Name: ウイルスベクターの脳内注射によるインビボグリア細胞のインターニューロンへの直接リプログラミング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: 学ぶAAVベクターを用いた脳内グリア細胞からパルブアルブミン陽性インターニューロンへの直接リプログラミング法。この手法は神経精神疾患の細胞置換治療研究に応用可能である。

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マルセラ・ビルテレは、マリー・スクワドウスカ・キュリー・イノベーティブ・トレーニング・ネットワークおよび交付契約第676408号の下で、欧州連合ホライズン2020プログラム(H2020-MSCA-ITN-2015)によって資金提供されています。ダニエラ・ライランダー・オットソンはスウェーデン研究評議会(2017-01234)から資金提供を受けています。

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<li>Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper-free+Production+of+Laboratory+Grade+AAV+and+Purification+by+Iodixanol+Density+Gradient+Centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Methods+%26+Clinial+Development%22%5BJournal%5D)">Helper-free Production of Laboratory Grade AAV and Purification by Iodixanol Density Gradient Centrifugation.</a> Molecular Therapy Methods & Clinial Development. 10, 1-7 (2018).</li>
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</ol>

著者は何も開示していない。

生体内では、Cre発現マウス株におけるAAV FLEXベクターを用いて直接リプログラミングを行うことができる。リプログラミングの有効性に関してマウス株間の違いが観察されていることに注意することが重要です。線条体の生体内リプログラミングでは、NG2-Creマウスラインは、他の株と比較した場合、より効率的であることが証明されています。新しい動物株を使用し始める前に、動物の年齢がしばしばこのタンパク質発現の特異性に影響を与えるので、時間の経過とともにCre発現に関するマウスプロバイダーのガイドラインをチェックすることが重要です。我々の研究では、NG2グリア以外の細胞でCre発現のリスクがあったため、12週以上の動物は生体内リプログラミングに使用されなかった。シナプシン-FLEX-GFP構造のみで注入された対照動物の一定の存在および監視が助言される。これにより、リプログラミング遺伝子(ALN)を使用しない場合に存在してはならないGFP陽性細胞の動物のモニタリングが可能になります。
新たにプログラムされたニューロンを同定するためには、このプロトコルに記載されているようなニューロン特異的同定方法が最も重要である。これにより、同所細胞におけるリプログラミング時に特に関連性のある内因性の周囲細胞から再プログラムされたニューロンを適切に同定し、区別することができます。
ウイルス注射のための正しい構造を標的にすることも重要です。したがって、ウイルス注射のための立体手術は重要であり、特に脳のより小さな構造を標的とする場合には、正確にアプローチする必要があります。
我々は以前に、同じリプログラミング因子を用いたインビトロリプログラミング実験に基づいて生体内リプログラミングの結果を予測することは信頼できないことを示した。したがって、関心のあるすべての要因は、生体内でテストする必要があります。私たちの手の中では、これらの遺伝子が他のニューロンの発達に関与しているにもかかわらず、多くの異なる因子の組み合わせがニューロンの同じサブタイプ(すなわち、生体内のニューロン11)を与えます。
再プログラムされたニューロンのための全細胞パッチクランプは繊細な技術であり、組織処理は良好な結果のために重要です。氷冷クレブス溶液との灌流はティッシュの質を改善する。また、パッチを当てたニューロンは慎重に治療する必要があります。再プログラムされたニューロンの成熟および発現性同一性が全細胞パッチクランプを用いて幾分評価できるとしても、これらの細胞は内因性の同等物と完全に比較できない。ゲノムシーケンシング(例えば、RNAシーケンシング)などの追加のタイプの分析は、再プログラムされた細胞同一性をさらに確認するために使用されるべきである。
ここに記載される技術は、脳内で神経置換が必要な将来の治療法の開発のために考慮することができる。生体内リプログラミングはまだ初期段階にあり、ヒトへの翻訳はまだ予見されていないが、この技術は脳内の外因性遺伝子機能を評価し、生体内の細胞成熟を研究する方法を提供する可能性がある。

この方法の全体的な目標は、生体内の脳常駐グリアを、パルブアルブミン発現インターニューロンなどの機能的およびサブタイプ特異的ニューロンに効率的に変換することです。これは外因性細胞源を必要とせずに脳疾患に対する代替細胞補充療法の開発に向けた一歩を提供する。また、その場でセルの運命スイッチを研究するためのツールを作成します。
脳は新しいニューロンを生成するための限られた能力を持っています。.したがって、神経疾患においては、脳修復のための外因性細胞源の必要性がある。このために、細胞の異なる供給源は、原発組織、幹細胞由来細胞および再プログラムされた細胞1、2、3からの細胞を含む、長年にわたって激しい研究を受けてきた。常駐脳細胞をニューロンに直接リプログラミングすることは、患者自身の細胞を使用して脳内に新しいニューロンを生成するため、脳修復のための魅力的な方法を提供できる最近のアプローチです。現在までに、脳4、5、6、7 8、9などの異なる脳領域におけるウイルスベクター配信を通じた生体内リプログラミングに複数の報告が示されている。皮質、脊髄、線条体および中脳5、10、11、ならびに無傷および病変性脳5、8、11、12。阻害性ニューロンと興奮性ニューロンの両方が得られている 4,8,しかし、これらの細胞の正確な表現型または機能性はまだ詳細に分析されていません。
