Name: 合成、機能化、およびオリゴヌクレオチド配信の融合性ポーラス シリコンのナノ粒子のキャラクタリゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-16T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 学ぶ融合性ポーラスシリコンナノ粒子の合成法。siRNAを効率的に送達し、マクロファージの慢性炎症を抑制する遺伝子サイレンシング技術を確立。疾患治療への応用可能性を示す革新的ナノ医療プラットフォームです。

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1. ポーラス シリコンのナノ粒子 (pSINPs) の合成
注意: は、フッ化水素酸 (HF) を使用するときに常に注意を使用します。その安全データシート (SDS) によるとすべての安全ガイドに従ってください、発煙のフードで HF を含む化学薬品を処理し、適切な個人用保護具 (PPE; 外にブチル手袋をして二重手袋、ブチル、顔の下に白衣とエプロンを着用シールドの下に安全ゴーグル)。すべての大学と研究室を使用する前に HF 安全性に関する具体的なトレーニングが必要です。ここに記述されていない追加の安全対策が必要なため、地元の研究室安全担当の事前承認せず HF で作業をしないでください。
<ol><li>
エッチング溶液の調製
	<ol>
<li>プラスチックを埋めるエッチング (手順 1.3 と 1.4 で使用)、3:1 心不全のソリューションにするため水溶液 48 %hf の 30 mL と 10 mL の無水エタノール (エタノール) のシリンダーを卒業しました。ソリューションは、HF はガラスを溶解する、高密度プラスチック (例えば、HDPE) に含まれなければなりません。</li>
		<li>1:29 にリフトオフ (で使用される手順 1.5)、プラスチック、塗りつぶし用 HF ソリューションは 1 ml の水溶液の 48 %hf と無水エタノール 29 mL シリンダーを卒業しました。ソリューションは、HF はガラスを溶解する、高密度プラスチック (例えば、HDPE) に含まれなければなりません。</li>
		<li>10% で 1 M KOH 溶液を作る余分な pSi 解散 (手順 1.3 と 1.5 で使用) のエタノール。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Etch のセルを設定します。
	<ol>
<li>テフロンで etch 8.6 cm セル2エッチも (o リング内エッチングおよび A によって面積を計算するのに使用できるシリコン表面の直径を測定することにより面積を計算 = πr2)、降順 (図 2 a) に: (1)、テフロン セルの上端。(2) o;(3) 単結晶の四分の一部分 (1 0 0) - 指向 p + + - 型シリコンウェーハ (ダイヤモンド カッターを使用して) の四分の一にカット(4) アルミ箔。(5) とネジで基本テフロン セル優しく漏れを防ぐためにきつく締められます。</li>
		<li>エタノールで井戸を埋めます。ワイプを取る、テフロン セルの上部と下部の隙間に差し込みます。ワイプは、除去時に乾燥が、etch セルは密封されます。ウェット、セルが漏れていると締めシールまで、ネジはさらに。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
電解研磨、シリコンウエハー
	<ol>
<li>ヒューム フードに組み立てられたエッチング細胞をもたらします。</li>
		<li>3:1 HF 溶液 10 mL で井戸を埋めます。</li>
		<li>エッチ携帯からアルミ箔 (電極) に肯定的な鉛と回路 (図 2 b) を完成するエッチング セルの 3:1 HF 溶液中浸漬プラチナ コイル (カウンター電極) に負のリード線を接続します。</li>
		<li>実行定電流 50 mA cm-2 60 s。一度のエッチングが完了したら、回路からセルを削除し、慎重に注射器を使用して 3:1 HF を洗います。エタノールで 3 回を洗い流してください。</li>
		<li>井戸を埋めることでエッチング加工層を離れて溶解 10 mL 1 M 島でゆっくりと。バブルがおさまるまで待ちます。</li>
		<li>水 3 回とし、エタノール 3 回島を洗います。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
シリコンウェーハに多孔質層を電気化学的エッチング
	<ol>
<li>50 mA/cm2 0.6 s の低い current density と 0.36 の 400 mA/cm2の電流密度で方形波の交流電流を実行 s が 500 サイクルで繰り返されます。</li>
