特定の神経集団の活動を正確に特定し、制御することができました 1.これは、ニューロン回路の基礎と動物の行動への影響をよりよく理解するのに貢献しているだけでなく、確立されたドグマ2、3を改訂する。これらの新しいツールの中で、光遺伝学的および化学遺伝学的戦略は、発見の質だけでなく、実験が考案され、設計される方法にも大きな影響を与えました 4.本原稿では、工学的受容体リガンド戦略を用いてニューロンの活性化を制御するための化学遺伝学的戦略に焦点を当てる。デザイナー薬(DREADDs)によって排他的に活性化されるデザイナー受容体は、Roth 20165によってレビューされたニューロン活動の遠隔制御のための最も人気のある化学遺伝学的ツールの1つを表します。DREADDsは、不活性リガンド、クロザピン-N-オキシド(CNO)6によって特異的に活性化される修飾されたムスカリン性アセチルコリン受容体を利用する。
ほとんどの研究は、急性の方法でエンジニアリングされた受容体の活性化の投与量とタイミングを効果的に制御する経皮内注射(i.p.)注射によって投与されるCNOを使用します。しかし、反復的または慢性的なDREADD活性化が必要な場合、複数のi.p.注射の使用は不可能になる。この問題に対処するために、移植されたミニポンプ7および頭蓋内カニューラス8、9を含む慢性CNO送達のための異なった戦略が報告されている。異なる範囲に、これらすべての戦略は、動物のストレスおよび痛みを引き起こし、また、テストされる行動応答に直接影響を与えることができる外科的介入を必要とする11。ここでは、慢性CNO送達に対する3つの非侵襲的戦略について述述する。
この目的のために、マウスは、リガンドCNOによって活性化されると、破裂状の発射につながる興奮性M3ムスカリン受容体(hM3Dq)の工学バージョンをコードするアデノ関連ウイルス(AAV)を海馬に立体的に注入した。ニューロン6.CNOを含む単一の点眼剤が効果的にDREADD発現ニューロン12の堅牢な活性化を引き出すことができることが以前に示された。ここでは、点眼薬の反復的な送達のための改変方法について説明する。デザイナー受容体の慢性的かつ持続的な制御を達成するために、次に飲料水を介してマウスにCNOを提供する非侵襲的な戦略について説明する。最後に、制限された時間枠の間に飲料水でCNOを提供するための代替パラダイムについて説明します。マウスの運動活性は、飲酒行動および甘いカロリー溶液の消費と同様に、主に光/暗いサイクル13、14の暗い部分に制限される。そこで、スクロースに対するマウスの好みに基づくプロトコルを採用した。AAV感染細胞における即時早期遺伝子c-Fosの誘導を測定することにより、ニューロン活性化12、15の読み出しとして、これらのCNO送達戦略がDREADD制御ニューロンを長期間にわたって強く活性化することがわかった。期間。

<table><tbody><tr><td>BSA</td><td>シグマライフサイエンス</td> <td>#A2153-100G</td><td>凍結乾燥粉末&ge;96% (アガロースゲル電気泳動)</td></tr><tr><td>C57BL/6J マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>#000664</td><td>雄マウス、3ヶ月齢</td></tr><tr><td>毛細血管</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>#3-000-203-G/X</td><td>外径:1.14インチ</td></tr><tr><td>クロザピン-N-オキシド</td><td>Sigma</td> <td>#C0832</td><td>5mg</td></tr><tr><td>フォラン</td><td>バクスター</td> <td>#NDC 10019-360-60</td><td>イソフルラン、USP</td></tr><tr><td>マイクロインジェクター III</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>#3-000-207</td><td>Nanoject III - Programmable Nanoliter Injector</td></tr><tr><td>Mounting Media</td><td>Invitrogen</td> <td>#P36930</td><td>Prolong Gold antifade reagent</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>#15710</td><td>16% aqueous solution (methanol free), 10 mL</td></tr><tr><td>Primary c-Fos Antibody</td><td>Cell signaling technology</td> <td>#2250S</td><td>c-Fos (9F6) Rabbit mAb (100&マイクロ;L)</td></tr><tr><td>rAAV5/hSyn-hm3D-mCherry</td><td>UNC ベクターコア</td><td></td><td>力価: ~3 x 1012 vg/mL</td></tr><tr><td>rAAV5/hSyn-mCherry</td><td>UNC ベクターコア</td><td></td><td>力価: ~3x10e12 vg/mL</td></tr><tr><td>二次抗体</td><td>Invitrogen</td> <td>#A21206</td><td>Alexa Fluor TM 488 ロバ抗ウサギ IgG(H+L), 2mg/mL</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>americanbio.com</td> <td>#AB02025-00100</td><td></td></tr></tbody></table>