このプロトコルでは、生体内再プログラムされたニューロンのより効率的なリプログラミングと細胞特異的同定について述べている。機能性および免疫組織化学的形質に基づく神経成熟および表現型特性の機能評価のためのプロトコルを提供する。
我々は、誘導性AAVベクターとGFPレポーターを用いて、生体内で再プログラムされたニューロンを同定した。ウイルスベクターのこの選択は、脳の分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染するという利点があり、標的細胞の数を増加させ、レトロウイルス7、8の使用に代わるものとして。ニューロン特異的なシナプシン駆動FLEXレポーター(GFP)により、新たに生成されたニューロンを特異的に検出することが可能になりました。これまでの研究では、生体内リプログラミング7、9にサブタイプ特異的プロモーターを使用しており、特定の細胞型におけるリプログラミング遺伝子およびレポーターの発現も可能にしている。しかし、この方法では、レポーターとニューロンマーカーの共発現の死後分析により、再プログラムされたニューロンのさらなる同定が必要である。本明細書に記載されているようなニューロン特異的レポーターの使用は、直接的な同定を可能にする。これは成功した転換の直接証拠を提供し、パッチクランプ電気生理学に必要な生きている細胞の同一証明を可能にする。

<table><tbody><tr><td>REAGENTS for AAV5 CLONING AND VIRAL VECTOR PREPARATION</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAAV-CA-FLEX</td><td>AddGene</td><td>38042</td><td></td></tr><tr><td>Ascl1</td><td>AddGene</td><td>67291</td><td>NM_008553.4</td></tr><tr><td>Lmx1a</td><td>AddGene</td><td>33013</td><td>NM_0033652.5</td></tr><tr><td>Nurr1</td><td>AddGene</td><td>35000</td><td>NM_013613.2</td></tr><tr><td>GFP-SYN</td><td>AddGene</td><td>30456</td><td></td></tr><tr><td>LoxP (FLEX) sequence 1</td><td></td><td></td><td>GATCTccataacttcgtataaagtatcctatac gaagttatatcaaataggaagaccaatgcttc accatcgacccgaattgccaagcatcgg acccataacttcgtataatgtatgctatacgaa gttatactagtcccgggaaggcgaacgcgga agaggctctaga</td></tr><tr><td>LoxP (FLEX) sequences 2</td><td></td><td></td><td>tactagtataacttcgtataggatactttatac gaagttatcattgggattcttgtc caagcatcaccatcgaccctctagtccacatct caccatcgacccataacttcgtatagcatacat tatacgaagttatgtccctcgaggttcgaa ttcgtttaaacGGTACCCTCGAC</td></tr><tr><td>pDP5</td><td>プラスミド工場</td><td>PF435</td><td></td></tr><tr><td>pDP6</td><td>プラスミド工場</td><td>PF436</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>FBS(ウシ胎児血清)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリンストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM(ダルベッコ改変イーグル培地)+ グルタマックス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>61965026</td><td></td></tr><tr><td>DPBS(ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>14190094 HEK293 細胞</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85120602-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Flasks</td><td>BD Falcon</td><td>10078780</td><td>175 cm2</td></tr><tr><td>Tris H-CL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10812846001</td><td> TEバッファーには10 mM、pH 8.0、溶解バッファーには50 mM、pH 8.5、IEバッファーには20 mM、pH 8.0、溶出バッファーには20 mM、pH 8.0 </td></tr><tr><td>EDTA</td><td>を使用 EDTA:Invitrogen</td><td>EDTA:AM9260G</td><td>TEバッファの場合は、1 mM EDTA</td></tr><tr><td>超純水</td><td></td><td></td><td>を使用します。超純水システム</td></tr><tr><td>CaCl2</td>、<td>SigmaAldrich</td><td>、C5080</td>、<td>2.5 M</td></tr><tr><td>ダルベッコ&acuteを参照してください。Thermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td> HBS用 140 mM; 溶解バッファー用 150 mM; IEバッファー用 15 mM; 溶出バッファー用 250 mM </td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td> 溶解バッファー用 : 1 mM </td></tr><tr><td>超遠心分離機用シーリングチューブ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>Quick-Seal&reg;&nbsp;ポリプロピレンチューブ</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep&trade;&nbsp;密度勾配ミディア</td>ム<td>シグマアルドリッチ</td><td>D1556-250ML</td><td></td></tr><tr><td>10mLシリンジ-18Gニードル</td><td>BD</td><td>305064</td><td></td></tr><tr><td>実験室用ガラス瓶VWR</td><td></td><td>?</td><td></td></tr><tr><td>陰イオン交換フィルター</td><td>PALL ラボラトリー</td><td>MSTG25Q6</td><td> Mustang Qメンブレン付きアクロディスクユニット </td></tr><tr><td>遠心フィルターユニット</td><td>メルク</td><td>Z740210-24EA</td><td> アミコンウルトラ4デバイス </td></tr><tr><td>エンドトキシンフリープラスミドDNA単離キット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A33073</td><td></td></tr><tr><td>Na2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>ファルコンチューブ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>コーニング 352196</td><td></td></tr><tr><td>ファルコンチューブ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>コーニング 352070</td><td></td></tr><tr><td>ガラスバイアル</td><td>ノバテック</td><td>30209-1232</td><td> CGGCCTCAGFGAGCGA </td></tr><tr><td>逆端子リピート (ITR) シーケンス</td><td></td><td></td>用フォワードプライマー <td> GGAACCCCTAGTGATGGAGTT </td></tr><tr><td>逆端子リピート(ITR)シーケンス</td><td></td><td></td><td>CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG </td></tr><tr><td>5&acuteのリバースプライマー;FAM / 3&acute;BHQ1 プローブ</td><td>イエナ バイオサイエンス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 mm フィルター</td><td>メルク</td><td>SLGV004SL</td><td>Millex-GV フィルター</td></tr><tr><td><ストロング>機器 AAV5 ウイルス ベクター プレパレーション</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>フリーザー -20 & °;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷凍庫-80°;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷蔵庫+4&deg;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAVウイルスルーム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>超純水システム</td><td>メルク</td><td>Milli-Q&reg;IQ 7000</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>VWR</td><td>444-0004</td><td></td></tr><tr><td>超遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>ベックマンオプティマ LE-80K 超遠心分離機</td><td></td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td>ツットナウアー</td><td>2540 EL</td><td></td></tr><tr><td>ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)</td><td>BioRad</td><td>C1000 タッチサーマルサイクラー</td><td></td></tr><tr><td>定量PCR (qPCR)</td><td>Roche</td><td>LightCycler&reg; 480システム</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>ソルバル ST16</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>TSGP02</td><td></td></tr><tr><td>ANIMAL MODEL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NG2-Cre マウス</td><td>ジャクソン</td><td>NG2-CrexB6129, ストック #008533</td><td></td></tr><tr><td> 脳へのリプログラミング因子の注入用試薬</強い></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>生理食塩水</td><td>Apoteket AB</td><td></td><td>70%</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>ソルブコ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソルフラン</td><td>Apoteket AB</td><td></td><td> 温水で1%溶液に希釈します。 </td></tr><tr><td>バーコン</td><td>・バイロダーム</td><td>7511&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ペントバルビタール</td><td>アポテケット AB</td><td>P0500000</td><td> i.p. 60 mg / mlの用量での最終手順用。. </td></tr><tr><td>スクロー</td>ス <td>メルク</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>トリパン ブルー</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>レトロビーズ</td><td>ルマフロー</td><td>R170</td><td></td></tr><tr><td>ブプレノルフィン</td><td>アポテケット AB</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>EQUIPMENT FOR INJECTION OF REPROGRAMMING FACTORS INTO THE BRAIN</td><td></td><td></td><td> RSG Solingen. </td></tr><tr>は<td>さみ</td><td>VWR</td><td>233-1552</td><td>Biochemから。</td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>VWR</td><td>232-0007</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>VWR</td><td>232-0120</td><td></td></tr><tr><td>メス</td><td>ホルダーVWR</td><td>RSGA106.621</td><td>番号20。</td></tr><tr><td>メス</td><td>VWR</td><td>RSGA106.200</td><td></td></tr><tr><td>脳定位固定装置フレーム</td><td>Stoelting Europe</td><td>51500D</td><td></td></tr><tr><td>マウス イヤーバー</td><td>Stoelting Europe</td><td>51648</td><td>5 ul</td></tr><tr><td>シリンジ 取り外し可能な針付き</td><td>ハミルトン カンパニー</td><td>65</td><td> 0,75 内径 1.5 外径。 </td></tr><tr><td>ガラスキャピラリー</td><td>Stoelting</td><td>50811</td><td></td></tr><tr><td>ガラスキャピラリープーラー</td><td>Sutter company</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>デンタルドリル</td><td>Agnthos AB</td><td>1464</td><td></td></tr><tr><td>シェーバー</td><td>Agnthos AB</td><td>GT420</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン チャンバーとポンプ</td><td>Agnthos AB</td><td>8323101</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>メルク</td><td>Z118400-30EA</td><td>25G</td></tr><tr><td>ニードル</td>ズ<td>メルク</td><td>Z192414&nbsp;Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>マウスと新生児ラット用定位固定装置用アダプター</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>加熱パッド</td><td>Braintree scientific, inc</td><td>53800M</td><td> Covidien 2187. </td></tr><tr><td>コットンガーゼ</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>22-037-902</td><td></td></tr><tr><td>ゴム管</td><td>エルファ・ディストリビューション</td><td>HFT-A-9.5/4.8 PO-X BK 150</td><td></td></tr><tr><td>綿棒</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>18-366-473</td><td></td></tr><tr><td><ストロング>全細胞パッチクランプ用試薬 RECORDINGS</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4-H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2-6 H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2-6 H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4-7 H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td> 超純水システム </td></tr><tr><td>超純水</td><td></td><td></td><td>1Mまたは2Mを準備してください。