		<li>一度のエッチングが完了したら、回路からセルを削除し、慎重に注射器を使用して 3:1 HF を洗います。エタノールで 3 回を洗い流してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
シリコンウエハーから多孔質の層を持ち上げる
	<ol>
<li>1:29 の 10 mL で井戸を埋める HF ソリューション。</li>
		<li>3.7 mA/cm2 250 のための定数を実行 s。一度エッチングが完了したら、回路からセルを削除します。PSi 層は、結晶シリコン基板からの剥離を示す表示される波紋があります。優しく洗って、1:29 HF ソリューションと江藤 3 倍を水 3 回をすすいでください。</li>
		<li>完全剥離の pSi の層のまわりの亀裂ピペット チップを使用して、しっかりと。計量ボートにセルを etch テフロンから pSi 片 (チップ) エタノールを使用すると、収集。ガラスの瓶にチップを転送します。PSi チップ保管貯蔵のため 6 ヶ月以上で江藤に室温で。</li>
		<li>井戸を埋めることでウェーハ上残り多孔質シリコンを離れて溶解 10 mL 1 M 島でゆっくりと。バブルがおさまるまで待ちます。</li>
		<li>水 3 回とし、エタノール 3 回島を洗います。</li>
		<li>1.3 から 1.5 の手順を繰り返して全体の厚みが刻み込まれています。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ナノ粒子形成 sonicating 多孔質層
	<ol>
<li>純水 2 mL にエタノールから pSi チップを含むバイアルの溶媒を交換してください。</li>
		<li>しっかりとキャップをしめて、パラフィルムを使用して密封します。</li>
		<li>ガラス超音波発生装置バースのバイアルし、pSi チップの量は表面の下に水没するように中断された場所です。</li>
		<li>35 kHz と 48 w フィットの高周波電力で 12 h の超音波照射します。超音波処理中に重要な水損失を防ぐため、あふれた水にフラスコのオープニング風呂の水の表面に触れるように反転メスフラスコを配置します。</li>
		<li>下部に解決するより大きい粒子を許可するように 1 h の平らな面にガラスの瓶を置きます。ピペット; を使用して上澄みを集めサスペンションには、サブ 100 nm pSiNPs が含まれています。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 融合ペプチド脂質膜の作製
<ol><li>
脂質の貯蔵液の準備
	<ol>
<li>発煙のフード DMPC, DSPE ペグ MAL およびクロロホルム DOTAP 脂質を潤いで脂質の 10 mg/mL 株を作る。これらの原液を-20 ° C で保管して、タイトなパラフィルム シールの下まで 6 ヶ月間よい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
融合ペプチド脂質膜を作る 注: 融合ペプチド組成で脂質、DMPC、DSPE ・ ペッグ、DOTAP、76.2:3.8:20、96.2:3.8:0、モル比でそれぞれされます。<ol>
<li>ガラス瓶でピペッティングによる 19.63 μ DOTAP、DSPE ・ ペッグの 15.16 μ L DMPC 72.55 μ L をミックスします。</li>
		<li>オプション: 蛍光脂質コーティングの分類、また追加 DiI の 20 μ L が 1 mg/mL の濃度でエタノールに溶解します。</li>
		<li>一晩蒸発にクロロホルムを許可するように緩んでキャップとヒューム フードにバイアルを配置します。乾燥皮膜は、バイアルの下部曇りハード ゲル状物質になります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 読み込みと pSiNPs の siRNA のシール
<ol><li>
在庫の読み込みカルシウム塩化物の準備
	<ol>
<li>CaCl の 1.11 g を溶かす2 2 M CaCl2溶液を作るために RNAse フリー水 10 mL にします。</li>
		<li>> 10,000 で溶液を遠心凝集体を解決し、ピペットを使用して上澄みを集め 1 分g x。また、ソリューションをフィルター処理、0.22 μ m フィルターを通過。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
在庫の読み込み siRNA の準備
	<ol>
