Name: 哺乳類の体組成と水消費量を評価するための非侵襲的で非致死的なツールとしての重水素酸化物の使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 学ぶ重水素酸化物希釈法による哺乳類の体組成と水消費量の非侵襲的測定法。絶滅危惧種や家畜の生理学研究に有用で、皮下投与とFTIR分光光度法を用います。

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この研究は、MDC協同組合協定(#416)、米国森林サービス協同組合協定(16-JV-11242311-118)、米国獣医栄養学会、ウォルサム/ロイヤルカニン、米国グラント(助成金番号:00049049)、NIHトレーニング補助金(助成金番号:T32OS011126)、ミズーリ大学獣医学研究プログラムによって支持されました。著者らは、この原稿を事前に見直してくれたシャノン・エーラーズに感謝しています。D2 O規格を提供し、研究室の使用を許可してくれたロバート・バックス博士に感謝します。

ここに記載されているすべての実験は、ミズーリ大学動物管理使用委員会によって承認され、ミズーリ州保全省(MDC)野生生物科学収集許可(許可#16409と#17649)の下で実施されました。
1. 滅菌、等張、食剤D2Oストック溶液の調製
<ol><li>9.0 g/Lの50 mLのストック溶液を作る D2 O.<ol>
<li>450 mgの医薬品グレードのNaClを計量し、すべてのNaClを100mLの殺菌ビーカーに移します。ラボノートにNaClの正確な量を小数点以下4桁に記録します。</li>
		<li>無菌の段階的なシリンダーを使用して、99.8%以上の重水素酸化物の50gを測定し、NaClを含む無菌ビーカーに移します。実験室のノートまたはスプレッドシートで4の小数点以下の位置に重水素酸化物の正確な量を記録します。</li>
		<li>サブミクロン孔(0.2μm)を有する非発熱性滅菌ディスクフィルターを介して、イソスモティック強度NaCl(9.0 g/L)のフィルター10 mLをフィルターします。</li>
		<li>10 mLシリンジバレルを取り付けたサブミクロンの細孔(0.2μm)を備えた非火性無菌ディスクフィルターに20G針を取り付けます。100 mLの無菌の空のバイアルの中隔に挿入します。</li>
		<li>22 G針に真空管を取り付け、100 mLの無菌バイアルの中隔に針を差し込みます。</li>
		<li>10 mLのストック溶液をシリンジ樽に注ぎます。D2 Oストック溶液がゆっくりと滅菌バイアルにろ過し始めるまで、真空をゆっくりとオンにします。50 mLがろ過されるまで、D2Oストック溶液をシリンジバレルに注ぎ続けます。 注:ストック溶液は、必要な用量に応じて希釈または濃縮する必要があります。D2Oの用量は、分析方法の種および感度に基づいて変化する。猫の場合、働く溶液は、0.7 g/kg D2Oの用量を投与するために使用された。上述のストック溶液は、用量の正確な測定を可能にしながら、動物に皮下に導入されるNaCl溶液の量を最小限に抑える。コウモリなどの小型哺乳類の場合、この濃度は0.1600g/mLなどの働く溶液に希釈する必要があります。この濃度により、0.75 g/kgD 2O の用量を正確に測定し、約 100 μL 以下の NaCl 溶液で投与することができます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 滅菌、等張性、コウモリ用のD2Oストック用溶液の調製
<ol><li>10 mLの空の生殖バイアルの重さ、および最も近い4の小数点以下の場所に重量を記録する。タレスケール。</li>
	<li>1.0 mLのシリンジを使用して、D2Oストック溶液の0.65mLをタールした10mLの無菌バイアルに移します。D2O から小数点以下 4 桁の重みを記録します。タレスケール。</li>
	<li>10 mL空のバイアルでD2Oの体積を計算します。次の式を使用します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq1.jpg"> ここで、Wは重みを記録し、Dは 99.8% D2O (1.107 g/mL) の密度です。</li>