</td></tr><tr><td>KOH</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>P5958-500G</td><td></td></tr><tr><td>K-D-グルコン酸</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>G4500&nbsp;Sigma</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KOH-EGTA(エチレングリコール-ビス-N-テトラスチン酸)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889&nbsp;シグマ</td><td></td></tr><tr><td>KOH-ヘペス酸(N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸)</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Mg2ATP</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Na3GTP</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>G8877</td><td></td></tr>バイオ<tr><td>シチン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>ピクロトキシン</td><td>メルク</td><td>P1675&nbsp;シグマ</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>メルク</td><td>C239&nbsp;シグマ</td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT FOR WHOLE-CELL PATCH CLAMP RECORDINGS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスピペット</td><td>Sutter Company</td><td>B150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>ガラス毛細管プーラー</td><td>Sutter company</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>Leica VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>WaterBath</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>TSGP02</td><td></td></tr><tr><td>クランプフィットソフトウェア</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マルチクランプソフトウェア</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>REAGENTS FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY</td><td></td><td></td><td> 4%の濃度で使用してください。&nbsp;ご注意:&nbsp;PFAは強力な固定剤です。摂取や皮膚との接触を避けてください。</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド(PFA)</td><td>メルクミリポア</td><td>1040051000</td><td> 0.1%の濃度で使用してください。 </td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>10254640</td><td> Donkey.1:400の濃度で使用します。 </td></tr><tr><td>血清</td><td>メルクミリポア</td><td>S30-100ML</td><td>粉末をミリQ水で1 mg / mLに再構成します。.アリコートと-20°Cで保管します。C,&nbsp;光に敏感です。1:500の濃度で使用してください。</td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2&prime;-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td> 1: KPBS-T. </td></tr><tr><td>ストレプトアビジン-Cy3</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>434315</td><td>1:5000、ウサギ。</td></tr><tr><td>Anti-GAD65/67</td><td>Abcam</td><td></td><td>1:2000、マウス。</td></tr><tr><td>アンチPV</td><td>シグマ</td><td>P3088</td><td>1:200、ヤギ。</td></tr><tr><td>アンチチャット</td><td>メルク</td><td>AB143</td><td>1:5000、ウサギ。