Name: ポマリドマイドベースのホモ・プロタクによるE3ユビキチン・リゲス・セレブロンの化学的不活性化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 学ぶポマリドマイドベースのホモ・プロタクを用いたE3ユビキチン・リゲス・セレブロンの化学的不活性化手法。CRBN分解誘導剤の合成と特性評価により、肥満や感染症などの治療への臨床応用可能性を探索する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、ドイツのフォルシュンゲミンシャフト(エミーノエーテルプログラムKr-3886/2-1とSFB-1074からJ.K.まで)によってサポートされました。FOR2372 から M.G.

1. PROTAC分子の調製
注意:使用前に、関連するすべての材料安全データシート(MSDS)を参照してください。これらの合成に使用される化学物質のいくつかは、有毒で発癌性です。適切な安全対策と個人用保護具をご利用ください。
<ol><li>テルト-ブチルN-(2,6-ジオキソ-3-ピプリジル)カルバメート(化合物1) 
	<ol>
<li>1,1'-カルボニルジミダゾール(1.95g、12mmol)と触媒量4-(ジメチルミノ)ピリジン(5mg)をTHF(2.46g、10mmol)の混合物に加え、100mLのラウンドボトムフラスでフラスクを加えます。明確な溶液が形成されるまで攪拌しながら10時間還流で熱する。</li>
		<li>ロータリーエバポレータで減圧下の溶媒を取り出し、EtOAc(200mL)を加え、分離漏斗に移します。H2O (50 mL) と塩水 (50 mL) で有機層を洗浄し、Na2SO4の上に乾燥させます。</li>
		<li>シリカゲル(直径5cm、高さ5cm)の短いパッドを通して溶液を濾過し、EtOAcのさらなる容積(200 mL)で溶出します。</li>
		<li>溶媒を蒸発させ、得られた無色固体を真空中で乾燥させる。</li>
	</ol></li>
	<li>テルト-ブチルN-(1-メチル-2,6-ジオキソ-3-ピプリジル)カルバメート(化合物2) 
	<ol>
<li>化合物1(2.28g、10mmol)と粉砕炭酸カリウム(2.76g、20mmol)とDMF(25 mL)を100mLの丸底フラスコに組み合わせます。 注射器を使用してヨードメタン(1.42g、0.62 mL、10 mmol)をドロップワイズに追加し、フラスコに穴あけゴム中隔を装備します。反応容器を超音波浴に2時間入れます。</li>
		<li>EtOAc(100 mL)で反応混合物を希釈し、分離漏斗に移します。有機層を1 N NaOH(2x 25 mL)、H2O(25 mL)、塩水(25 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させます。</li>
		<li>溶媒を濾過し、蒸発させる。石油エーテル/EtOAc(2:1)を使用して、シリカゲル(6cmカラム直径と20cmの高さ)上のカラムクロマトグラフィーで製品を精製します。</li>
	</ol></li>
	<li>2-(2,6-ジオキソピプリジン-3-yl)-4-フルオロイソインドリン-1,3-ジオン(化合物3)の調製
	<ol>
<li>3-フルオロフタリック無水物(1.25g、7.5mmol)、グルタリミド1(1.14g、5mmol)、酢酸ナトリウム(0.50g、6.0mmol)を氷河酢酸(20mL)で50mLの丸底フラスクに加え、バルフラスを含むフラスコを含みます。 混合物を120°Cで6時間加熱します。</li>
		<li>冷却後、H2O(100mL)に紫色の混合物を注ぎ、濾過によって形成された固体を集め、H2 O(3×5mL)と石油エーテル(3×5mL)で洗浄し、真空中で乾燥させます。</li>
	</ol></li>
	<li>4-フルオロ-2-(1-メチル-2,6-ジオキソピオリジン-3-yl)イソインドリン-1,3-ジオン(化合物4)
	<ol>
<li>3-フルオロフタリック無水物(1.25g、7.5mmol)、グルタリミド2(1.21g、5mmol)、アセテートナトリウム(0.50g、6.0mmol)を氷河酢酸(20mL)で100mLの丸底フラスクで凝縮します。 混合物を120°Cで6時間加熱します。</li>
		<li>冷却後、H2O(100mL)に紫色の混合物を注ぎ、濾過によって形成された固体を集め、H2 O(3×5mL)と石油エーテル(3×5mL)で洗浄し、真空中で乾燥させます。</li>
	</ol></li>
	<li>テルブチルN-[2-[2-][2-[2-[2,6-ジオキソ-3-ピプリジル]-1,3-ジオキソ-イソインドリン-4-yl]アミノ[エトキシ]エトキシ[エトキシ]カルバメート化合物(7) 
	<ol>
<li>50mLの丸底フラスコをテルトで充電 -ブチルN -[2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エチル[カルバメート(5,0.41g、 1.65 mmol)、化合物3(0.41g、1.50 mmol)、乾燥DMF(10 mL)およびDIPEA(0.39グラム、0.51 mL、3.0ミリル)。 攪拌棒と還流コンデンサーを装備します。アルゴン雰囲気下で10°Cで10時間加熱する。</li>
		<li>室温まで冷却した後、H2 O(100 mL)に濃緑色の混合物を注ぎ、分離漏斗でEtOAc(3x 50 mL)で抽出します。H2O (50 mL) と塩水 (50 mL) で有機層を組み合わせて洗浄し、Na2SO4を塗り、フィルターを使用し、真空中に濃縮します。</li>
		<li>石油エーテル/EtOAc(1:1~1:2)の勾配を使用して、シリカゲル(3cmカラム径および高さ60cm)上のカラムクロマトグラフィーで粗質な製品を浄化します。</li>
	</ol></li>
	<li>ホモジマーの調製(化合物8)
	<ol>
<li>α、ω-ジアミンリンカー6(0.22g、0.22mL、1.50 mmol)、DIPEA(1.05mL、6.00mmol)、および50mLのラウンドボトムフラスクで3(0.83g、3.00 mmol)の溶液を50mLのラウンドボトムフラスクで組み合わせます。 アルゴン雰囲気下で18時間90°Cで熱する。</li>
		<li>室温まで冷却した後、H2 O(100 mL)に濃緑色の混合物を注ぎ、分離漏斗でEtOAc(3x 50 mL)で抽出します。H2O (50 mL) と塩水 (50 mL) で有機層を組み合わせて洗浄し、Na2SO4を乾燥させ、フィルターを使用して真空中に濃縮します。
</li>
		<li>EtOAcに石油エーテル/EtOAc(1:2)の勾配を使用して、シリカゲル(3cmカラム直径と50センチメートルの高さ)上のカラムクロマトグラフィーによって粗質な製品を浄化します。</li>
	</ol></li>
	<li>ヘテロダイマーの調製(化合物9)
	<ol>
<li>乾燥CH2Cl2(10mL)に化合物7(0.83g、1.65mmol)を溶解する。 トリフルオロ酢酸(10mL)を加え、黄色の混合物を40°Cで2時間、閉じた50mLの丸底フラスコでかき混ぜます。</li>
		<li>揮発性物質を除去し、CH2Cl 2(4x 5 mL)で凝ババポレートします。残渣を真空で10時間乾燥させます。</li>
