Name: 発砲残渣の推定検出のための新しい細菌性バイオセンサの調製と適用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: 学ぼう、合成生物学技術を用いた細菌性バイオセンサの調製法と蛍光分光法による発砲残渣検出の手法。この低コストな法医学的手法は、標準的な合成生物学パーツを使用した様々な化学物質検出システムの開発に応用可能です。

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著者は BIOL 324 (遺伝学) と、アンチモンおよび鉛バイオセンサーの初期準備と試験に関与していた化学 403 (高度化学実験問題解決) の学生である、ロングウッド大学の学生を認めたいと思います。MicRoboCop のためのアイデアは、NSF とハワード・ヒューズ医学研究所によって資金を提供し、メリーランド大学ボルチモア郡によってホストされている GCAT SynBIO ワークショップ (夏の 2014) で構想されました。また、ロングウッド大学のクック・コール・カレッジ・オブ・アーツ・アンド・サイエンスと GCAT SynBio 同窓会の助成金も受領しています。

注: RFP を発現している大腸菌の合成が提示されている。
1.大腸菌からのプラスミド DNA の調製
<ol><li>RFP 遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子を持つプラスミドを含む大腸菌を解凍し、 100 μ g/mL アンピシリンを含有する Luria ブロス (LB) 寒天プレートを24時間37° c で増殖させます。例えば、合成生物学に使用される標準的な生物学的部分のレジストリからの J10060 プラスミドを使用してください (材料の表を参照してください)。J10060 プラスミドには、pBad プロモーター領域およびアンピシリン耐性遺伝子の制御下での RFP (赤色蛍光タンパク質) の遺伝子が含まれています。あるいは、LB 寒天プレート上で増殖する前にプラスミドを使用して大腸菌(ステップ3.2 を参照) を変換します。</li>
	<li>標準のミニ調製プロトコル (「材料表」を参照) に従って、J10060 プラスミドを含む大腸菌培養液の 1 mL から DNA を分離します。以下のプロトコルの目的は、pBad プロモーターを除去し、デバイスに対して所望のプロモーターと置き換えることである。</li>
	<li>プラスミドミニ調製に続いて、消化の準備が整うまで冷凍庫に DNA を保存します。</li>
</ol>2. 制限酵素消化
<ol><li>EcoRI と NheI のためのマイクロ遠心チューブに以下の反応を設定する:10 μ l の J10060 プラスミド DNA (ステップ1で単離された)、8μ l の水、および1μ l の EcoRI および NheI 酵素を1μ l の緩衝液とともに予め混合する (材料の表を参照)。</li>
	<li>プロモーター DNA については、EcoRI および NheI 消化のためのマイクロ遠心チューブに以下の反応を設定する:10 μ l のアニールプロモーターの DNA 配列 (8 μ l の水、および1μ l の EcoRI および NheI 酵素を1μ l の緩衝液とともに前もって混合する。<ol>
<li>Sb、Pb、または TNT-RFP (材料表を参照) については、オリゴヌクレオチドをバッファーに溶かし (30 mm HEPES、pH 7.5; 100 mM 酢酸カリウム)、等しいモル濃度でインキュベートし、94° c に2分間加熱し、室温で徐々に冷却します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ピペットを10μ l に設定して、サンプルをゆっくりと上下にピペットで混ぜます。</li>
	<li>37° c で30分間インキュベートします。</li>
	<li>熱は80° c で5分間酵素を失活させる。</li>
	<li>消化された DNA を冷凍庫に保存し、次のステップに進む準備をします。</li>
</ol>3. ライゲーションと形質転換
<ol><li>
結紮
	<ol>
<li>ステップ2で EcoRI および NheI で二重に消化されたプラスミドおよびプロモーター DNA を用いて、マイクロ遠心チューブの氷の上に表 1に示す反応混合物をセットアップする。最後に T4 DNA リガーゼを追加します。 注:表 1は、示された DNA サイズに対して挿入する1:3 ベクターのモル比を用いたライゲーションを示す。</li>