<li>メタンハイド レートまたは RNAse フリー水で 150 μ M に siRNA を薄めます。この原液は避けようと頻繁に凍結融解サイクルが行われないことを考えれば、少なくとも 30 日間-20 ° C で凍結保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
塩化カルシウムと pSiNPs の siRNA の読み込み
	<ol>
<li>アイス超音波風呂を準備します。</li>
		<li>下 15 分超音波、siRNA の優しくピペット 150 μ L、700 μ pSiNP の 150 μ L に 2 M CaCl2 。ガスの遠心チューブの蓋を開いたままにすることを確認します。</li>
		<li>SiRNA ロード カルシウム コーティング pSiNPs、超音波発生装置からの 1 つの mL を含むチューブを取り外します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 脂質の膜融合 siRNA ロード pSiNPs のコーティング
<ol><li>
リポソーム押出キットの準備
	<ol>
<li>DI 水で広いビーカーを埋めます。ソーク 1 ポリカーボネート膜 (200 nm 毛穴) と水の表面に浮かんでそれら 4 フィルターのサポート。製造元の指示に従い、リポソーム押出キットを組み立てる</li>
	</ol>
</li>
	<li>
SiRNA ロード pSiNps と脂質膜の水和
	<ol>
<li>3.3.3 ステップから取得された siRNA ロード カルシウム コーティング pSiNPs の 1 ml のガラス瓶の乾燥した脂質膜をメタンハイド レートします。ピペットのすべての脂質膜がバイアルの底から持ち上げたし、曇りの同種のソリューションに混在しているまで。</li>
		<li>ガラス瓶の磁気撹拌棒を置き、40 ° C (または十分に高いより流体液晶相の脂質を維持するために脂質の相変化温度より上) に粒子を加熱するホット プレートの上に瓶を置く一方、磁気20 分のためのソリューションをかき混ぜます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
サイズ コントロールの脂質コーティング pSiNPs を押し出す
	<ol>
<li>押出シリンジの脂質コーティング pSiNP siRNA 溶液の 1 mL を吸引します。、押出機の片側に空の注射器と反対側に満たされた注射器を挿入します。</li>
		<li>1 シリンジ、ポリカーボネート膜と他の粒子をプッシュするゆっくりピストンを押して、押し出しを開始します。20 回繰り返します。ピストンがスタックしている場合は、フィルター、膜が目詰まり可能性があります。押出機を分解し、膜・ フィルターのサポートを交換します。問題が解決しない場合は、管理が目詰まりするまで粒子を希釈します。</li>
		<li>微量遠心チューブに押し出された粒子を収集します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. ペプチドをターゲットの活用
<ol><li>
脂質のコーティングにターゲットのペプチドを活用
	<ol>
<li>RNAse フリーの水中ペプチド濃度 1 mg/mL とペプチドのストックを準備します。</li>
		<li>融合ペプチド脂質コーティング pSiNPs を含む遠心チューブ、1 mg/mL ペプチド株式のピペット 100 μ L をそっと追加します。(また、> 2 h 4 ° c) に 20 分間室温でチューブを静的に保存します。</li>
		<li>過剰なペプチド siRNA やその他の賦形剤を削除するには、30 kDa 遠心フィルター 1 h. 遠心 1 ml の PBS の同じ設定でさらに 2 回 25 ° C で 5,000 × gで回して洗ってください。</li>
		<li>必要な濃度で PBS で最終的なペプチド共役融合ペプチド脂質コーティング pSiNPs を再懸濁します。避けようと-80 ° c 少なくとも 30 日間の保存のため冷凍粒子できるようになりました。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Komarov, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genetics-directed+identification+of+novel+pharmacological+inhibitors+of+FAS-+and+TNF-dependent+apoptosis+that+protect+mice+from+acute+liver+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure.</a> Cell Death & Disease. 7, e2145(2016).</li>
</ol>