	<li>D2Oの計算された体積と既知の重量を使用して、〜0.1600 g/mLの働き溶液を作るのに必要な等張生理液の体積を決定します。</li>
	<li>10 mLの滅菌バイアル、22G針(真空管に取り付けられた)の中隔に挿入します。10 mLの滅菌バイアルの中隔に挿入し、20G針(10mLシリンジバレルを取り付けた0.22μmの注射器フィルターに取り付けた)。</li>
	<li>計算された等張NaClの質量/体積をシリンジバレルに注ぎ、真空をオンにして無菌10mLバイアルにゆっくりと滴り落ちるようにします。</li>
	<li>バイアルの重量を記録し、〜0.1600 g/mLの働く溶液が作成されていることを確認します。</li>
</ol>3. 大きな茶色のコウモリ(D2Oを持つエプテシカス・フツーカス)の体組成の決定
注: プロトコルで使用される D2O のストックソリューションは 0.1598 g/mL です。血液を採取する前に、最大200μLの血液を除去することは、コウモリの全血液量の10%であり、血液採取のための制度的動物ケアおよび使用委員会(IACUC)が定めたガイドラインの範囲内であることを確認してください。すべての動物は空腹を確実にするために絶食または腹部を触診する必要があります。最近の食事は、体脂肪を決定するための計算が動物の体重に依存するので、混乱した結果をもたらす動物の体重を変更する可能性があります。
<ol><li>大きな茶色のコウモリを麻酔する。<ol>
<li>誘導には5.0%のイソファフルランを使用してください。0.5%-3.0%イソファフルランを使用して麻酔の安定した平面を維持します。</li>
		<li>ペダル離脱反射(バットのつま先をつまむ)をテストすることによって、適切な麻酔の深さを決定します。コウモリは感覚に反応すべきではなく、呼吸数はゆっくりと安定したままであるべきです。麻酔の安定した平面を維持するために必要に応じてイソファフルランを調整します。</li>
		<li>IACUCが要求するイソルランレベル、心拍数、呼吸数、その他の情報を記録する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>大きな茶色のバットの重量を量り、小数点以下4位に重量を記録します。</li>
	<li>アルコールの準備パッドでインターフェモラル静脈の上にウロパタギウム(尾膜)をきれいにし、乾燥させます。インターフェモラル静脈の上に石油ゼリーの薄い層を適用します。</li>
	<li>29G針を使用して、インターフェラール静脈の背部を穿刺し、プラスチック製のヘパリン毛管チューブを使用して100μLの血液を採取します。採取後に各チューブをそっと転がしてヘパリンナトリウムと全血を適切に混合し、チューブにラベルを付けます。</li>
	<li>小型哺乳類用に較正されたDXAマシンを使用して、コウモリ10の3つのDXAスキャンを取得する。</li>
	<li>kg のバット重量に 0.75 g/kg の D2O 線量を掛けて注入する D2O の質量 (g 単位) を決定します。D2O線量の重量を働く溶液の濃度で割ることによって計算されたD2O用量(V)の体積を決定する。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq3.jpg">
</li>
	<li>計算されたD2Oの体積を引き出すために29 G針が付いているインスリン注射器を使用する。D2O、インスリンシリンジ、および針を計量する。小数点以下4桁に記録します。</li>
	<li>麻酔バットの腰の後部に皮下にD2Oを注入する。</li>
	<li>コウモリが麻酔から回復し、注射の時間を記録できるようにします。</li>
	<li>注射直後に、29G針を装着して現在空のインスリン注射器を秤量する。小数点以下4桁の重みを記録します。</li>
	<li>インスリン注射前の注射後の注射量を、プレインジェクションD2O充填されたインスリンシリンジから差し引くことによって注入されたD2Oの用量を決定する。小数点以下4桁に記録します。</li>
	<li>30分以内に、ヘマトクリット遠心分離機を使用して、各毛細管を5分間回転させます。ヘマトクリット遠心分離機で複数の速度が可能な場合は、10,000 x gに設定します。</li>