		<li>反応は、上下にピペットでマイクロ遠心て軽く混ぜます。</li>
		<li>室温で10分間インキュベートします。</li>
		<li>熱は65° c で10分間不活性化します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
変換
	<ol>
<li>最後の氷の結晶が消えるまで、DH5 の有能な大腸菌細胞を20μ l のチューブを氷上で解凍します。</li>
		<li>5μ l のプラスミド DNA を細胞混合物に添加する。慎重に細胞と DNA を混合するために、チューブ4-5 回をフリックします。</li>
		<li>2分間氷の上に混合物を置きます。</li>
		<li>正確に 30 s のための正確に42° c の熱衝撃。混ぜないでください。</li>
		<li>氷の上に2分を置きます。混ぜないでください。</li>
		<li>ピペット380μ l の室温 SOC を混合液に注入します。アンピシリン (100 μ g/mL) を含む LB 寒天プレートの上に直ちに広げ、37° c で一晩インキュベートします。</li>
		<li>成長のために24時間以内にプレートをチェックしてください。</li>
		<li>シールフィルムでプレートを密封し、次のステップの準備が整うまで冷蔵庫に保管してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. コロニー PCR
<ol><li>表 2に示す反応混合物を PCR チューブ (4 つの反応管をセットアップ) に加える。</li>
	<li>上下にピペットで反応を軽く混ぜる。</li>
	<li>黄色のピペットチップを使用して、変換された大腸菌のコロニー (または非常に小さな領域) をこすります。この大腸菌のスワイプを 、断面化されている新しい LB/アンピシリン/寒天プレートに移し、次にピペットチップを PCR チューブに挿入します。ピペットチップを振り、大腸菌と PCR ミックスを混合します。追加のコロニーのためにさらに3回を繰り返す。Pcr チューブを PCR マシンに移し、表 3に示すプログラムを使用して thermocycling を開始します。</li>
	<li>2% のアガロースゲルを用いてゲル電気泳動を実行し、プラスミドに最適なライゲーションを有するコロニーを特定し、新しいプレート上でコロニーを増殖させます。</li>
	<li>テストの準備ができるまで冷蔵庫にプレートを保管してください。化学試験用に100μ g/mL のアンピシリンを添加し、Luria ブロスに液体培養を調製します。</li>
</ol>5. DNA シーケンシング
<ol><li>各サンプルについて、5μ l のプラスミド、4μ l のシーケンシング・プライマー、および3μ l の脱イオン水を加えます。</li>
	<li>この混合物をチューブに入れ、DNA シーケンシングのために送ります (資料の表を参照)。</li>
	<li>Dna 配列データを解析して、DNA 配列解析ソフトウェアを使用して、予測された dna 配列と観察結果を比較し、変異がなく、遺伝子が正しく挿入されることを確認します。 注: 化学センサーとして大腸菌を使用すると、以下に提示されます。</li>
</ol>6.大腸菌培養物の調製
<ol><li>液体培養用に100μ g/mL アンピシリンを使用して LB を調製します。</li>
	<li>センサー細菌、ポジティブコントロール * 細菌、ネガティブコントロール * * 細菌の液体培養物を準備します。 注: * 陽性対照細菌: 構成的プロモーターの制御下にある RFP 遺伝子を含むプラスミドを含有する大腸菌;合成生物学に使用される標準的な生物学的部分のレジストリからのプラスミド E1010 (材料の表を参照) は、この作業に使用された。 * * 陰性対照細菌: pBad プロモーター (合成生物学に使用される標準的な生物学的部分のレジストリからのプラスミド J10060 のような、異なるプロモーターの制御下にある RFP 遺伝子を含むプラスミドを含有する大腸菌(の表を参照))または RFP 遺伝子を持たないプラスミドである。</li>
	<li>培養液を37° c で振とう器に入れ、最低8時間、最大18時間の 220 rpm にします。白濁したブロスは細菌の増殖を示す。</li>
</ol>7. デバイスの機能をチェックする Titrating大腸菌