MJS はサイエンス株式会社スピンネーカーの科学の創設者で、会社の持分。 この補助金は、プロジェクトおよびサイエンス株式会社スピネーカーにその潜在的な利益の全体的な範囲に基づく利益相反管理のため確認されていますが、この特定のパブリケーションに含まれている研究成果は必ずしもスピンネーカー バイオ サイエンス社の利益に関連してこの整理の言葉が検討されており、その利益相反ポリシーに従って、サンディエゴ カリフォルニア大学によって承認されました。他の作家が何を開示するあります。

ポーラス シリコンのナノ粒子の合成を図 5に示します。融合性 pSiNPs の合成に重要なステップは、読み込みの手順 (手順 3)。膜融合ナノ粒子を集約する場合後合成 (図 3)、理由次が原因である可能性があります: (1) 塩化カルシウム株式がゆく準備されていません、ステップ 3.1.2 必要があります慎重に続くまたは洗練された; するため(2) または pSiNP の比率: siRNA: CaCl2または 3 つのコンポーネントの 1 つ以上の濃度を最適なできない場合があります。CaCl2濃度から始まって再最適化を提案した (例えば、2 M から 1 M または 3 M に変更)。さらに、我々 は、異なるベンダーから同じ化学物質が読み込みステップ、および siRNA を読み込めませんでした。 その後でより低い pH の結果を見られるような同じベンダーから CaCl2があることを確認することが重要です。PSiNPs がまた集中する、希釈、または読み込み...

遺伝子治療は、治療の結果を取得する特定の遺伝子発現を調節します。遺伝子の調節のための多数のツールを検出し、(例えば、短い干渉 RNA (siRNA)1、2、マイクロ Rna (miRNA)3,4 のオリゴヌクレオチドを使用してリボ核酸干渉 (RNAi) などを学び、)、DNA プラスミド5,6核酸 (例えば、亜鉛指、TALENS)7、8、および CRISPR/Cas9 システム9,10。各ツールの作用機序とは異なる中、セルの細胞質またはアクティブ化する核に到達する必要がありますすべてのツール。など、これらのツールは、体外遺伝子発現を調節することで有意な効果を誘導するために証明されている、間に生体内での有効性は細胞外と細胞内の障害物によって苦しみます。ツールは、生物学的起源、という事実のために多くの酵素やクリアランス システムが低下または外国の分子11を削除する能力を持っている私たちの体で存在します。場合でも、彼らはエンドサイトーシス; から苦しむ目的セルをツールに到達トラップの低下またはセルからツールを追放する酸性の胃のような小胞に含まれるツールをカプセル化して細胞内取り込みモード。実際には、研究はマクロピノサイトーシス、元、siRNA の約 70% が吸収12,13の 24 h 内のセルから exocytosed 経由で貪食を脂質ナノ粒子には示しています。残りの siRNA の大半はリソソーム経路によって劣化が、最終的に当初がナノ粒子でセルに入る siRNA の唯一の 1-2% 達成潜在的 RNAi13,14 を受けるエンドソーム脱出.
最近融合ペプチド脂質シェル15とポーラス シリコン微粒子から成る siRNA ロードのコアを持つ融合性ポーラス シリコン ナノ粒子 (F pSiNPs) を開発しました。F pSiNPs 提示他従来オリゴヌクレオチド配信システムの 3 つの主要な利点: (1) エンドサイトーシスをバイパスし、ペイロード全体を (1-2% 対細胞細胞質内に直接配信する粒子ができますコーティング膜融合脂質貪食粒子13,14目標達成) (図 1)。pSiNPs の siRNA の (2) の高質量負荷 (> 1-15 wt % により、従来に比べて 20 wt %)15、急速に低下する細胞質 (一度コア粒子は膜融合吸収を介して脂質コーティングを流す); siRNA を解放するには(3) と体内細胞の種類を希望する選択的ホーミングのペプチド共役をターゲットします。
F pSiNP システムは、重要な遺伝子サイレンシング効果を実証してきました (> 95% 生体外で; > 体内の 80%)、黄色ブドウ球菌肺炎の致命的なマウスモデルでの後の治療効果結果15以前公開されました。ただし、繊細な取り扱いと均一で安定したナノ粒子を生成するために微調整の最適化、F pSiNP システムの複雑な構造が必要です。したがって、この作業の目的は徹底的なプロトコルとして合成、機能化、および強力な遺伝子サイレンシング効果に Sirna のターゲットを絞った配信で使用する F pSiNPs の特性の最適化戦略を提示します。