		<li>乾燥したDMF(20 mL)で材料をリディス溶解します。化合物4(0.44g、1.50 mmol)とDIPEA(0.78g、1.05 mL、6.00 mmol)を追加し、フラスコに還流凝縮器を装備します。 アルゴン雰囲気下で10°Cで10時間加熱する。</li>
		<li>室温まで冷却した後、H2 O(100 mL)に濃緑色の混合物を注ぎ、分離漏斗でEtOAc(3x 50 mL)で抽出します。飽和NaHCO 3(50 mL)、H2 O(50 mL)、10%KHSO4(50 mL)、H2 O(50 mL)、塩水(50mL)で有機層を洗浄し、Na2 SO4上に乾燥させ、フィルターを真空中に濃縮します。 </li>
		<li>EtOAcに石油エーテル/EtOAc(1:2)の勾配を使用して、シリカゲル(3cmカラム直径と50センチメートルの高さ)上のカラムクロマトグラフィーによって粗質な製品を浄化します。</li>
		<li>核磁気共鳴(NMR)上のDMSO-d6における1H NMRおよび13C NMRスペクトルによる分子構造(図5A化合物8、5B化合物9)の解明と検証分光 器。液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)により、両方の化合物の純度が97%を超え、ダイオードアレイ検出(DAD)を220~500nmで適用することを確認してください。</li>
	</ol></li>
</ol>2. PROTAC分子の機能的検証
<ol><li>PROTACによるCRBN分解のウェスタンブロット分析 注:化合物の効果8およびコンパウンド9CRBNタンパク質レベルに関して、ウェスタンブロット分析により試験した。また、IKZF1 レベルおよび IKZF3 レベルへの影響も確認できます。図 6).<ol><li>
サンプル調製
		<ol>
<li>化合物8および9、レナリドミド(Len)、ポマリドミド(Pom)、MG132、およびMLN-4924を10mMの濃度で溶解し、アリコートをさらに使用するまで-80°Cで保存する。</li>
			<li>2.5 mL媒体を用いて6ウェルプレートにシード1 x 106 MM1S細胞を入れ、100 nMまたは1 μM化合物8または9を24時間で処理します。 </li>
			<li>700 x g、5分、4°Cで治療と遠心分離機の後に細胞を収穫します。冷たい1x PBSでセルペレットを洗浄し、残りの培温を700xg、5分、4°Cで除去し、上清を廃棄します。 この手順を 1 回繰り返します。</li>
			<li>ライシスバッファー中のライゼ細胞(25 mMトリスHCl pH 7.4、150 mM NaCl、1%NP-40、1mM EDTA、5%グリセロール、1xプロテアーゼ&ホスファターゼ阻害剤カクテル)の氷上で10分間、遠心分離機を320 x gで10分間、10分間°C。上清を収穫し、メーカーのプロトコルに従ってビシンコニン酸タンパク質アッセイ(BCAアッセイ)によってタンパク質濃度を決定する。</li>
			<li>1x LDS負荷バッファー(5%2-メルカプトエタノール)を伴う変性タンパク質(15~30μg/サンプル)と沸騰10分、75°C。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
SDS-ページ
		<ol>
<li>10%分離ゲル[4 mL 3xゲルバッファー(3 Mトリス/HCl、 0.3% (w/v) ドデシル硫酸ナトリウム (SDS), pH 8.45), 4 mL アクリルアミド 30%, 2.52 mL グリセロール 50%, 1.395 mL H2O, 75 μL 11% ペルスルフェートアンモニウム (APS), および 9.75 μL TEMED と 9.75 μL TEMED とゲルを積み重ねます。 [1.992 mL 3xゲルバッファー、0.792 mL 30%アクリルアミド、3.168 mL H2O、36 μL 11%APS、および6 μL TEMED]を電極組立ユニットに入します。櫛を取り外し、カソードバッファー(100 mMトリス/HCl、100 mMトリシン、0.1%(w/v)SDS)、およびロードサンプルでウェルをフラッシュします。</li>
			<li>アノードバッファ(100 mMトリス/HCl、pH 8.9)をタンクに充填します。ステップ2.1.1.4からタンパク質サンプルをロードし、SDS-PAGEを70V、20分、続いて一定電圧で115V、150分で実行します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
CRBN、IKZF1およびIKZF3の免疫ブロッティングと検出
		<ol>
<li>PVDF膜(0.45 μm)を100%メタノールで1分間平衡化し、ゲルを1x転写バッファーで分離[10x転写バッファー(192mMグリシン、25mMトリスベース/HCl、900mL H2O)、20%メタノール、0.1%SDS、p.8.p.H.SDSを活性化する。</li>
			<li>メーカーのプロトコルに従ってブロッティングカセットを組み立てます。ゲルを180mAで90分間転写します。</li>
			<li>1x TBS-T(25 mMトリス/HCl、150 mM NaCl、pH 7.6、0.1%ツイエン20)で膜3xを室温でそれぞれ5〜10分間洗浄します。5%非脂肪乾燥乳(NFDM)で膜をブロックし、室温で1時間TBS-T。1X TBS-Tで膜3xを室温で5~10分間洗浄します。</li>
			<li>CRBN(5%BSA、TBS-Tで1:500)の一次抗体を用いて膜をインキュベートし、一晩4°Cで穏やかに振ります。</li>
			<li>1X TBS-Tで膜3xを室温で5~10分間洗浄します。抗マウス(5%NFDMで1:10.000、TBS-T)または抗ウサギ(5%NFDMで1:5.000、TBS-T)をワサビペルオキシダーゼHRPに結合した二次抗体(室温で1時間)で膜をインキュベートする。</li>
			<li>1X TBS-Tで膜2xを室温で5~10分間洗浄します。1x TBS でこの手順を 2 回繰り返します。</li>
			<li>メーカーのプロトコルに従ってHRP基板溶液で2分間膜をインキュベートし、化学発光検出装置で化学発光を検出します。</li>
			<li>1X TBSで1xで1xを洗浄し、室温でそれぞれ5~10分間洗浄します。抗体の放出については、市販のストリッピングバッファー内のストリップ膜を15分間洗浄し、1X TBSで膜を3倍、室温でそれぞれ5~10分間洗浄する。</li>
			<li>5%の非脂肪乾燥牛乳で膜を再ブロックし、室温で1時間TBS-T。1x TBS-Tで1xで膜を5~10分間室温で洗浄し、ステップ2.1.3.4に従ってIKZF1、IKZF3またはチューブリンで再プローブします。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>MG132、MLN4942またはポマリドミドとの競争実験 注:CRBNがユビキチン・プロテアソーム経路を介して分解されるかどうかを確認するために、プロテアソーム阻害剤MG132とネディリレーション活性化酵素(NAE)阻害剤MLN4942(図7)との競合実験を行った。<ol>
<li>種子1 x 106 MM1S細胞を6ウェルプレートでウェルあたり。10 μM MG132、10 μM MLN4942、またはレナリドミド(100x)を持つプレトリート細胞は、37°Cで1hをインキュベートし、5%CO2.</li>