dreadd制御神経活動の慢性操作に対する非侵襲的戦略

Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity

化学遺伝学的戦略は、神経活動の遠隔制御のための信頼性の高いツールとして登場しています。これらの中で、デザイナー薬(DREADDs)によって排他的に活性化されるデザイナー受容体は、現代の神経科学で使用される最も人気のある化学遺伝学的アプローチとなっています。ほとんどの研究は、単一の食後性注射を使用してリガンドクロザピン-N-オキシド(CNO)を提供します, これは、標的ニューロン集団の急性活性化/阻害に適しています.しかし、DREADD制御ニューロンの慢性変調のための戦略のほんの一例は、その大半は外科的介入を必要とする送達システムの使用に依存している。ここでは、ライガンドCNOを送り出してマウスの神経集団を慢性的に操作するための2つの非侵襲的な戦略について展開する。CNOは、反復的な(毎日)点眼薬を使用するか、または動物の飲料水を通して慢性的に投与した。これらの非侵襲的なパラダイムは、CNO治療全体を通じて持続するデザイナー受容体の堅牢な活性化をもたらす。ここで説明する方法は、神経活動の慢性DREADD媒介制御の代替手段を提供し、侵襲性の低いCNO送達方法に焦点を当てて、自由に動く動物の行動を評価するように設計された実験に役立つ可能性がある。

点眼薬を用いた反復的なCNO送達は、ほとんどの感染ニューロンにおけるc-Fos発現の強い誘導を引き起こし(図1C)、CNO送達の有効性が反復的暴露中に持続することを示した。さらに、CNO処理後2時間に採取した試料においてc-Fosの有意な誘導が観察され、CNO曝露後6時間で得られた試料(図1D-E)と比較して、CNOによって誘導される変化が時間依存であることを実証した。
その後、飲料水を通じて送達される慢性CNO治療の有効性を測定した。水+CNOの1日の消費量は、通常の水の総量と比較して有意に異ならないことが分かった(図2A)。同様に、夜間に消費される水量+1%ショ糖(6時間時間枠)は、CNO(図2B)の添加による影響を受けなかった。また、全動物に対する実験を通じて、水+CNO(図2C)及び水+ショ糖+CNO(<...

ここでは、マウスの化学遺伝学を用いて神経活動を慢性的に制御する2つの非侵襲的方法について説明する。点眼剤は、クロザピン-N-酸化物(CNO)を毎日提供するために使用されました。また、飲料水中のCNOの長期投与のための2つの方法についても述べた。慢性神経制御のためのこれらの戦略は、動物のストレスを軽減する最小限の介入を必要とします。

DREADD制御神経活動の慢性操作に対する非侵襲的戦略

Chemogenetic strategies have emerged as reliable tools for remote control of neuronal activity. Among these, designer receptors exclusively activated by ...