<table><tbody><tr><td>1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン (DMPC)</td><td>アバンティ極性脂質</td><td>850345P</td><td>粉末</td></tr><tr><td>1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン (塩化塩) (DOTAP)</td><td>アバンティ極性脂質</td><td>890890P</td><td>粉末</td></tr><tr><td>1,2-ジステアロイ-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[マレイミド(ポリエチレングリコール)-2000] (アンモニウム塩) (DSPE-PEG(2000) マレイミド)ア</td><td>バンティ極性脂質</td><td>880126P</td><td>粉末</td></tr><tr><td>アルミホイル</td><td>VWR International, LLC</td><td>12175-001</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム (CaCl2)</td><td>Spectrum</td><td>C1977</td><td>無水、ペレット</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>C6061</td><td></td></tr><tr><td>コンピュータ</td><td>Dell</td><td>Dimension 9200</td><td>PCIカードスロットを備えた任意のコンピュータが許容されます</td></tr><tr><td>ジルステイン(1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩('DiI';DiIC18(3)))</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ<td>D3911</td><td></td></tr><tr><td>エタノール(EtOH)</td><td>UCSDストア</td><td>111</td><td>200プルーフ</td></tr>ヒ<tr><td>ドロフルクリン酸(HF)</td><td>VWRインターナショナル、LLC</td><td>MK264008&nbsp;</td><td>純度:48%</td></tr><tr><td>ケースレー2651A型ソースメータ</td><td>ケース</td><td>レー2651A</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td></td><td>のサンプル・プログラムは、次の場所で入手可能です。 http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/</td></tr> <tr><td>LysoTracker Green DND-26</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L7526</td><td></td></tr><tr><td>リポソーム押出成形セット(加熱ブロック付き</td>) <td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Microcon-30kDa遠心フィルターユニット</td><td>EMD ミリポア</td><td>MRCF0R030</td><td></td></tr><tr><td>Oリング</td><td>ChemGlass</td><td>CG-305-220</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>プラチナコイル</td><td>VWR International, LLC</td><td>AA10285-BU</td><td></td></tr><tr><td>水酸化カリウム (KOH)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>P250-3</td><td></td></tr><tr><td>シリコンウェーハ</td><td>Siltronix</td><td>カスタムオーダーsiRNA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dharmacon</td><td>カスタム</td><td>オーダーIRF5、センス5'-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3'およびアンチセンス5'-dTdT UCA GGG UUA UUC UCU GCA G dTdT-3'</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>VWR International, LLC</td><td>97043-960</td><td></td></tr><tr><td>標的ペプチド (CRV)</td><td>CPC Scientific</td><td>カスタムオーダー</td><td>配列 CRVLRSGSC; 2つのシステイン残基の側鎖間のジスルフィド結合によって環状に作られ</td></tr>る <tr><td>テフロンエッチング細胞</td><td>Interface Performance Materials, Inc.</td><td>カスタムオーダー</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free 蒸留水&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10977015</td><td></td></tr></tbody></table>

合成、機能化、およびオリゴヌクレオチド配信の融合性ポーラス シリコンのナノ粒子のキャラクタリゼーション

Synthesis, Functionalization, and Characterization of Fusogenic Porous Silicon Nanoparticles for Oligonucleotide Delivery