	<li>全血と血漿の間のプラスチック毛管を切断するために鋭いはさみを使用してください。200 μLピペットを使用して、プラズマをラベル付きの500 μL貯蔵チューブに直接排出します。</li>
	<li>平衡期間の後、インターフェモラル静脈からさらに100μLの血液を採取する。 注:平衡期間は種によって異なり、コウモリが魚雷に入る場合。大きな茶色のコウモリの場合、通常2時間は平衡期間に十分です。</li>
	<li>ステップ3.13を繰り返して、プラズマを第2ラベル付きの500μLマイクロ遠心ねじトップチューブに分離します。サンプルは分析まで-20°C以上に保存してください。</li>
</ol>4. フーリエ変換赤外線分光度測定法分析
<ol><li>砂浴の温度を60°Cに設定して蒸留を容易にします(他の血液成分から水とD2Oを分離できるようにします)。</li>
	<li>各プラズマサンプルのピペット50μLと1.5 mLの円錐型マイクロ遠心チューブキャップの内側に標準。品質管理としてD2Oの既知の濃度を含む規格を含む。 注:理想的には、各動物はサンプルごとに3つの反復を有し、報告された3つの反復の平均を有する。著者が利用するFT-IR装置に必要なサンプル量とサンプル量が限られているため、コウモリのサンプルに対しては複製は行われなかった。サンプルに50μL未満のプラズマが含まれている場合は、サンプル量を円錐型マイクロ遠心管キャップにピペットで取り付け、体積を記録します。</li>
	<li>マイクロ遠心栓キャップを逆さまに保ち、1.5 mL円錐形のマイクロ遠心チューブをキャップにねじ込みます。キャップをキャップ付きの逆(逆さま)チューブを砂浴中の砂浴に合わせて、最低12時間(一晩)置きます。</li>
	<li>12時間後、キャップを取り外し、新しいクリーンキャップに交換します。遠心分離機で10sのマイクロ遠心チューブをパルスします。</li>
	<li>以下の基準を作成する:0 ppm(1L蒸留水で0mgD2O)、293ppm(1L蒸留水で293mg D2O)、585ppm(585 mg D 2 O) 1 L蒸留水、878 ppm (878 mg D2O 1 L 蒸留水)、および 1170 ppm D2O (1 L 蒸留水で 1170 mg D2O) を使用します。 注: 上記の値は、標準曲線に推奨されます。250 ppm、500 ppm、750 ppm などの代替値を使用できます。</li>
	<li>フーリエ変換赤外線分光度測定 (FTIR) 分光計 (材料表) に液体透過セルを取り付けます。セルにメタノールを充填し、注入口を接続します。慎重に気泡のリスクを低減するためにメタノール注射器を除去しながら、ゆっくりとバックグラウンドの水でセルを充填します。出力ポートにチューブを取り付けて、サンプルの後分析を除去できるようにします。</li>
	<li>水の中のD2Oの分析のためのFTIR分光計ソフトウェア(材料のテーブル)を準備します。このプロトコルで使用される分光器ソフトウェアのパラメータ設定を表1に示します。</li>
	<li>希釈液、0.22 μm 濾過、蒸留水を使用して、バックグラウンドサンプルを収集します。これは、標準に使用されるのと同じ水でなければなりません。</li>
	<li>0ppmD2Oの40μLを注入し、スペクトルを記録します。スペクトルをカンマ区切り値(CSV)ファイルとして保存します。</li>
	<li>すべての標準のスペクトルを挿入して保存し、標準カーブを作成します。</li>
	<li>背景と標準曲線を 60 ~90 分ごとに繰り返します。</li>
	<li>蒸留したサンプルを液体透過セルに40μL注入し、スペクトルを保存します。 注:液体透過セルの容積に基づいて、標準および蒸留サンプルの注入量を変更します。サンプル体積が40μL未満の場合、またはバックグラウンド蒸留水で1:1を希釈する場合は、より小さな体積液体透過セルを使用してください。</li>
	<li>Jenningsら11またはスペクトルソフトウェアによって記述されるように、スプレッドシートプログラムを使用してFTIRスペクトルからの各サンプルのD2Oの濃度を決定する。反復が行われる場合は、平均濃度を使用して体組成を計算します。</li>
</ol>5. 体組成の計算