注: センサーがチェック機能に滴定されたら、このステップを繰り返す必要はありません。鉛、アンチモン、および 2, 4-DNT または 1, 3-dinitrobenzene (1, 3-DNB) の添加の形のポジティブコントロールは、完全な滴定を必要とせずに、各使用のためのデバイスの機能をチェックすることができます。
<ol><li>水に10ppm の濃度で関心のある検体の原液を準備します。溶解性が問題である場合は、50/50 の水/メタノール混合物を使用してください。</li>
	<li>表 4をガイドとして、適切な数の滅菌培養チューブにラベルを付け、培養したブロス 2 mL (プロトコルステップ6から) を各チューブに入れます。 注: 一般的な分析範囲を決定するために、センサーバクテリアを持つ検体の少なくとも3つの異なるレベル、ネガティブコントロールのあるレベル、ポジティブコントロールを持つ1つのレベルを行います。また、追加された金属 (ネガティブコントロールの別のタイプ) を持っていない細菌のそれぞれの1つのチューブがあるはずです。分析範囲と検出限界をより正確に決定するには、より広い範囲の分析物濃度を使用します。</li>
	<li>2 mL のブロスを含むチューブに分析物ストック溶液を加え、表 4に記載されているように、それらが緩んでいるように培養チューブの上にスナップキャップを置き (チューブに空気が流れるように)、培養チューブを渦させる。</li>
	<li>培養チューブの上に、スナップキャップを緩く残し、220 rpm および37° c で振とう器に少なくとも24時間置きます。</li>
	<li>インキュベーターからチューブを取り出し、キャップをチューブ上にしっかりとはめ込み、蛍光解析の準備が整うまで、チューブを冷蔵庫に保管してください。</li>
</ol>8. GSR 用化学センサーとして大腸菌を使用
<ol><li>鉛を除去するために設計されたエタノールベースのワイプ (材料の表を参照) を使用して、手のすべての表面 (指の間を含む) を拭きます。それぞれの手に個別のワイプを使用します。ワイプは、分析まで適切にラベルが付いた密封 baggie に保管してください。</li>
	<li>試験対象の表面の場合: 大きな表面や小さな表面にエタノールで湿らせた綿棒には、アルコールベースのワイプを使用します。 注: GSR に対するセンサーの応答を示すために、使用された40口径のカートリッジケーシングは、エタノール湿らせた綿棒で拭いました。</li>
	<li>清潔な手袋を着用し、アルコールで洗浄されたはさみを使用して、ワイプの中心から約 1cm2のセクションを切ります。</li>
	<li>ハンドワイプまたは綿棒の切断部分を、センサー細菌 2 mL が含まれている培養チューブに直接置き、ブロス内に水没していることを確認します。</li>
	<li>ステップ7.4 –7.5 で上記のように進んでください。</li>
</ol>9. ポータブル分光器を用いた蛍光分析 (材料表参照)
<ol><li>チューブを振るために渦ミキサーを使用してください。</li>
	<li>500 nm の励起波長を持つ RFP バリアントに適した波長の蛍光発光を収集するために、分光器を準備します。</li>
	<li>ブランクスペクトルを記録するには、Luria ブロスを使用します。</li>
	<li>各上澄み液を少量のキュベットに注意深く移し、発光強度を収集します。</li>
</ol>10. 96 プレートリーダーを使用した蛍光分析 (材料表参照)
<ol><li>チューブを振るために渦ミキサーを使用してください。</li>
	<li>ウェルプレート内のウェルにブロスの 200 mL を転送します。どのサンプルがプレートの各ウェルに入ったかを記録します。</li>
	<li>Fluorimeter を設定して、RFP バリアントの適切な波長の発光強度を収集します。</li>
</ol>11. データ分析
<ol><li>すべてのネガティブコントロール (検体が添加されていない RFP 陰性バクテリアまたはセンサーバクテリア) から得られたシグナルを使用して、バックグラウンドの平均蛍光シグナルを計算します。</li>
	<li>センサー細菌について得られた各蛍光シグナルからの平均バックグラウンドシグナルを減算して、バックグラウンド補正した蛍光強度を得る。</li>
	<li>背景の補正された蛍光強度を平均バックグラウンド信号で割って、信号対雑音 (S/N) 比を推定します。S/N 比が3より大きい場合、検定は正の値になります。</li>
</ol>