		<li>37 °C で 3 h の 100 nM化合物8を追加します。</li>
		<li>ステップ2.1.1に従ってウェスタンブロットの細胞を収穫する。</li>
	</ol></li>
	<li>多発性骨髄腫細胞株における細胞生存率アッセイ 注:このアッセイは、細胞生存率への影響を試験するために使用され、さらに、化合物8を有する細胞の前処理によって多発性骨髄腫細胞に対するIMiDsの効果に拮抗する(図8、図9A、B)。<ol>
<li>生物学的三重分化における96ウェルプレート中のウェル当たり種子5 x 104 MM1S細胞は、生存率アッセイ用である。ウェスタンブロット分析の場合、生物学的三重分化における6ウェルプレートでウェル当たりシード1 x 106 MM1S細胞を種子化する。</li>
		<li>DMSOまたは100 nM、1 μM、または10 μM化合物8、化合物9またはポマリドミドで細胞を処理し、37°C、5%CO2で24時間、48時間、または96hのインキュベートを行います。 救助実験のために、1μMポマリドミドを添加する前または後に、100 nM化合物8を3時間で処理し、96時間インキュベートする。</li>
		<li>ウェスタンブロット分析用の6ウェルプレートからプレートリーダーまたは収穫細胞のメーカーのプロトコルに従って、発光細胞生存率アッセイで96ウェルプレート発光を測定します。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+primary+target+of+thalidomide+teratogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity.</a> Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).</li>
<li>Lopez-Girona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cereblon+is+a+direct+protein+target+for+immunomodulatory+and+antiproliferative+activities+of+lenalidomide+and+pomalidomide%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide.</a> Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).</li>
<li>Fischer, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+DDB1-CRBN+E3+ubiquitin+ligase+in+complex+with+thalidomide%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide.</a> Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).</li>
<li>Gandhi, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+agents+lenalidomide+and+pomalidomide+co-stimulate+T+cells+by+inducing+degradation+of+T+cell+repressors+Ikaros+and+Aiolos+via+modulation+of+the+E3+ubiquitin+ligase+complex+CRL4%28CRBN%29%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN).</a> British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).</li>
<li>Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lenalidomide+induces+degradation+of+IKZF1+and+IKZF3%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3.</a> Oncoimmunology. 3 (7), e941742(2014).</li>
<li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myeloma+drug+lenalidomide+promotes+the+cereblon-dependent+destruction+of+Ikaros+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins.</a> Science. 343 (6168), 305-309 (2014).</li>
<li>Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+action+of+immune-modulatory+drugs+thalidomide%2C+lenalidomide+and+pomalidomide+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+Lymphona%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma.</a> Leukemia & Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).</li>
<li>Chamberlain, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+Cereblon-DDB1-lenalidomide+complex+reveals+basis+for+responsiveness+to+thalidomide+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).</li>
<li>Donovan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalidomide+promotes+degradation+of+SALL4%2C+a+transcription+factor+implicated+in+Duane+Radial+Ray+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome.</a> eLife. 7, (2018).</li>
<li>Matyskiela, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SALL4+mediates+teratogenicity+as+a+thalidomide-dependent+cereblon+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate.</a> Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).</li>