</td></tr><tr><td>抗NPY</td><td>イムノ</td><td>スター22940</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NIST200B</td><td>1:1000、チキン。</td></tr><tr><td>アンチGFP</td><td>アブカム</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>マウンティングソリューション</td><td>メルク</td><td>10981</td><td> ポリビニルアルコール マウンティングメディウム DABCO&reg;、退色防止 </td></tr><tr><td>OCT</td><td>寒天 サイエンティフィ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ック グリセロール</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>G9012-100ML</td><td></td></tr><tr><td>蒸留水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>不凍液</td><td>ティッシュプロテクノロジー</td><td>AFS05-1000N、1000 mL/個</td><td></td></tr><tr><td>免疫組織化学用<ストロング>装置</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒立蛍光顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>DMI6000 B</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>TCS SP8 レーザー走査型共焦点顕微鏡。</td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ミクロトーム</td><td>ライカ</td><td>SM2010R</td><td></td></tr></tbody></table>

ウイルスベクターの脳内注射によるインビボグリア細胞のインターニューロンへの直接リプログラミング

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

脳内の常駐グリアを生体内の機能的およびサブタイプ特異的ニューロンに変換することは、代替細胞置換療法の開発に向けた一歩を踏み出す一方で、その場で細胞の運命を研究するツールを作成します。これまで、生体内リプログラミングを介してニューロンを得ることは可能でしたが、これらのニューロンの正確な表現型や成熟した方法は詳細には分析されていません。このプロトコルでは、AAVベースのウイルスベクターシステムを用いて、生体内再プログラムされたニューロンのより効率的な変換および細胞特異的同定について説明する。また、再プログラムされた細胞の神経成熟の機能評価のためのプロトコルも提供する。フリップ切除(FLEX)ベクターを注入することにより、リプログラミングおよびシナプシン駆動レポーター遺伝子を、細胞リプログラミングの標的となる脳内の特定の細胞型に含む。この技術は、新たに再プログラムされたニューロンを容易に同定することを可能にする。結果は、得られた再プログラムされたニューロンが時間の経過とともに機能的に成熟し、シナプス接触を受け取り、異なるタイプのインターニューロンの電気生理学的特性を示す。転写因子Ascl1、Lmx1aおよびNurr1を使用して、再プログラムされた細胞の大半は、高速スパイク、パルブアルブミン含有インターニューロンの特性を有する。

AAVベクターの注入は、NG2-Creマウス線条体(図1A)のニューロンに常駐NG2グリア細胞を正常に再プログラムするために使用される。NG2グリアを具体的に標的とするために、リプログラミング/レポーター遺伝子を持つFLEXベクターは、アンチセンス方向に挿入され、2組のアンチパラレル、異種loxP部位(図1B)によって横たわっている。3つのリプログラミング遺伝子(Ascl1、Lmx1aおよびNurr1)のそれぞれは、個々のベクター上のユビキタスcbaプロモーターの制御下に置かれる。GFP発現がCre発現細胞に由来する再プログラムされたニューロンに制限されることを確実にするために、GFPはニューロン特異的シナプシンプロモーターの制御下に置かれる(また、FLEXベクター中)。
リプログラミングとレポーター構築物の組み合わせを使用することで、マウス線条体におけるGFP陽性ニューロンの生成が可能になります(図1C,C')。リプログラミング遺伝子の存在なしにレポーター構築物を使用しても、GFP陽性ニューロンは得られなかった(図1D)。
バイオシリンが充填された再プログラムされたニューロンは、死後の免疫染色後に見える(図2A)。変換が成功した場合は、広範な神経形態が存在する必要があります。再プログラムされたニューロンの電気生理学的記録は、自発的な活動測定を伴う後の機能的接続の存在を示す(図2B,C)。これは、イオノートロピックGABA作動またはグルタマチン性遮断薬(ピクロトキシンまたはCNQX)のいずれかでブロックすることができ、再プログラムされたニューロンへの興奮性および抑制性シナプス入力の両方を示唆する。時間後ウイルス注射(図2D)により自発的活性の発生が増加し、徐々に成熟を示す。
現在誘発された作用電位は機能性ニューロンに存在する。変換後の時間の経過に大きいほどアクションポテンシャルが増加します (図 2E)。これはさらに神経機能の成熟を示す。未熟なニューロンでは、電流はいずれも、または非常に少ない作用電位を誘発する(図2F)。