<ol><li>重水素濃縮(ppm)を、次式12を用いて各サンプルの原子濃度に変換する。 <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq4.jpg"> ここでxは、試料の測定された重水素濃縮(ppm)と0.0001557が、ウィーン標準平均海洋水(VSMOW)13で報告された重水素のモル分数である。</li>
	<li>次の式4,12,14を使用して、各サンプルの総体水を計算します。 <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq5.jpg">) ここで、E は測定されたエンリッチメント (原子%)バックグラウンド補正後の試料中の重水素の、Bはg中の注入質量、および0.998は注入されたD2Oの濃度である。 注:陰唇水素との重水素交換は、総体水量の2%の過大評価を引き起こします。総体水は、体重の2%によって総体水質量推定値を減らすことによって補正する必要があります。</li>
	<li>次の式を使用して、各コウモリの無脂肪質量(赤身の体重と他のすべての非脂肪成分)を推定します。 <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq6.jpg"> 注:健康でユーハイドレートされた非授乳コウモリのリーンボディ質量の分率水分含有量には、従来受け入れられている値 0.732 を使用します。無脂肪質量の分数水分含有量は、産後第15週に基づいて大きな茶色を授乳中に変化する可能性があります。他の種の場合は、文献に掲載されている値を使用するか、リーンボディ質量の計算を実行する前に、除脂肪体重の分数水分量を決定します。</li>
	<li>次の式を使用して体脂肪質量を推定します。 <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq7.jpg">
</li>
	<li>次の式を使用して、g の体脂肪質量をパーセント体脂肪量に変換します。 <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq8.jpg">
</li>
</ol>6. 食後の水組成の決定 (フェリス・カトゥス、 飼猫)
<ol><li>セクション 1 の説明に従って、ストック ソリューションを準備します。</li>
	<li>各猫の体重を小数点以下3桁にし、重みを記録します。ステップ3.6で説明した各ネコの用量を、0.70g/kgのD2O用量を用いて計算する。</li>
	<li>ステップ 3.7-3.8 で説明されているように各用量を準備します。インスリン注射器の代わりに22 G針で3 mLまたは5 mLシリンジを使用する。</li>
	<li>全血500μLを採取し、その後、0.7 g/kg D2O.遠心分離体全血を2,000 x gで15分間投与し、分析まで-20°Cで1.5mLマイクロ遠心スクリュートップチューブにプラズマを貯蔵します。</li>
	<li>全血4時間の注入後に500μLを集める。全血を2,000 x gで15分間遠心分離し、分析まで-20°Cの1.5mLマイクロ遠心スクリュートップチューブにプラズマを貯蔵します。</li>
	<li>注射後14日間、全血500μLを採取する。全血を2,000 x gで15分間遠心分離し、分析まで-20°Cの1.5mLマイクロ遠心スクリュートップチューブにプラズマを貯蔵します。 注:採血の間隔の日数は、実験の必要性と、D2Oがバックグラウンドレベルより上で検出できる注射後の期間に基づいて行うことができます。14日間はフーパーらから食事治療ブロックの長さだった.</li>
	<li>セクション4に従ってFT-IR解析を行い、このプロトコルのセクション5に従って体組成を計算する。</li>
	<li>次の式を使用して、mL/日の水消費量を計算します。 <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq9.jpg"> <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq10.jpg"> <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/59442/59442eq11.jpg"> ここでTBWは全体水、初期D2Oおよび最終D2Oは、注入後のD2Oサンプル中のppmで測定された濃度である。</li>
</ol>