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</ol>

著者は、開示するために競合する金銭的利害やその他の利害の対立を持っていません。

修正とトラブルシューティング
表 4に記載した実験は、設計されたセンサに適切な任意の方法で修正することができる。化学センサーの最も重要な側面は、その感度と特異性を評価することです。センサの有用な分析範囲を決定するために、検体の濃度の広い範囲が分析されることを確実にすることが有益である。また、細胞のための検体の最大レベルを決定する価値があります。本研究で使用されている検体は、メタノール溶液中の有毒金属 (Pb および Sb) または有機化合物 (TNT 誘導体の場合) であるため、検体または溶液の毒性による細胞死が発生する上位レベル (一般に500より高い-1, 0これまでに実施された実験のために 00 ppb)。
技術の限界
この研究で得られた結果は質的なものですが、RFP 修正大腸菌の定量的能力を示すことを目的としています。センサの感度は、ブロス内の細...

バイオセンサは、化学物質または検体の検出に使用できる応答を生成する生物学的成分 (例えば、タンパク質、核酸、または生物全体) を使用する任意の分析装置です。例として、石炭鉱業は、有毒な鉱山ガスの存在を検出するために20世紀の多くのためにバイオセンサを使用しました: 炭鉱1のカナリア。生物の生物 (カナリア) は、化学物質 (一酸化炭素) への応答 (死または苦痛) を労働者を保護するために鉱夫によって観察されました。より現代的で洗練された例では、細菌は、蛍光タンパク質の発現のような特定の反応を示すことによって特定の化学分析物の存在に応答する合成生物学技術を使用して改変することができる。
合成生物学は、自然に存在しない生物学的デバイスやシステムの構築、または特定の目的のための既存の生物学的システムの再設計を指す広義の用語である2.合成生物学は、標準的な方法論と、デバイスやシステムの合成に使用できる標準化された部品(標準合成生物学の遺伝的要素) の存在によって、遺伝子工学とは区別される。ある部位は、細菌のような生物である装置のゲノムに導入され、機能の指標として役立つ特定の形質を発現する。例えば、多くの合成デバイスにおいて、蛍光タンパク質の発現は、レポータータンパク質として単細胞生物に導入される。複数のデバイスをシステムに結合することができます。細菌などの微生物のゲノムは、このように操作が容易です。様々な化学物質に特有のバイオセンサーの多くの例は、過去10年間の文献で報告されています3,4.
この研究では、MicRoboCop システムは、法医学および環境化学における新規アプリケーションと合成生物学技術を使用して設計されたバイオセンサの例として提示されています。MicRoboCop は3つの装置のシステムで、これを組み合わせることにより、ヒトの手や表面から採取された銃創 (GSR) によって、大腸菌が赤色蛍光タンパク質 (RFP) を発現することを可能にします。3つの装置の各々は、GSR5の構成要素であることが知られている特定の化学分析物に応答する。システムが応答する3つの分析対象は、I. 2, 4, 6-トリニトロトルエン (TNT) および関連化合物 II.鉛 (鉛イオンの形で)、および III.アンチモン (イオンの形態でも)。
GSR には多くの異なる化学物質が含まれていますが、主に GSR としての残渣を特定するために使用される3つは、バリウム、鉛、およびアンチモン5です。GSR の同定のための標準証拠試験は、エネルギー分散型 X 線蛍光 (EDX)5で走査電子顕微鏡 (SEM) を使用することである。SEM-BPS では、分析者が GSR の固有の形態および元素成分を特定することができます。現在、利用可能ないくつかの広く使用されているバイナリ推定試験があります。最近公表された推定試験の1つはイオンモビリティ分光法 (IMS) を使用しており、これは多くのラボ6では利用できないかもしれない特殊な装置です。また、使用できる色の「スポット」テストもいくつかありますが、通常は距離の決定や、弾丸穴や創傷5の GSR の識別に使用されます。さらに、ボルタンメトリー分析を使用する GSR のための電気化学試験に関する文献の一部には限定的な注意が払われており、これは潜在的に移植可能なフィールド、または陽極ストリッピングボルタンメトリーの利点があり、これは非常に金属元素の敏感な方法7.GSR を検出する目的のために特別に設計されたバイオセンサーの文献にはほとんど言及されていませんが、他の法医学アプリケーション用の一部のバイオセンサーは8を公開しています。
MicRoboCop システムにおける各デバイスの生物学的要素と、プラスミドの構造について、図 1に示します。図 1bにおいて湾曲した矢印は、検体の存在下で活性化されるプロモーター領域を表し、その楕円形は、レポータータンパク質の翻訳を可能にするリボソーム結合部位であり、RFP とラベル付けされた灰色のボックスは赤色を発現する遺伝子である蛍光タンパク質、および赤色八角形は転写終結部位である。3つのデバイスはすべて、GSR を検出するシステムとして一緒に使用されます。特定のプロモーター (SbRFP、PbRFP、TNT-RFP) を持つ各デバイスは、試験中のサンプルと共にインキュベートされ、RFP の蛍光が測定されます。RFP は、適切な化学物質が存在し、プロモーター領域を活性化する場合にのみ表現されます。GSR に存在する化学物質のいくつかに応答する3つのデバイスが設計されており、この作業で紹介しています。
3つの MicRoboCop デバイスで使用されるプロモーターは、ヒ素およびアンチモン感受性プロモーター、 SbRFP9、10、鉛感受性プロモーター、 PbRFP11、12および TNT 高感度プロモーター、TNT-RFP文献の検索は、バリウムに応答するように設計されたプロモーターを明らかにしなかったので、このプロモーターは、多くの構造的に関連する化合物 (特に、2, 4-dinitrotoluene およびdinitrobenzene) は、GSR に取り残された有機化合物の一部であることが知られている。このプロモーターは、埋設された地雷13における微小な量の TNT および 2, 4-dinitrotoluene (2, 4 DNT) を特異的に検出するために首尾よく用いられる。3つの装置をシステムとして一緒に使用すると、GSR のポジティブ・テストにより、3つのデバイスすべてに蛍光が生成されます。1つまたは2つの装置のみでの蛍光シグナルは、検体の別の環境源 (複数可)、または TNT プロモーターの場合、GSR において有機化合物が残されていない化合物による活性化を示す。すべての3つのデバイスを一緒に使用することにより、環境情報源による偽陽性の結果の可能性が最小限に抑えられます。人気が高まっている無鉛弾薬は、米国での弾薬販売量の約 5% しか占めていない。したがって、鉛が存在しないことによる偽陰性の結果は可能性があるが、GSR14のマーカーとしてリードを使用するセンサーには依然として有用性があります。この特定のフォレンジックアプリケーションに加えて、各デバイスは、環境汚染物質を検出する目的のために別々に使用することができます。
提示されたプロトコールには、デバイス (センサ細菌) を作成するために用いられる合成生物学技術と、デバイスの機能をチェックし得た蛍光シグナルを分析する分析技術が含まれる。プロトコルはまた、表面から GSR を収集するために、容疑者やスワブの手から GSR を収集するための手の拭き取りの形で法医学証拠の収集が含まれています。リードセンサー装置からの結果は、サンプル結果として、使用済みカートリッジケーシングを用いた GSR に対するポジティブテストのデモンストレーションとともに提示されます。

