Rhoキナーゼ活性の一過性阻害によるヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞の増着増強

我々のデータは、Rhoキナーゼ活性の一過性阻害が梗塞動物の心臓に移植された後のhiPSC由来心筋細胞の接着、生存、および生着を増強することを示している。傷ついた動物の心臓に移植されたhiPSC由来の心筋細胞の生着を増加させる、シンプルで低コストで高効率な方法を提供します。この技術は、急性心筋梗塞および心不全において細胞の生着速度を安全かつ効率的に改善することができるので、心臓機能、血管、およびアポトーシスの結果として生じる改善に寄与する。

私たちはhiPSCでプロトコルをテストしただけですが、これらの方法は、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、エトセトラなどの他のタイプの細胞に適用することができます。Y-27632治療の投与量および持続時間は重要である。この視覚的なデモンストレーションでは、プロトコルのすべての重要な手順を詳細に示すことができます。

hiPSC-CM分化後21日目に、培地を吸引し、滅菌PBSで細胞を一度洗浄する。摂氏37度で1回あたり0.5ミリリットルの細胞解離酵素を5〜7分間インキュベートします。インキュベーション時間後、細胞を十分に解着させるために1ミリリットルのピペットを用いて細胞懸濁液を繰り返しピペット化する。

次に、各ウェルに1ミリリットルの中和溶液を加え、15ミリリットルの遠心分離管に細胞混合物を集め、遠心分離機を200回gで3分間回収する。遠心分離後、上清を捨て、中和液中等液中の細胞を再び懸濁する。その後、ゼラチンコーティングされた6ウェルプレートに細胞を再植え付けし、ウェルあたり200万個の細胞の密度を持つ。

24〜48時間後、培養培地を3〜5日間精製培地に交換する。移植前に、10マイクロモルY-27632を添加したRBプラス培地で12時間治療群の細胞を培養する。同様に、12時間の1マイクロモルのRBプラス培地中の細胞にベラパミル処理を行う。

処理後、HIPSC-CMをPBSで1回洗浄し、1ウェルあたり0.5マイクロリットルの細胞解離酵素で細胞を最大2分間インキュベートします。1ミリリットルのピペットを使用して細胞懸濁液を繰り返しピペットし、細胞を完全に解化する。次に、中和溶液で細胞を中和し、15ミリリットル遠心管に細胞混合物を集め、遠心分離機を200回gで3分間回収する。

遠心分離後、注射に備えて5マイクロリットル当たり0.1百万個の細胞の濃度でPBS中の細胞を再懸濁する。心筋梗塞誘導直後に、5マイクロリットルの対照hiPSC-CM、Y-27632前処理hiPSC-CM、ベラパミル処理hiPSC-CM、または各部位のマウスの心筋にPBSの等しい量を注入し、梗塞領域に1つ、梗塞周辺の領域に2つ注入する。カルシウム過渡および収縮性検出を行う12時間前に、10マイクロモルY-27632、100ナノモルRA、1マイクロモルベラパミル、または同等量のPBSをhiPSC-CMの培地に添加する。

次に、培地を捨て、PBSでプレートを1回洗います。培地を、界面活性剤ポリオールの体積%あたり0.02重量を含むフェノールレッドフリーDMEMに変更し、5マイクロモルカルシウム指標、および対応するY-27632、RA、ベラパミル、またはPBSの等体積を含み、37°Cでプレートを30分間インキュベートします。インキュベーション後、上清を捨て、染色を含まないDMEMで細胞を3回洗浄し、中程度を30分間休ませてマッピング色素をエステル化解除する。

セルシードのカバースリップを露天風呂室に入れ、自動温度コントローラで37°Cに平衡したマイクロインキュベーションシステムにチャンバーを挿入します。Tyrodeの溶液とそれを浸透させ、そして絶え間なくRI、RA、またはPBSを注入溶液に加える。反転蛍光顕微鏡とレーザースキャンヘッドを使用して、X-t ラインスキャンを使用して自発的なカルシウム過渡を記録します。

共焦点顕微鏡の差動干渉コントラスト機能を使用してhiPSC-CMの自発的な収縮を記録します。移植した細胞の生存率は、ルシファーゼ活性の増加によって確認された。ヒト心臓トロポニンTおよびヒト核抗原発現の増加は、Y-27632前処理が細胞の生着率を有意に改善できることを示した。

Y-27632前処理細胞は、より大きく、より定義された棒状の細胞骨格構造を示した。また、Y-27632前処理はTUNEL陽性細胞を減少させ、インビボでの移植されたhiPSC-CMアポトーシスの減少を示す。ウェスタンブロットは、Y-27632前処理がインテグリンβ-1およびN-カドヘリンの発現を増加させ、ホスホミオシン軽鎖2の発現を低下させ、示唆した。

この変更は、Y-27632離脱後72時間で正規化された。in vitroマウスHL-1細胞取り付け実験は、Y-27632前処理がHL-1に対するhiPSC-CM付着率を有意に増加させたことを示した。Y-27632前処理は収縮力、ピークカルシウム過渡性蛍光、およびカルシウム一過性持続時間を減少させた。

Y-27632前処理は、cTnIおよびcTnTの発現を有意に減少させることによって心筋細胞収縮を調節した。Y-27632と同様に、ベラパミル前処理はルシファーゼ活性およびhcTnT/HNA二重陽性細胞の数を増加させました。最も重要な工程は、10マイクロモルY-27632を添加したRb-プラス培地中で12時間の治療群の細胞を培養することです。

この方法に基づいて、細胞の生着速度をさらに高めるY-27632の徐放は有望な戦略である。この技術は、研究者が生体内のCMのhiPSCの生理学と機能を研究する道を開きます。心筋細胞分化に用いられる低分子CHIR99021は危険であり、呼吸刺激を引き起こす可能性がある。

何らかの方法で吸入したり吸い込んだりしないでください。