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</ol>

著者たちは開示するものは何もない。

重水素酸化物の使用は、1940年代17年以降に使用されており、ヒトおよび様々な国内および野生生物種4、6、7に使用されている。生体電気インピーダンス解析(BIA)、DXA、定量磁気共鳴(QMR)など、その他の非破壊技術が開発されています。各方法には、体組成を評価するための特定の方法論を選択する前に考慮すべき長所と短所があります。このプロトコルは、身体組成を評価するための重水素酸化物の比較方法としてDXAを使用するように選択され、機器は最小限のコストで大学の中核的なリソースとして利用可能であるため、スキャンあたり最小限の時間(バットあたり30秒)、体温や皮膚断熱などの変数に敏感ではありません。
重水素酸化物希釈技術を目的種に適応させる場合、平衡18に要する時間を決定するためにパイロット研究を開始すべきであ...

身体状態スコアリングシステムおよび身体状態指数は、種1、2の健康状態または適合性を評価するために使用される一般的な技術である。多くの国産および動物学の種は、動物の筋肉と表面性脂肪組織を評価するために使用されるユニークな体の状態スコアリング(BCS)システムを持っています3.ただし、BCS 評価は評価者に依存し、トレーニングを受けた評価者によって評価された場合、BCS は客観的または半定量的な測定になります。野生動物種では、身体状態指数はBCSではなく一般的に使用され、前腕2に対する体重と体の大きさまたは体重の比率に基づいています。身体状態のインディシスは、しばしば採餌の影響によって混乱し、体の大きさだけでなく、統計的および没収的な問題4によって混乱することができます。
体の状態スコアリングシステムと体の状態のインデックスの代替は、体組成を決定するために安定した同位体を使用しています。一般的に用いられる安定同位体は、水素原子が重水素同位体である非放射性水である重水素酸化物(D2O)である。本研究で説明した重水素酸化物希釈法は、ヒト5および広範囲の種4、6、7における体組成を推定するために用いられる非主観的、定量的、および反復可能な技術であり得る。この技術は、野生生物の体組成を研究するのに有利です。たとえば、管理アクションの前後など、体組成の縦方向の変化を評価するために使用できます。しかし、いくつかの野生生物種の重水素酸化物は、実際の水分含有量を過大評価することができます8.従って、種に対する技術を適応させる場合、非絶滅危惧種の重水素法とカーカス分析を比較して、その方法を検証することが重要である。絶滅危惧種や絶滅危惧種の場合、二重X線吸収測定(DXA)などの非破壊法は、完全な死体分析のゴールドスタンダード破壊法との代替比較方法として考慮されるべきである。
体組成に加えて、D2O希釈技術は、個々の動物9の水消費量を決定するために使用することができる。このD2Oのユニークな応用は、研究の質問に答えるだけでなく、大きな社会的な環境に収容されている個々の動物の水消費量を評価するのに役立ちます。
ここでは、昆虫、大きな茶色のコウモリ(エッテシカス・フスカス)、肉食動物、猫(フェリス・カティス)の水消費量を評価するための体組成を評価するためのD2O希釈技術の適応について説明します。

<table><tbody><tr><td>0.2ミクロンの非発熱性ディスクフィルター</td><td>Argos Technologies</td><td>FN32S</td><td>ナイロン、直径30mm、0.22um、滅菌</td></tr><tr><td>1.5mL円錐形微量遠心チューブ</td><td>USAサイエンティフィック</td><td>1415-9701</td><td>1.5ml自立型微量遠心チューブ、天然、青いキャップ付き</td></tr><tr><td>注射用10mL滅菌ガラスバイアル</td><td>マウンテンサイド医療機器</td><td>MS-SEV10</td><td>透明、滅菌ガラス注入ユニット</td></tr><tr><td>10 mLシリンジ</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td>305219</td><td>滅菌済み 10 mL シリンジ 個包装</td></tr><tr><td>注射用 100 mL 滅菌ガラスバイアル</td><td>マウンテンサイド医療機器</td><td>AL-SV10020</td><td>透明、滅菌ガラス注射ユニット</td></tr><tr><td>20 ゲージ針</td><td>エクセル</td><td>26417</td><td>針 皮下注射 20g x 1 インチ プラスチックハブ (黄色) / レギュラーベベル</td></tr><tr><td>22 ゲージ針</td><td>エクセル</td><td>26411</td><td>針皮下22g x 1 "プラスチックハブ(黒)/レギュラーベベル</td></tr>酸化<tr><td>重水素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882-25G</td><td>99.9原子%D</td></tr><tr><td>イソフルオラン</td><td>ベトン</td><td>3060</td><td>フルリソフルラン、USP</td></tr><tr><td>OMNICスペクトルソフトウェア</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>833-036200</td><td>FT-IR標準ソフトウェア</td></tr><tr><td>ワセリン</td><td>305212311006</td><td></td><td>ワセリン、100%純粋なワセリン、オリジナル、皮膚保護剤</td></tr><tr><td>プラスチック毛細血管チューブ革新的な</td><td>医療技術</td><td>100050</td><td>ナトリウムヘパリン抗凝固剤、50 &mu;L容量、長さ30mm</td></tr><tr><td>密閉型液体分光光度計 SL-3 FTIR CAF2 Cell</td><td>International Crystal Laboratory</td><td>0005D-875</td><td>0.05 mm パスレングス</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>EMD ミリポア</td><td>1.37017</td><td>バイオ医薬品生産に最適</td></tr><tr><td>サーモエレクトロン ニコレット 380 FT-IR 分光計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>269-169400</td><td>製造中止モデル、新しいモデルも利用可能</td></tr></tbody></table>