<table><tbody><tr><td>1,3-ジニトロベンゼン、97%</td><td>アルドリッチ</td><td>D194255-25G</td><td></td></tr><tr><td>2,4-ジニトロトルエン、97%</td><td>アルドリッチ</td><td>101397-5G</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1760-5</td><td></td></tr><tr><td>アンチモン、参照標準液 (1000ppm &plusmn;1%/Certified)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA450-100</td><td>Standard in dilute HNO3</td></tr><tr><td>Cut Smart Buffer</td><td>New England BioLabs</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>Duplex Buffer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>11-01-03-00</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF Restriction Enzyme</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, HPLC grade, denatured</td><td>Acros Organics AC611050040</td><td></td><td>溶媒はHPLCグレードである必要はなく、ACSまたは試薬グレードが機能します。</td></tr><tr><td>ユーロフィン ゲノミクス SimpleSeq DNA シーケンシング キット</td><td>ユーロフィン ゲノミクス</td><td>SimpleSeq キット</td> コロニー PCR 用標準<td></td></tr><tr><td>フォワード プライマー</td><td>統合 DNA テクノロジー</td><td></td><td>ズ 5'- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3'</td></tr><tr><td>DNAシーケンシング用フォワードプライマー</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5'- GTAAAACGACGGCCAGTG-3'</td></tr><tr><td>IBI Science 高速プラスミド ミニキット</td><td>IBI Scientific</td><td>IB47101</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth、Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Lead、標準液 (1000ppm &plusmn;1%/認定)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>SL21-100</td><td>希釈HNO3</td></tr><tr><td>リードオフ使い捨てクリーニングおよびデコンワイプ</td>の標準 <td>Hygenall</td><td>45NRCN</td><td>キャニスターで販売されているか、個別に包装されているため、アルコールベースのワイプは機能します。</td></tr><tr><td>メタノール、HPLCグレード</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A452-4</td><td>溶剤はHPLCグレードである必要はなく、ACSまたは試薬グレードが機能します。</td></tr><tr><td>NEB 5-α コンピテント E. coli細胞</td><td>New England BioLabs</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>NheI-HF 制限酵素</td><td>New England BioLabs</td><td>R3131S</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td>New England BioLabs</td><td>B1500S</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer</td><td>New England BioLabs</td><td>M0482S</td><td></td></tr><tr><td>合成生物学に使用される標準生物学的部分の登録簿からのプラスミド</td> 標準<td>生物学的部分</td><td></td>の登録 <td></td></tr><tr><td>http://parts.igem.org/Main_Page プロモーター配列</td><td>統合DNA技術</td><td></td><td>Sbプロモーター:5'-GCATGAATTCA 
GTCATATATGTTTTTGACTTATCC 
GCTTCGAAGAGAGAGACACTT 
GCAACAATCGCTAGCGCAT-3' 
3'-CGTACTTAAGCTCACTATA 
TACAAAAACTGAATAGGCGAAGC 
TTCTCTCTCTGTGATGGACGTTG 
TTAGCGATCGCGTA-5'
 