遺伝子療法の出現により、効果的な体内ヌクレオチド ペイロード搬送システムの開発は並行輸入となっています。融合性ポーラス シリコンのナノ粒子 (F pSiNPs) 高 in vivo 遺伝子サイレンシング力およびエンドサイトーシスを回避するユニークな細胞内取り込み経路その高オリゴヌクレオチドによる有効性を示してきた。F pSiNPs の合成は複数の手順が含まれている: (1) 読み込みとシリコン毛穴; へのオリゴヌクレオチド ペイロードのシール(2) 同時コーティング ・融合ペプチド脂質ポーラス シリコンのコアの周りのサイジング(3) の共役ペプチドをターゲット ・洗浄の余分なオリゴヌクレオチド、シリコンの破片、およびペプチドを削除します。粒子の大きさの均一性は動的光散乱によって特徴付けられるし、そのコア ・ シェル構造は、電子顕微鏡による検証可能性があります。膜融合吸収は、脂溶性の読み込みによって検証された染料、1, 1'-dioctadecyl-3, 3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine 過塩素酸塩 (DiI) 融合ペプチドの脂質二重膜に、細胞膜と染色の観察する治療エンドサイトーシスのローカライズ。ターゲットおよび in vivo 遺伝子サイレンシング効果はターゲットのペプチドの F pSiNPs は、感染部位に家が予想される黄色ブドウ球菌肺炎マウスモデルにおける定量化された以前。黄色ブドウ球菌感染症における応用を越えて F pSiNP システムは幅広い領域の疾患、ウイルス感染症、がん、自己免疫疾患などの遺伝子治療の任意のオリゴヌクレオチドを提供する使用ことがあります。

融合性 pSiNPs の合成に成功は均質なわずかに不透明なソリューション (図 3 a) を生成する必要があります。比と pSiNPs の濃度を最適化に失敗しました: siRNA: CaCl2 (図 3 b) の読み込み時に集約につながる可能性があります。DLS を用いて融合ペプチド pSiNPs の平均流体力学的直径が約 200 をする必要があります 200 nm 膜を介して粒子が押し出されると、nm、および図 4に示すように、平均約 +7 ゼータ電位 mV。ペプチドをターゲット表面改質後全体の直径は 230 下に増やす必要があります-3.4 まで減少した nm の, と平均ゼータ電位 mV15。押出サイズから広範な逸脱は失敗した押し出しの説法 (d粒子&gt;&gt; d押出)、または読み込みに失敗しまし...

効果的な in vitro および in vivo のオリゴヌクレオチド配信の融合性ポーラス シリコンのナノ粒子の合成を示します。ポーラス シリコンのナノ粒子は、シェルを形成する押し出しによる融合ペプチド脂質によるコーティングの核を形成する siRNA によって読み込まれます。ターゲット部位の機能化と粒子特性含まれます。

With the advent of gene therapy, the development of an effective in vivo nucleotide-payload delivery system has become of parallel import. Fusogenic ...