哺乳類の体組成と水消費量を評価するための非侵襲的で非致死的なツールとしての重水素酸化物の使用

Using Deuterium Oxide as a Non-Invasive, Non-Lethal Tool for Assessing Body Composition and Water Consumption in Mammals

身体状態スコアリングシステムおよび身体状態指数は、種の健康状態または適合性を評価するために使用される一般的な技術である。身体状態スコアリングシステムは、評価者に依存し、非常に主観的である可能性を有する。身体状態指数は、採餌、体重の影響、統計的および没収的な問題によって混乱する可能性があります。体の状態スコアリングシステムと体の状態のインデックスの代替は、体組成を決定する重水素酸化物などの安定同位体を使用しています。重水素酸化物希釈法は、ヒト、野生生物、および国内種の体組成を推定するために使用される反復可能な定量的手法である。さらに、重水素酸化物希釈技術は、個々の動物の水消費量を決定するために使用することができる。ここでは、大きな褐色コウモリ(エプテシカス・フスカス)における体組成を評価し、猫の水消費量を評価するための重水素酸化物希釈技術の適応について説明する。

重水素酸化希釈技術は、様々な種の体組成を評価するために使用することができる。適応性を実証するために、北米の昆虫コウモリ種、エッテシカス・フスカス、代表的な結果のための大きな茶色のコウモリで重水素酸化物希釈技術の最初の使用を報告しています。タイミングプラトーは、平衡期間が不明な種で行われるべきとして、プレD2O注射血液サンプルを採取することによって完成した。非魚雷コウモリの注射後2時間は平衡に適していると判断した。平衡時間が知られていると共に、13個の野生捕獲された大きな茶色のコウモリと8匹の捕虜の大きな茶色のコウモリの全身水分、赤身の体重、および体脂肪量が決定された(表2)。さらに2つの野生の大きな茶色のコウモリと5つの捕虜の大きな茶色のコウモリは、負の体脂肪量を有すると決定された。負の体脂肪量は、重水素酸化物の全用量を受け取らず、平衡期に魚雷になり、異常に大きな脂肪量と最小の無駄のない質量を有する、またはDXAによって決定される3%−5%の体脂肪以下のコウモリ(表3)</stron...

この記事では、全体水、赤身の体重、体脂肪量、および水の消費量を決定するために、昆虫と肉食動物の2つの哺乳類における重水素酸化物希釈技術について説明します。

Body condition scoring systems and body condition indices are common techniques used for assessing the health status or fitness of a species. Body ...