DREADDsは、神経活動の遠隔制御のための最も人気のある化学遺伝学的アプローチです。ここでは、より低侵襲のCNO送達方法に焦点を当てて、反復または慢性DREADD制御のための新しい選択肢を提供します。我々は、マウスにおける反復点眼薬による、または動物の飲料水を介して慢性的に長期にわたるCNO送達のための2つの戦略を説明する。ここで説明するプロトコルは、異なるDREADD変異体、組織、あるいは種を含む様々な実験設計に適応することができるCNO送達のための慢性的および非侵襲的なオプションの例である。CNOの出産のための重要な問題は、動物のストレスと痛みです。これらのプロトコルは、この問題を最小限に抑え、さまざまな実験設定に簡単に適応できます。手術を行う前に、ステレオタックスフレームと必要なすべての器具を清潔にして滅菌してください。フレームの準備ができたら、麻酔された混合背景野生型雄マウスでつまみつまみへの応答の欠如を確認し、頭の上を剃り、フレームにマウスの頭を固定します。次に眼保護潤滑剤を眼に塗布し、最後に、露出した皮膚をシーケンシャルなポビドンヨウ素と70%エタノールスクラブで洗浄します。滅菌メスを使用して頭蓋骨を露出させ、フレームをブレグマポイントにキャリブレーションします。2.9ミリメートルの内側座標でドリルし、海馬を標的にするためにマイナス2.7ミリメートルの前後方座標で掘削します。脳が露出したら、マイクロインジェクターを使用し、マイクロキャピラリーピペットを引っ張って、過誤関連ウイルスの90ナノリットルをマイナス3ミリメートルの下側腹側深さで海馬に一方的に注入する。次いでナイロン縫合糸で切開を閉じ、鎮痛投与用のフレームから動物を取り除く。反復的なCNO送達のために、注射後4週間開始、各マウスを眼球の投与の3〜4日間毎日3分をスクラフすることによって取り扱いに動物を順応させる。マウスが取り扱いに慣れてきたら、各マウスの重量を量って、体重濃度の1キログラム当たり1ミリグラムのCNOを達成するために送達されるCNOの適切な量を決定する。不活性段階で消灯する2時間前に、調製したCNO溶液の1~3マイクロリットルをP10マイクロピペットにロードし、スクラッフィンを介してマウスを固定化します。ピペットチップに安定した液滴が形成されるまでゆっくりと溶液を排出し、ピペットチップに触れることなく溶液が送達されるまで慎重に液滴を角膜に近づけます。次に、マウスをホームケージに戻してから、次の動物の目にCNOのスポイトを塗布します。マウスの活性段階でCNOを送達する必要がある場合は、適切な動物の取り扱いとCNOの送達のために薄暗い赤色光の存在を確認してください。慢性CNO治療の場合、注射後4週間、治療開始3日前に、通常の水筒をゴムスパウトで止め、通常の水10ミリリットルを含むアルミニウム箔で覆った小さなボトルに交換してください。マウスがボトルに順応できるようにテープでケージに固定します。各マウスの毎日の水消費量を測定し、各マウスの重量を量ります。CNO濃度の範囲をテストして、最小のCNO濃度で最大の効果を表示する用量を決定します。その後、各小さなボトルに8ミリリットルの通常の水と必要な量のCNOを充填します。制限付きCNO治療の場合、注射後4週間、治療開始の3日前に、動物の活動期の最後の部分で、10ミリリットルの水と1%スクロースを含む小さなボトルをケージに置きます。露光の終わりに、各ケージから水とスクロース溶液を取り除き、各動物のスクロース水消費量を測定します。CNOの配達のために、5ミリリットルの水に加えて1%スクロースとCNOのキログラムあたり1ミリグラムでボトルを満たします。活性相の最後の部分の間に砂糖水の順応期間中と同じ位置にボトルを置き、ボトルを取り除き、実証したように水、スクロースおよびCNOの消費量を測定する。実験の終わりに、処理された動物の脳を新鮮な固定剤に収穫する。9~12時間後、30%スクロース溶液で脳組織を凍結保護する。脳が沈んだら、クライオスタットのサンプルを切り離します。すべての脳切片が得られ、非特異的結合がブロックされたら、一定の攪拌で一晩摂氏4度で抗c-Fos抗体溶液で組織サンプルをインキュベートする。翌朝、適切な蛍光共役二次抗体でサンプルをインキュベートする前に、洗浄ごとに新鮮なPBSで3回の5分間の洗浄でサンプルを洗浄します。光から保護された室温および一定の撹拌で1時間後、蛍光共焦点顕微鏡により標識された組織切片のデジタル画像を得る。ImageJに画像をロードした後、アデノ関連感染したmCherry陽性細胞の領域を測定し、この領域内のC偽陽性細胞の数を定量化して、領域あたりの活性化細胞数を得る。点眼薬を用いた反復的CNO送達は、ほとんどの感染ニューロンにおけるcFos発現の強い誘導を引き起こす。さらに、CNO照射後6時間で得られたサンプルと比較して、CNO処理の2時間後に採取したサンプルにおいてcFosの有意な誘導が観察され、CNOによって誘発される変化が時間依存であることを示す。水とCNOの毎日の消費量は、通常の水の総量と比較して有意に異なっていません。同様に、夜間に消費される水の量に1%のスクロースを加えた量は、CNOの添加によって影響を受けず、また、水とCNOの両方の毎日の消費の違いはなく、水プラススクロースとCNOの5日間の実験期間にわたって観察された。CNO点眼薬の適用と同様に、cFosの堅牢な誘導は2時間後に観察されるが、CNO飲料水へのアクセスの6時間は観察されない。さらに、CNOの有効性の明確な閾値は、低いCNO用量が生理食類対照と比較してcFos活性化を引き起こすのではなく、より高い用量は堅牢で類似したcFos誘導を誘発する。ニューロンの活性化を有意に低下させない最も低いCNO用量を定義するために用量応答分析を行い、リガンドとしてクロザピンを使用することを検討することをお勧めします。ここでは、ニューロン活性化の結果としてCNO媒介cFos誘導を用いて実証した。しかし、これらのプロトコルは、電気生理学的解析や行動試験に容易に採用することができる。DREADD技術は、ニューロン活動の遠隔制御、およびCNO配信のための代替戦略を設計するための強力なツールです。実験的な設定と潜在的な臨床介入のためのオプションのスペクトルを増やします。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

出典: Zhan, J., et al.DREADD制御ニューロン活動の慢性操作のための非侵襲的戦略。J. Vis. Exp.

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学ぶDREADDによるマウス神経活動の非侵襲的慢性制御法。点眼薬と飲水によるCNO投与により動物のストレスを最小化し、長期的な神経活性化を実現する実験プロトコルを解説します。

DREADD制御神経活動の慢性操作に対する非侵襲的戦略

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