Pbプロモーター:5'-GCATGAATTCG 
TCTTGACTCTATAGTAACTAAGGG 
 TGTATAATCGGCAACGCG 
AGCTAGCGCAT-3' 
3'-CGTACTTAAGCAGAA 
CTGAGATATCATTGATCTCCACA 
TCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGC 
GTA-5'
 
TNTプロモーター:5フィートGCATTCTAGAT 
CAATTTATTTGAACAAGGCGGTCA 
ATTCTCTTCGATTTTATCTCTCGT 
AAAAAAACGTGATACTCATCACAT 
CGACGAAACAACGTCACTTATACA 
AAAATCACCTGCGAGAGATTAATT 
GAATTCGCAT3' 
3フィートCGTAAGATCTAGTTAA 
ATAAACTTGTTCCGCCAGTTAAGA 
GAAGCTAAAATAGAGAGCATTTTT 
TTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGC 
TTTGTTGCAGTGAATATGTTTTTA 
GTGGACGCTCTCTAATTAACTTAA 
GCGTA5'</td></tr><tr><td>コロニーPCR用リバースプライマー</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5'- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3'</td></tr><tr><td>DNAシーケンシング用リバースプライマー</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5'- GGAAACAGCTATGACCATG-3'</td></tr><tr><td>T4 DNAリガーゼ</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr></tbody></table>

発砲残渣の推定検出のための新しい細菌性バイオセンサの調製と適用

Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue

MicRoboCop は法医学化学の独特な適用のために設計されていたバイオセンサーである。MicRoboCop は3つの装置で構成されるシステムで、一緒に使用すると、3つの主要な検体 (アンチモン、鉛、および GSR の有機成分) の存在下で蛍光シグナルを生成することによって、発射残渣 (GSR) の存在を示すことができます。本プロトコルは、大腸菌 (e.coli) を用いたバイオセンサーの合成と、センサの選択性と感度を評価するために用いられる分析化学法について述べる。システムの機能は、使用済みカートリッジケーシングの内部から GSR を収集することによって実証されます。一度準備すれば、バイオセンサーは必要になるまで貯えることができ、これらの主要な分析物のためのテストとして使用することができる。3つの検体すべてからの肯定的な反応は、GSR に対する推定陽性試験を提供し、個々のデバイスは、他のサンプル中の検体を検出するためのアプリケーション (例えば、飲料水中の鉛汚染の検出器) を有する。システムの主な制限は、正の信号に必要な時間です。今後の研究は、応答時間を最適化するために異なる生物を研究することを含むかもしれない。

この作業で使用した RFP バリアントの蛍光スペクトルを図 2に示します。これらのデータは、リードと TNT-RFP デバイスに応答する PbRFP デバイスからのもので、2つの分析対象、2、4の DNT および 1, 3-DNB に応答します。この図は、ネガティブコントロールのスペクトル (検体が追加されていない) を示し、2つの異なるレベルの検体が添加されたスペクトルを示す。使用した RFP バリアントの最大蛍光シグナルは 575 nm (励起波長 500 nm) で観察されました。図 3のデータは、PbRFP デバイスの1つの滴定実験 (したがってエラーバーは含まれていません) の代表であり、プロトコルのステップ7のように滴定されます。図 3aは、ポータブル分光計から収集されたデータを示し、図 3bは fluorimeter から収集したデータを (同じソリューションのセットから) 示しています。金属の濃度が増加するにつれて、蛍光が...

合成生物学技術を用いて、銃創の分析のために一連の細菌用バイオセンサーを合成し、蛍光分光法を用いてその使用目的に対してデバイスの機能をテストするプロトコルを提示します。

MicRoboCop is a biosensor that has been designed for a unique application in forensic chemistry. MicRoboCop is a system made up of three devices that, ...