このプロトコルを使用して、重水素酸化物、またはD2O、水の非放射性、安定同位体、体組成および水消費量を推定するために使用することができる。この技術は非侵襲的であり、したがって絶滅危惧種、ならびにヒトおよび家畜種における体組成を評価するために使用することができる。重水素酸化物希釈技術のユニークなアプリケーションは、高い奪還率または社会的に収容された動物の自由範囲の野生生物の水消費量を測定する能力です。麻酔は必要ないが、重水素酸化物を送達する前に動物を鎮静させるために皮下注射を与えることに精通していない人にとっては簡単かもしれない。サラ・フーパーと私と一緒に手順をデモンストレーションするのは、アマンダ・エシェルマンとアシュリー・コーワン、獣医学生、そして私の研究室の大学院生であるアリシア・ロイスタチャーです。1リットル当たり9グラムの50ミリリットルのストック溶液を塩分化した重水素酸化物を作るために、最初に450ミリグラムの医薬グレードの塩化ナトリウムを量り、正確な量を小数点以下4桁に記録する。すべての塩を殺菌した100ミリリットルビーカーに移し、滅菌された段階的なシリンダーで99.8%以上の重水素酸化物の50グラムを測定します。重水素酸化物の正確な量を小数点以下4桁に記録し、重水素酸化物を塩化ナトリウムの滅菌ビーカーに移します。次に、10ミリリットルのシリンジバレルを取り付けたサブミクロン孔を備えた非発熱性の無菌ディスクフィルターに20ゲージの針を取り付け、無菌、空、100ミリリットルバイアルの中隔に針を挿入します。真空管を22ゲージの針に取り付け、針を100ミリリットルバイアルの中隔に挿入します。その後、10ミリリットルのイソスモティック強度の塩化ナトリウムをシリンジバレルにロードし、重水素酸化物溶液がゆっくりとバイアルにろ過し始めるまでゆっくりと真空をオンにします。50ミリリットルの体積全体がろ過されるまで、重水素酸化物ストック溶液をシリンジバレルに注ぎ続けます。麻酔下のコウモリのつまみつまみへの応答の欠如を確認した後、アルコール準備パッドを使用して大腿静脈の上にウロパタギウムをきれいにし、乾燥させた乾燥した尾膜を可能にする。石油ゼリーの薄い層を大腿静脈の上に塗布し、29ゲージの針を使用して、大腿静脈の背部部分を穿刺します。その後、100マイクロリットルの血液を収集するためにプラスチックナトリウムヘパリン毛細管を使用してください。全血とヘパリンナトリウムの適切な混合を確実にするために、標識する前に採血後に各チューブをそっと転がす。注入するグラム中の重水素酸化物の質量を決定した後、重水素酸化物の適切な量を有する29ゲージ針を装備したインスリン注射器をロードする。重水素を装填したインスリン注射器と針の重量を秤量し、体重を小数点以下4位に記録し、麻酔付きコウモリの後部股関節領域の上に皮下に重水素酸化物の全容を注入する。帯電防止ドラフトシールドを備えた精密スケールを使用し、注入前に負圧を確保するためにプランジャーを引き戻すことをお勧めします。注射直後に、現在空のインスリン注射器と針の重量を量り、小数点以下4桁に体重を記録する。血液採取後30分以内に、ヘマトクリット遠心分離機を使用して、各毛細管を10,000回gで5分間回転させます。鋭利なはさみを使用して、全血と血漿の間のプラスチック毛細管チューブを切断し、200マイクロリットルのピペットを使用して、プラズマを標識された500マイクロリットル貯蔵チューブに直接排出します。平衡期間の後、ちょうど示したように、大腿静脈から別の100マイクロリットルの血液を収集して保存する。FTIR分光光度法解析では、蒸留を容易にするために砂浴の温度を摂氏60度に設定し、各プラズマサンプルと標準の50マイクロリットルを個々の1.5ミリリットルの円錐形のマイクロ遠心分離キャップに加えます。マイクロ遠心分離機のキャップを逆さまに保ち、1.5ミリリットルの円錐型マイクロ遠心分離チューブをキャップにねじ込み、反転チューブを砂風呂に接触させ、最低12時間置きます。翌朝、新しい清潔なキャップを各チューブに置き、マイクロ遠心分離機でマイクロ遠心分離管を10秒間パルスします。液体透過セルをFTIR分光計に取り付け、メタノールでセルを充填します。注入口を接続し、気泡の危険を減らすために慎重にメタノールシリンジを除去しながら、バックグラウンド水でセルをゆっくりと満たします。サンプルの後分析を取り外しできるように、出力ポートにチューブを取り付け、FTIR分光器ソフトウェアを開きます。テーブルに従ってパラメータを設定し、希釈剤、0.22マイクロメートルのろ過水を使用してバックグラウンドサンプルを収集し、蒸留水。100万個の重水素酸化物標準ごとにゼロ部品の40マイクロリットルを注入し、カンマ区切り値ファイルとしてスペクトルを記録して保存します。標準曲線を作成するためにすべての標準のスペクトルを注入して保存した後、液体透過セルに各蒸留サンプルの40マイクロリットルを注入し、スペクトルを保存します。既知の平衡時間では、野生に捕まった大きな茶色のコウモリと捕虜の大きな茶色のコウモリのための総体水、無駄のない体重、体脂肪量を決定することができます。負の体脂肪量は、重水素酸化物の全用量を受け取らない、平衡期に魚雷になる、異常に大きな脂肪塊と最小限の無駄のない質量を有する、またはデュアルX線吸収法によって決定される3〜5%以下の体脂肪を有する:以下の理由の1つ以上のために計算することができる。ここで、重水素酸化物希釈法と比較して重いX線吸収法によって求められる体脂肪の代表割合が示されている。2つの技術はよく相関しており、体脂肪量は体脂肪と体重の間に強い相関関係を示し、重水素酸化物希釈技術は一貫して体脂肪量を超えたり過小評価したりしていない。重水素酸化物希釈法は、以前に猫で検証されており、実験の各食餌ブロックの間に社会的に収容された猫の毎日の水消費量の測定を可能にするためにこの技術が適応されました。この技術は健康な動物に対してのみ実行されるべきであり、各動物に重さ、記録し、重水素酸化物の全用量を正確に提供する必要があることを覚えておいてください。完全なカルカス分析やDEXAなどの体組成を決定するための二次的な方法を、重水素酸化物技術を検証するために完了することができる。この技術により、各猫を分離せずに異常に大量の水を消費していた社会的に収容された猫を特定して水の消費量を測定することができました。