このプロトコルは、高効率でsiRNAを送達することによって生体内の遺伝子を沈黙させることができるナノ粒子系の合成を記述する。標的ペプチドとsiRNAペイロードを単に交換するだけで、発煙性ナノ粒子を生体内遺伝子変調を必要とする疾患の潜在的な治療製剤として使用することができる。我々は以前、マクロファージの炎症をコードする遺伝子をサイレンシングして慢性炎症を終結させることによって、グラム陽性細菌感染に対する発がん性ナノプラットフォームを用いた結果を発表した。この手順を実行する前に、シリコンウエハを含むテフロンエッチングセルを3対1のフッ化水素酸溶液に組み立てます。低電流密度が50mmの方が0.6秒、高電流密度が400mmの高電流密度を500サイクルで0.36秒四方にして、四方波の交流を実行します。エッチングが終了したら、回路から細胞を取り出し、注射器を使用してフッ化水素酸溶液を慎重にリンスします。次に、エタノールで3回リンスする。シリコンウエハから多孔質層を持ち上げるには、まず1~29のフッ化水素酸溶液を10ミリリットルでエッチングセルのウェルを充填する。その後、250秒間、1センチメートルあたり3.7ミリアンペアの定数を250秒間実行します。エッチングが終了したら、回路からセルを取り外します。多孔質シリコン層は、可視のリップルを有し得、結晶シリコンウエハからの剥離を示す。フッ化水素酸溶液を軽く洗い流し、エタノールと水でそれぞれ3回洗い流します。ピペットチップを使用して、多孔質シリコン層の円周をしっかりと割り、完全に剥離します。エタノールを使用して、多孔質シリコンフラグメント、またはチップをテフロンエッチングセルから計量ボートに回収する。その後、チップをガラスバイアルに移して保管します。次に、多孔質シリコンチップを含むガラスバイアル内のエタノールを、RNaseフリー水2ミリリットルに交換する。パラフィルムを使用してバイアルをしっかりとキャップして密封します。ガラスバイアルをソニカレーター浴に入れ、多孔質シリコンチップの体積が水浴の表面の下に完全に沈むように吊り下げます。超音波処理中に大きな水の損失を防ぐために、フラスコの開口部が水浴の表面に触れるように反転し、水で満たされた体積フラスコを置きます。次に、48ワットのRF電力で35キロヘルツで12時間多孔質シリコンチップを超音波処理します。超音波処理の後、より大きな粒子が底に落ち着くように1時間平らな表面にガラスバイアルを置きます。次に、ピペットを用いて上清を回収する。ガラスバイアルに、DMPC溶液72.55マイクロリットル、DSPE-PEG溶液15.16マイクロリットル、および19.63マイクロリットルのDOTAP溶液を加え、ピペット処理で混合します。溶剤が一晩蒸発できるように、緩いキャップを持つヒュームフードにバイアルを置きます。乾燥したフィルムは、バイアルの底に濁った、硬い、ゲル状の物質になります。次に、150マイクロリットルの多孔質シリコンナノ粒子を含むマイクロ遠心チューブを、以前に調製した氷の超音波浴に入れる。15分間の超音波処理の下で、穏やかにsiRNAの150マイクロリットルと2モル塩化カルシウム700マイクロリットルを多孔質シリコンナノ粒子にピペット。siRNAに積まれたカルシウム被覆の多孔質シリコンナノ粒子を1ミリリットル含むチューブを超音波処理器から取り出します。広いビーカーに脱イオン水を入れます。ポリカーボネート膜と4つのフィルターサポートを水面に浮かべて浸します。次に、メーカーの指示に従ってリポソーム押出キットを組み立てます。次に、乾燥した脂質膜をガラスバイアルに1ミリリットルのsiRNA付きカルシウム被覆多孔質シリコンナノ粒子で水和する。ピペットは、全ての脂質がバイアルの底部から持ち上げられ、濁った、均質な溶液が観察される。ガラスバイアルに磁気攪拌バーを追加し、ホットプレートにバイアルを置き、粒子を摂氏40度に加熱し、溶液を20分間磁気的に攪拌します。これに続いて、押出機の片側に空の注射器を取り付けます。次に、脂質被覆多孔質シリコンナノ粒子溶液の1ミリリットルで別のシリンジを充填し、押出機の反対側にシリンジを取り付ける。ピストンをゆっくりと押し込んで、1つのシリンジからポリカーボネート膜を通り、もう一方のシリンジに粒子を押し込んで押し出し始めます。20 回繰り返します。次いで、押出粒子をマイクロ遠心チューブに集める。RNaseフリー水中の1ミリグラム/ミリリットルのペプチド濃度でペプチドストックを調製します。二色原性脂質被覆多孔質シリコンナノ粒子を含むマイクロ遠心分離管に、ペプチドストックの100マイクロリットルを加え、ピペットを穏やかに添加する。室温で20分間静かにチューブを保ちます。余分なペプチドまたはsiRNAおよび他の賦形剤を除去するために、室温で5,000回gで1時間回転させることによって30キロダルトン遠心フィルターで洗浄する。遠心分離機同じ設定の下でPBSの1ミリリットルでさらに2回。遠心分離後、PBS中の最終的なペプチド共役二元性脂質被覆多孔質シリコンナノ粒子を所望の濃度で再懸濁する。粒子は、少なくとも30日間マイナス80度でアリクォートされ、保存することができます。二種性多孔質シリコンナノ粒子の合成に成功すると、30日間保存され、構造変化を引き起こすことなく解凍することができる均質でわずかに不透明な溶液を生成する必要があります。比と濃度を最適化できないだけでなく、凍結融解サイクルを繰り返し行えば、読み込み時に凝集する可能性があります。粒子が押し出されると、動的光散乱によって測定されるフソジェニック多孔質シリコンナノ粒子の平均流体力学的直径は、約200ナノメートル、平均ゼータ電位はほぼ正の7ミリボルトであるべきである。標的ペプチドによる表面修飾後、全体の直径は230ナノメートル未満にする必要があり、ゼータ電位の平均はマイナス3.4ミリボルトに減少します。融合は、脂溶性フルオロフォアDiIでフゾゲン性脂質を標識し、共焦点顕微鏡を用いてインビトロ局在化を観察することによって確認することができる。融合に成功するのは、フソジェニック多孔質シリコンナノ粒子の脂質がDiIを原形質膜に転移し、リソソームとは独立して局在化する場合に観察される。失敗した融合は細胞の細胞質内のDiIの局在化およびリソソームとの共局在化を示す。このフソジェニックナノ粒子系は、細菌感染のみならず、がんアジュバント療法やがん免疫療法においても治療用途に利用されています。このプロトコルは、siRNA より多くをロードするようにさらに最適化できます。この機体発生性ナノ粒子系は、mRNAやCRISPR/Cas9複合体などのより大きなアニオンペイロードの読み込みと送達の可能性を示している。