ニューロンの発射パターンは、細胞の形態およびチャネル発現15などの要因に依存するので、細胞型特異的である。インビボ再プログラムされたニューロンの記録されたパターンは、グループに区別することができ、例えば、高速スパイクインターニューロン(細胞タイプB、図3B)または他の細胞タイプ(図3A、C、D)の内因性ニューロンサブタイプと比較することができます。).観察された電気生理学的差異は、GFPとの特定のサブタイプマーカーおよび共発現の存在によって確認することができる(図3E-H)。全体として、このデータは、線条体に存在する再プログラムされたニューロンが、パルブアルブミン、ChAt-およびNPY-発現インターニューロン、ならびに線条体中スピニーニューロン同一体(DARPP32+)のような異なるタイプのインターニューロンの特性を有することを示している。図 3E-H)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig1.jpg"> 図1:常駐NG2グリアをニューロンにインビボリプログラミングする。(A) 線条体NG2グリアの生体内リプログラミングにおけるAAVウイルス媒介の概略表現。(B) インビボリプログラミングに用いられるAAV5 FLEX構造の概略表現は、標的細胞におけるCre発現によって遺伝子発現が調節される。(CおよびC')生体内で再プログラムされたニューロンでは、StriatumへのSyn-GFP +ALN注射に起因する。 (D) 再プログラミング因子がウイルスカクテルに添加され、レポーター構築物のみが生体内に注入される場合に再プログラムされたニューロンが存在しない場合。スケールバー = 100 mm (C)、25 mm (C')、25 mm (D)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig1large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig2.jpg"> 図2:生体内で再プログラムされたニューロンは機能的であり、時間の経過とともに成熟を示す。(A)バイオシリン充填再プログラムされたニューロンは、樹状脊椎を含む成熟した神経形態を示す。トレースは、ピクロトキシン、GABAA受容体アンタゴニストおよび(C)CNQX、AMPA受容体拮抗薬で遮断される興奮活性を有する(B)阻害性(GABAergic)活性を示す。(D) 経後の活動を伴うニューロンの数は、時間の経過とともに増加する。(E) パッチ付きニューロンは、注射後5週間(w.p.i.)で既に反復的な発火を示し、8および12 w.p.i.(F)現在誘発作用電位および未熟ニューロンの後のシナプス活性を示し続け、シナプスをほとんど示すBとD.スケールバー= 25mmと比較して、イベントと少数のアクションポテンシャル<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig2large.jpg" target="_blank">は、この図のより大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig3v2.jpg"> 図3:生体内で再プログラムされたニューロンは、線条体間ニューロンの免疫組織化学的および電気生理学的特性を示す。(A-D)生体内で再プログラムされたニューロンの発射パターンは、異なるタイプであることができます:(A) タイプAは内因性培地脊椎ニューロン(DARPP32+)に似ています。(B) 高速スパイク(PV+)インターニューロンに似ています。(C) 顕著なサグ(NPY+)を有する低閾値スパイクニューロンに似ています。(D) 大きな過極後に発射するニューロン(チャット+)。(E-H)GFPとニューロン間マーカーPV(E)、ChAT(F)、NPY(G)、および投影ニューロンマーカーDARPP32(H)の共局在を示す共焦点画像。すべてのスケールバー = 50 mm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig3v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、脳内のAAVベースのウイルスシステムとFLEXシナプシン駆動GFPレポーターを使用して、生体内で直接再プログラムされたインターニューロンを生成することを目的としており、生体内での細胞同定とさらなる分析を可能にします。

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

このプロトコルは、常駐グリアから脳内に直接新しいニューロンを生成することが可能であり、これらの再プログラムされた細胞がサブタイプ特異的ニューロンに成熟することを示しています。主な利点は、NG2-gliaと分析のために再プログラムされたニューロンにラベルを付けたGFPレポーターの特異的な標的化を可能にするcre依存型AAVウイルスである。脳内の新しいニューロンを生成することは、脳内の細胞置換療法の将来の開発につながる可能性があります。.私たちのプロトコルでは、精神疾患に影響を与えるパルブアルブミン陽性インターニューロンを生成します。インビボリプログラミングは、あなたがターゲットにしたい神経表現型や神経学的状態に応じて、他の脳領域や回路に適用することができます。この手順のデモンストレーションは、ジェニー・ヨハンソン:技術者、マリア・ペレイラ:元博士課程の学生、そして私たちの研究室の博士課程の学生であるマルセラ・ビルテレです。AAV5ウイルスベクターを産生するために、5つのT175フラスコに標準培養培地を用いたHEK293T細胞をシードする。細胞が50〜70%の合流に達したら、次の混合物をトランスベクション用に調製する。50ミリリットルの遠心分離管に、等モル量のベクタープラスミドとpDGシリーズヘルパープラスミドを加える。144マイクロリットルの最終体積にTris-EDTAバッファーを加え、超純水を加えて1296マイクロリットルの総容量を得て混合します。次に、144マイクロリットルの2.5モル塩化カルシウムを加え、混合します。その後、DNA溶液と渦に1.92ミリリットルのHBSをすぐに加えます。室温で正確に60秒間インキュベートします。続いて、溶液を28ミリリットルの新鮮な細胞培養培地に移し、混合する。フラスコ内の培地を、トランスベクションミックスを含む培地に交換します。3日間待ってから、メディアを無駄に移します。各フラスコに収穫バッファーを5ミリリットル加え、各フラスコにさらに4ミリリットルのDPBSを加えて残りの細胞をすすいで、細胞溶液とプールします。収穫した細胞を摂氏4度で5分間5分間1,000xgで遠心分離する。遠心分離後、上清を取り除き、15ミリリットルの溶解バッファーにペレットを溶解します。50ミリリットルの遠心分離管をドライアイスに15分間凍らせ、マイナス20度の冷凍庫に保管します。使用前に、収穫した細胞のライセートを摂氏37度の水浴で解凍する。