<li>Kronke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lenalidomide+induces+ubiquitination+and+degradation+of+CK1alpha+in+del%285q%29+MDS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS.</a> Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).</li>
<li>Sakamoto, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protacs%3A+chimeric+molecules+that+target+proteins+to+the+Skp1-Cullin-F+box+complex+for+ubiquitination+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).</li>
<li>Sakamoto, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Protacs+to+target+cancer-promoting+proteins+for+ubiquitination+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).</li>
<li>Schneekloth, J. S. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+genetic+control+of+protein+levels%3A+selective+in+vivo+targeted+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).</li>
<li>Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PROTACs%3A+An+Emerging+Targeting+Technique+for+Protein+Degradation+in+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery.</a> Bioessays. 40 (4), e1700247(2018).</li>
<li>Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+approaches+to+targeted+protein+degradation+through+modulation+of+the+ubiquitin-proteasome+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).</li>
<li>Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+protein+degradation+by+PROTACs%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Targeted protein degradation by PROTACs.</a> Pharmacology & Therapeutics. 174, 138-144 (2017).</li>
<li>Winter, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phthalimide+conjugation+as+a+strategy+for+in+vivo+target+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation.</a> Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).</li>
<li>Maniaci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homo-PROTACs%3A+bivalent+small-molecule+dimerizers+of+the+VHL+E3+ubiquitin+ligase+to+induce+self-degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation.</a> Nature Communications. 8 (1), 830(2017).</li>
<li>Crew, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Characterization+of+Von+Hippel-Lindau-Recruiting+Proteolysis+Targeting+Chimeras+%28PROTACs%29+of+TANK-Binding+Kinase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1.</a> Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hijacking+the+E3+Ubiquitin+Ligase+Cereblon+to+Efficiently+Target+BRD4%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4.</a> Chemistry & Biology. 22 (6), 755-763 (2015).</li>
<li>Steinebach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PROTAC-mediated+crosstalk+between+E3+ligases%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases.</a> Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).</li>
<li>Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule-mediated+protein+knockdown+as+a+new+approach+to+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Medchemcomm%22%5BJournal%5D)">Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery.</a> Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).</li>
<li>Steinebach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homo-PROTACs+for+the+Chemical+Knockdown+of+Cereblon%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon.</a> ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).</li>