このプロトコルは、銃声残渣の化学成分を検出するように設計されたユニークなバイオセンサーの調製および分析を記述する。法医学アプリケーションのためのバイオセンサーの使用はユニークです。これは、法医学研究所で一般的に使用される高度に特殊化された機器に代わる、低コストでシンプルに使用できます。記載の合成生物学法は、標準的な合成生物学の部品を使用する任意のシステムに使用することができます。記載の化学分析は、赤色蛍光タンパク質を発現するあらゆるバイオセンサに適用可能である。この手順のデモンストレーションは、ロングウッド大学の学部生であるアンドレア・ソールズとエル・リチャードソンです。この手順を開始するには、マイクロ遠心チューブに、以前に単離されたJ10060プラスミドDNAの10マイクロリットルを加えます。8マイクロリットルの水を加え、EcoRI酵素とNHEL酵素のそれぞれに1マイクロリットルを1マイクロリットルのバッファーと事前に混合します。プロモーターDNAの場合、新鮮なマイクロ遠心分離チューブに10マイクロリットルのアニールプロモーターDNA配列を加えます。8マイクロリットルの水を加え、EcoRI酵素とNHEL酵素のそれぞれに1マイクロリットルを1マイクロリットルのバッファーと事前に混合します。10マイクロリットルに設定されたピペットを使用して、サンプルを上下にそっとピペットして混ぜます。37°Cで30分間インキュベートします。その後、酵素を80°Cで5分間加熱して活性させます。消化したDNAを冷凍庫に保管して、処理を進める準備が整います。まず、以前に消化されたプラスミドおよびプロモーターDNAを使用して、テキストプロトコルの表1に概説されているように、氷上のミクロセトリフュージチューブに反応を設定する。最後にT4 DNAリガーゼを追加することを確認してください。ピペットを上下に軽く混ぜ合わせ、遠心分離機を短く混ぜます。室温で10分間インキュベートします。その後、熱し、10分間摂氏65度で活性化します。テキスト プロトコルで説明されているように変換を実行します。まず、テキストプロトコルの表2に示すように、PCRの反応混合物を設定します。ピペットを上下に軽くして反応を混ぜます。黄色のピペットチップを使用して、変換された大腸菌のコロニーを削ります。この大腸菌のスワイプを、切り離された新しいLBアンピシリン寒天プレートに移し、ピペットチップをPCRチューブに挿入します。ピペットチップを振って、大腸菌とPCRミックスを混ぜます。追加のコロニーに対して、このプロセスをさらに3回繰り返します。次に、PCR チューブを PCR マシンにロードし、テキスト プロトコルの表 3 に示すようにサーモサイクリングを開始します。テキストプロトコルの表4に概説されているように、適切な数の無菌培養チューブにラベルを付け始める。各チューブに調製した培養液の2ミリリットルを加えます。表 4 に示すように、チューブにアニライト ストック ソリューションを追加します。次に、スナップキャップを培養管に置き、チューブに空気が流れるように緩みます。各培養管の渦。この後、チューブを摂氏37度、220 RPM以上で24時間揺れるインキュベーターに入れます。まず、指の間を含む手のすべての表面を拭くためにリードを取り除くために設計されたエタノールベースのワイプを使用してください。分析まで適切にラベル付けされた密封可能なバギーにワイプを保管してください。アルコールベースのワイプを使用して、テストする大きな表面を拭き取ります。エタノールで湿らせた綿のスワップを使用して、テストする小さな表面を拭き取ります。清潔な手袋を着用し、アルコール洗浄したはさみを使用して、ワイプの中心から約1平方センチメートルの部分を切ります。次に、切り取った部分のワイプ、または綿棒を、2ミリリットルのセンサー細菌を含む培養管に直接入れ、完全に水没していることを確認します。500ナノメートルの励起波長で、RFPバリアントの適切な波長で蛍光の提出を収集するために分光計を準備します。次に、ボルテックスミキサーを使用してチューブを振ります。各上清を少量キュベットに慎重に移し、発光強度を収集します。ボルテックスミキサーを使用して、チューブを振ります。200マイクロリットルのブロスをウェルプレートのウェルに移します。このプレートの各ウェルに入ったサンプルを記録します。RFPバリアントに適した波長で発光強度を収集するために、小麦粉計を設定します。代表的なRFP変異体の蛍光スペクトルは、2つの異なるレベルのアニライトを加えた陰性対照とスペクトルの両方を示す。この研究で使用されるRFP変異体の最大蛍光シグナルは、575ナノメートルで観測される。代表的なデータは、ポータブル分光計と蛍光計の両方から、同じソリューションのセットのために収集されます。アニライトの濃度が高くなるにつれて蛍光が増加する一般的な傾向がある。鉛センサーの10億分の800を超える高濃度では、このような高濃度での鉛の毒性のために応答が低下することは注目に値する。使用済みの40口径カートリッジケースの内部からエタノール綿棒サンプルを分析すると、原理的な結果を証明します。3つのセンサー細菌のそれぞれから陽性の結果は、銃声残渣に対する陽性試験を示す。このプロトコルで調製されたバイオセンサーは、食品、水、または環境サンプルの汚染を検出するために個別に使用することもできます。この技術は、研究者が様々な異なる化学アニライトのための標準的な合成生物学技術を使用してバイオセンサーを開発する道を開きます。個人的な保護具を着用する必要があり、アナリストは大腸菌を扱った後、手を洗い、表面を消毒する必要があります。廃棄物はオートクレーブ化し、重金属を含む廃棄物はこれに応じて処理する必要があります。