この手順では、iodiキサノール勾配超遠心分離によるAAV精製を行い、室温で1時間45分間、350、000 x gで遠心分離を有する超遠心分離天井管を使用する。AAV含有相を抽出するには、ベベルを上向きにして40〜60%の相境界の約2ミリメートル下に18ゲージ針を持つ10ミリリットルの注射器を挿入し、引き出します。ウイルスベクターの5〜6ミリリットルが抽出された後、タンパク質バンドに到達する前に停止することを確認してください。次に、希釈したイオデキサノール勾配をアニオン交換フィルタを通して、1秒あたり1滴以下の速度で押し通すことによって精製し濃縮する。その後、IEバッファの3ミリリットルをゆっくりとフィルターを通して洗浄します。次に、溶出バッファーの 1 ~ 2 ミリリットルの遠心フィルター ユニットに混合物を溶出させます。4ミリリットルの最終容積にDPBSをデバイスに加えます。DPBSの0.5ミリリットル未満になるまで室温で2,000 x gで遠心分離機がフィルターに残される。その後、チューブの底から液体を取り除き、4ミリリットルのDPBSを補充し、再び遠心分離機を使用します。このステップをさらに2回繰り返し、最後の遠心分離後にフィルター上の濃縮ベクターの体積が約200マイクロリットルであることを確認してください。ピペットを使用して200マイクロリットルの濃縮ベクターを取り出し、0.22マイクロメートルのフィルターを通して殺菌します。次に、アリコート200マイクロリットルをインターロックインサート付きのガラスバイアルに入れる。リプログラミング因子を注入するには、ステレオタキシックフレームに麻酔マウスを配置します。手術の開始時に適切な鎮痛を投与し、注射針のガラス毛細血管の先端をブレグマのすぐ上に持って来てください。毛管先端がA-PおよびM-Lの両方の平面で完全にまっすぐであることを確認しなさい。デジタル座標カウンタで、M-L 値と A-P 値を両方とも 0.0 にリセットします。動物の頭部が完全に平らな位置にあることを確認するには、デジタル座標カウンタを使用して、A-Pアームがプラス2.0とマイナス2.0の場合、およびM-Lアームがプラス2.0とマイナス2.0の場合にD-V座標値を測定します。歯棒と耳棒の高さを適宜調整します。その後、注射器を少し上げ、注入の座標で歯科ドリルを使用して穴を開けます。現場で掘削を開始し、円形で優しく作業します。次に、開いた切開部の上に綿のガーゼを置き、生理食い液で注射器を洗い流します。フラッシュした後、気泡を作り出し、次いでウイルスベクターを含む溶液を1マイクロリットル引き出す。ウイルス溶液が気泡の下で容易に視覚化できることを確認してください。次に、シリンジを下げ、所望の深さまでゆっくりと進行し、そして軌道が骨片からはっきりしていることを確認する。続いて、1分間に0.4マイクロリットルの速度でウイルス溶液の1マイクロリットルを注入する。注射が終わったら、注射器の離脱前に拡散のために2分間待ちます。拡散後、毛細血管の先端が脳から完全に引き抜かれるまでゆっくりと注射器を引き込み、切開を慎重に縫合し、動物を立体フレームから取り除く。意識が回復するまで術後ステーションで動物を監視します。動物は、ウイルス注射後最大12週間保持され、常駐グリアが成熟したニューロンに再プログラムできるようにします。ビブラートメを使用して電気生理学のための脳スライスを準備するには、最も多くのrostral部分から高速で線条体レベルまで脳を切り離します。その後、275マイクロメートルで275マイクロメートルで1秒当たり0.1ミリメートルで線条体を断面化します。各セクションの後、慎重に非注入線条体側を除去し、室温で水浴中の底ネットと酸素化CREBセンススライドとバイアルに注入された側を移します。すべてのセクションが切断されるまで、バイアルを室温に保ちます。その後、ゆっくりと水浴の温度を摂氏37度に上げ、30分間放置し、ヒーターをオフにして室温まで冷まします。1つの組織セクションを電気生理学のために記録チャンバーに移した後、ガラスピペットを記録電極に取り付け、溶液に下げます。電極の抵抗を再確認します。次に、ピペットで再プログラムされたセルにゆっくりと近づき、先端を差し込まないように電極にわずかな正圧を保ち、パッチを当てる前にセルがGFP陽性であることを確認します。セルにパッチが適用されたら、現在のクランプでマイナス60からマイナス70ミリボルトまでセルを維持し、マイナス20からプラス90ピコアンペアの500ミリ秒の電流を注入して、アクション電位を誘発します。これは、神経細胞の成熟と成功したリプログラミングを示しています。その後、電圧クランプに切り替え、10ミリボルトの脱分極工程で内向きナトリウムおよび遅延整流カリウム電流を測定します。ここでは、成熟した神経形態と樹状脊椎を示すポスト記録されたバイオシチン充填再プログラムニューロンです。ここで、再プログラムされたニューロンの電気生理学的記録は、自発的な活動手段を用いた心筋機能接続の存在を示す。トレースは、ピクロトキシン、GABAA受容体拮抗薬およびCNQX、AMPA受容体拮抗薬でブロックされている興奮性活性でブロックされている阻害活性を示しています。パッチを当てたニューロンは、注射後5週間で既に昼寝後の活動を示し、注射後8週間と12週で続く。現在の誘発作用電位を有するニューロンの数も時間の経過とともに増加する。より詳細な分析は、細胞の大部分がパルブアルブミンインターニューロンに似た速いスパイク活性を示すいくつかの明確な発火パターンを明らかにした。12週での免疫物質化学的分析は、さらにレポーターGFPとパルブアルブミンの共発現を示した。この手順に従って、パッチシーク技術で遺伝子発現を調べたり、単シナプストレーシングおよびiDISCOによる3次元シナプス接続性を評価することができます。レジデントグリアをインターニューロンを発現するパーブアルブミンに再プログラムすることが可能になったので、これらは本物であり、治療ツールとして使用できるかどうかを調査し始めました。動物を扱うときとAAVウイルスを使用する際には、確立されたプロトコルとガイドラインに従うことを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

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