using-deuterium-oxide-as-non-invasive-non-lethal-tool-for-assessing

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Environment

環境

脂肪含有量分析は、定期的にマウス肥満モデルを活用した研究で実施しています。小さな動物のCTイメージングと解析の新たな方法は、長手方向のディテール豊かな脂肪含有量分析のために提供しています。小さな動物のCTイメージング、分析、および可視化を実行するためのステップの手順で、ここでは詳細なステップです。...

X線CTを用いたマウス肥満モデルにおけるセグメンテーションおよびFATボリュームの測定

出典: Tokunou、Y.、 et al、 Shewanella oneidensis MR-1の細胞外電子輸送に対する重水素速度論同位体効果の電気化学的検出。 J. Vis. 経験。...

酸化重水素を用いた微生物の電子輸送に対する速度論的同位体効果の測定

このプロトコルでは、体組成計と体組成とマウスの代謝パラメーターを特徴づける代謝動物監視システムの使用について説明します。高脂肪食摂取による肥満モデルは、これらの技術の適用のための例として使用されます。...

身体組成と高脂肪給電マウスにおける代謝ケージ分析

ここで全細胞外膜シトクロムシェワネラ oneidensis氏-1 複合体を介して細胞外の電子輸送の速度へのプロトン輸送の貢献を研究する電気化学実験のプロトコルを提案する.

電気化学検出の重水素速度論的同位体効果シェワネラ oneidensis氏 1 の細胞外電子輸送

ここで、ミトコンドリアの酸素消費量、栄養エネルギー論とプロトンのリーク、ミトコンドリア ATP 生成の非効率性の主な原因の定義する概念を測定するための方法を共有します。これらの結果は、ミトコンドリアの機能を評価するのに役立つ栄養の使用率で失われるエネルギーの 30%...

ホルスタイン種乳牛におけるミトコンドリア呼吸を推定する肝ミトコンドリアの酸素消費量とプロトン リーク動態測定

ここでは、in vivoで褐色脂肪組織における全脂肪酸de...

酸化重水素を用いた褐色脂肪組織における de novo 脂肪酸合成の定量的測定(英語)

2光子励起蛍光顕微鏡(2PEF)と統合された酸化重水素(重水D2O)プローブ誘導ラマン散乱(DO-SRS)顕微鏡を使用して、アミノ酸によって制御される細胞の代謝活動を直接視覚化するプロトコルを提示します。...

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ここでは、分子状酸素を消費する能力とは無関係に、哺乳類細胞のミトコンドリア機能を直接測定するためのアッセイをまとめたものです。...

哺乳類のミトコンドリア機能を測定するための酸素非依存性アッセイ(英語)

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超音波ガイド波を用いた皮質骨評価:健常者集団における再現性研究

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受精中に精子から卵子に移された父方代謝産物の質量分析同定のための安定同位体 生体 内標識

学ぶ重水素酸化物希釈法による哺乳類の体組成と水消費量の非侵襲的測定法。絶滅危惧種や家畜の生理学研究に有用で、皮下投与とFTIR分光光度法を用います。

哺乳類の体組成と水消費量を評価するための非侵襲的で非致死的なツールとしての重水素酸化物の使用

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