preparation-application-new-bacterial-biosensor-for-presumptive

Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

我々は最近、単純な細菌検出用蛍光アッセイを "ミックス·アンド·読む"を設定するために適用できる蛍光DNAザイムプローブを生成するための斬新なアプローチが報告されています。これらの特殊なDNAプローブは、それによって蛍光シグナルの生成に細菌検出を翻訳する特定の細菌によって産原油の細胞外液（CEM）の存在下で発色団修飾DNA-RNAキメラ基質の切断を触媒する。本報告では、特定のDNAザイムプローブは、...

蛍光性DNAzymesを使用した細菌の検出

我々は、迅速な菌の検出および同定のための電気化学センサの測定方法を説明する。アッセイは、リボソームRNA（rRNAの）種特異的配列のためのDNAオリゴヌクレオチド捕捉プローブで官能化されたセンサアレイを含む。捕捉プローブと西洋ワサビペルオキシダーゼ連動DNAオリゴヌクレオチドの検出プローブでターゲットのrRNAのサンドイッチハイブリダイゼーションは、測定電流測定電流を生成する。...

電気化学センサを用いた細菌検出＆識別

出典: Barber、AE、 et al。 銃弾残留物の推定検出のための新しい細菌バイオセンサの調製と応用J. Vis.

細菌バイオセンサーを用いた標的分析物の検出

まず培地中に懸浮させた細菌バイオセンサー培養から始めます。これらの遺伝子操作細菌は転写因子を産生し、特定の糞便代謝物に結合すると蛍光リポーター遺伝子に関連するプロモーターを活性化します。この培養に、宿主とマイクロバイオームの相互作用に関与する乳酸などの代謝産物を含むろ過されたヒト便サンプルを加えます。この混合物を新鮮な培地で希釈し、最適な反応容積を保ちます。人間の腸環境を模倣するために、震えずに孵化させてください。糞便代謝物は細菌細胞内に拡散し、転写因子に結合します。この複合体はプロモーターに結合し、リポーター遺伝子発現とタンパク質産生を引き起こします。溶液を均一分布に混ぜ、バッファーで希釈し、フローサイトメトリーで分析します。細菌細胞がレーザーを通過する際、リポータータンパク質から発せられる蛍光が特定の糞便代謝物の存在を確認します。...

細菌バイオセンサーを用いたヒト糞便代謝物の検出

出典: Zhang, M. ら、 単一細菌における重水素取り込みの刺激ラマン散乱イメージングによる迅速抗菌薬感受性試験。J. Vis. Exp.

誘導ラマン散乱顕微鏡を用いた細菌抗生物質感受性の検出

溶菌ファージバイオセンサーと抗体ビーズメチシリン耐性（MRSA）と敏感ブドウ球菌の細菌を区別することができます。ファージを水晶振動子マイクロバランスセンサーの表面上にラングミュア·ブロジェット法で固定し、広範囲のブドウ球菌プローブとして働いていた。抗体ビーズはMRSAを認識しています。...

抗生物質耐性ブドウ球菌の細菌の検出のためのバイオセンサー

16S rRNAのをターゲットジゴキシン標識DNAプローブを用いたパラフィン包埋組織内細菌のその場検出で

この作品は、ハイブリッドの...

生体分子相互作用を検出する β-ラクタマーゼによる伝導度バイオ センサー法の使用

腸炎ビブリオを検出するポリ酸安定、金ナノ粒子修飾、スクリーン印刷された炭素電極を構成する電気化学的 DNA...

食品由来病原体を検出する電気化学的 DNA のバイオ センサーの開発

静電容量センサーとの組み合わせでの刷り込みが分子を使用して複雑なソリューションで検出および低分子の定量化のプロトコルを紹介します。...

分子インプリントを用いたバイオ マーカーの超高感度検出による静電容量センサー

アシネトバクター・バウマニーの迅速かつ正確な検出を容易にするために、A.

Recombinase Polymerase Amplification/Cas12aベースシステムを用いた Acinetobacter baumannii 感染症の迅速かつ特異的な検出

学ぼう、合成生物学技術を用いた細菌性バイオセンサの調製法と蛍光分光法による発砲残渣検出の手法。この低コストな法医学的手法は、標準的な合成生物学パーツを使用した様々な化学物質検出システムの開発に応用可能です。

発砲残渣の推定検出のための新しい細菌性バイオセンサの調製と適用

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