synthesis-functionalization-characterization-fusogenic-porous-silicon

Research

JoVE Journal

Engineering

工学

この記事では、ハイスループット法は、抗原提示細胞上の特定の受容体を標的のさらなる使用のための無水物ナノ粒子の表面に糖鎖とその添付ファイルの合成のために提示されます。...

無水物ナノ粒子のハイスループット糖鎖の合成と機能化

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粒子の合成機能 10 nm ポリマー コーティング金対象化、血管内皮細胞とドラッグデリバリー

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神経成長因子のキャリアとしてポーラス シリコン膜の設計

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我々は、設計、組み立て、および高分子電解質複合ミセル、高分子電解質および親水性荷電ブロックコポリマーによって形成されるコアシェルナノ粒子の設計、組み立て、および特徴付けのための代表的なデータを提供する。...

高分子電解質複合体ミセルの組み立てと特徴付け

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RNAアプタマーおよびリボスイッチをコードするDNAプラスミドを装填した多機能シルクベースのマイクロカプセルの調製

ナノゲルは、生物製剤の送達のための優れた汎用性の高いナノ粒子プラットフォームです。タンパク質ベースのペイロードをカプセル化できる刺激応答性ポリ(エチレン)グリコールベースの高分子ナノゲルを、水性条件下でのワンステップ架橋コナノ重合戦略を使用して合成しました。これらの新規ナノ粒子の最適な作製と特性評価について、以下で紹介します。...

水性ワンステップ架橋法とコナノ重合法による刺激応答性ナノゲルの合成

このプロトコルは、酸素供給のために設計された階層的に多孔質なUiO-66ナノ粒子の合成、ヘモグロビン封閉、表面PEG化について詳述しています。この手法は欠陥工学とひずみ促進バイオルソゴナル共役を組み合わせ、生物医学応用に適した透過性が高く生理学的に安定したキャリアを生成します。...

酸素供給用途における階層的多孔質UiO-66ナノ粒子における合成、ヘモグロビン封装および双直交PEG化

学ぶ融合性ポーラスシリコンナノ粒子の合成法。siRNAを効率的に送達し、マクロファージの慢性炎症を抑制する遺伝子サイレンシング技術を確立。疾患治療への応用可能性を示す革新的ナノ医療プラットフォームです。

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