<li>Ambrozak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+Antiangiogenic+Properties+of+Tetrafluorophthalimido+and+Tetrafluorobenzamido+Barbituric+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids.</a> ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).</li>
<li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+Small-Molecule+Degrader+of+Bromodomain+and+Extra-Terminal+%28BET%29+Proteins+with+Picomolar+Cellular+Potencies+and+Capable+of+Achieving+Tumor+Regression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression.</a> Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis+Targeting+Chimeras+%28PROTACs%29+of+Anaplastic+Lymphoma+Kinase+%28ALK%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK).</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).</li>
<li>Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+genetics+approaches+for+selective+intervention+in+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).</li>
<li>Kronke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lenalidomide+causes+selective+degradation+of+IKZF1+and+IKZF3+in+multiple+myeloma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells.</a> Science. 343 (6168), 301-305 (2014).</li>
<li>Eichner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+drugs+disrupt+the+cereblon-CD147-MCT1+axis+to+exert+antitumor+activity+and+teratogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity.</a> Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).</li>
<li>Zhu, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cereblon+expression+is+required+for+the+antimyeloma+activity+of+lenalidomide+and+pomalidomide%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide.</a> Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).</li>
<li>Kortum, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+sequencing+of+refractory+myeloma+reveals+a+high+incidence+of+mutations+in+CRBN+and+Ras+pathway+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes.</a> Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).</li>
<li>Gil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cereblon+deficiency+confers+resistance+against+polymicrobial+sepsis+by+the+activation+of+AMP+activated+protein+kinase+and+heme-oxygenase-1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).</li>
<li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cereblon+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cereblon in health and disease.</a> Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 468 (8), 1299-1309 (2016).</li>
<li>Lee, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+cereblon+gene+enhances+hepatic+AMPK+activity+and+prevents+high-fat+diet-induced+obesity+and+insulin+resistance+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice.</a> Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).</li>
</ol>

著者は、潜在的な金銭的利益相反を宣言していません。

CRBNのためにここに説明するこのようなホモPROTACの設計は、多くのヘテロビ機能PROTACでうまく利用され、PROTAC 8の高度な開発をもたらしたCRBNに対するポマリドミドの特定の親和性に依存しています。選択的 CRBN デグレーダー。我々の分子の特異性は、プロテオミクス分析24によって既に確認されている。遺伝的に媒介されたノックアウトのために、 副作用の排除と検証は困難で時間がかかります。さらに、化学的に誘導されたノックダウンは可逆的で、迅速かつ直接細胞および組織タイプ28の広いスペクトルに適用可能である。
IMiDsサリドマイド、レナリドミド、ポマリドマイドは、多発性骨髄腫、B細胞リンパ腫および骨髄異形成症候群の治療において主力となっている。IMiDsは、CRBN-CRL4 E3リゲスの特異性を調節して、ネオ基板IKZF1、IKZF3、またはCK1α6、11、29を分解す...

免疫調節薬(IMiDs)サリドマイドおよびその類似体、レナリドミドおよびポマリドマイドは、すべて多発性骨髄腫の治療のために承認され、E3ユビキチンリゲスセレブロン(CRBN)、カリン4A-RING E3ユビキチンリゲスの基板アダプターに結合する(CRL4CRBN)1,2,3.IMiDsの結合は、リンパ球転写因子イカロス(IKZF1)およびアイオロス(IKZF3)に対するCRL4CRBNの親和性を高め、そのユビキチン化と劣化を引き起こし(図1)4、5、 6,7,8.IKZF1およびIKZF3は多発性骨髄腫細胞に不可欠であるため、それらの不活性化は増殖抑制をもたらす。SALL4は最近、サリドマイド9、10によって引き起こされた1950年代のテラトジェニシティといわゆるコンテルガン大惨事の原因となる可能性が高いCRBNの追加IMiD誘発ネオ基板として発見された。対照的に、カゼインキナーゼ1α(CK1α)は、染色体5q欠失11を有する骨髄異形成症候群における治療効果に関与するCRBNのレナリドミド特異的基質である。
分解のために特定のタンパク質を標的とする低分子の能力は、現代の薬剤開発にとってエキサイティングな意味を持っています。サリドマイドとその類似体のメカニズムは、ヒトで初めて使用された後に発見されたが、いわゆるPrオテオリシスTaはCヒデラス(PROTAC)と呼ばれ、目的のタンパク質(POI)を特異的に標的にするように設計されている(図)2)12,13,14,15,16,17,18.PROACは、CRBNまたはフォンヒッペルリンダウ(VHL)18、19、20、CRBNのようなE3ユビキチンリガーゼのリガンドにリンカーを介して接続されたPOIのための特定のリガンドからなるヘテロビ機能分子である。 21、22。PROTACは一過性三項複合体の形成を誘発し、POIをE3ユビキチンリゲスに導き、そのユビキチン化およびプロテアソーム分解をもたらす。従来の阻害剤に比べてPROTACの主な利点は、POIへの結合がその阻害よりも十分であり、したがって、PROTACは、薬物使用不能と考えられていたものを含む、はるかに広い範囲のタンパク質を標的にする可能性があることです。転写因子15.さらに、キメラ分子は触媒的に作用するため、高い効力を有する。POIへのユビキチン転移後、三項複合体は解離し、新しい複合体の形成に利用できる。したがって、非常に低いPROTAC濃度は、標的タンパク質23の分解のために十分である。
ここでは、それ自体の劣化のためにCRBNを募集するポマリドマイド-ポマリドマイド共役ホモ-PROTAC(化合物8)の合成について説明する24.E3ユビキチン・リガーゼCRBNは、リクルーターとターゲットの両方を同時に務めます(図3)。データを検証するために、負の結合制御(化合物9)も合成しました。 我々のデータは、新たに合成されたホモ-PROTACがCRBN分解に特異的であり、他のタンパク質に対する影響が最小限であることを確認します。

<table><tbody><tr><td>1,1'-カルボニルジイミダゾール</td><td>TCI化学物質</td><td>C0119</td><td></td></tr><tr><td>2,2&prime;-(エチレンジオキシ)-ビス(エチルアミン)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>385506</td><td>化合物6-2</td></tr><tr><td>-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>3-フルオロフタル酸無水物、98%</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12275</td><td></td></tr><tr><td>4-ジメチルアミノピリジン、99%</td><td>アクロス</td><td>148270250</td><td>有毒</td></tr>な<tr><td>アクリルアミドスタンムル&ouml;sung/ Bisacrylamid (30%/0,8%)</td> <td>Carl Roth</td><td>3029.1</td><td></td></tr><tr><td>Aiolos (D1C1E) mAB</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>15103S</td><td></td></tr><tr><td>ウサギで産生された抗CRBN抗体</td><td>Sigma</td><td>HPA045910</td><td></td></tr><tr><td>抗ウサギIgG HRP結合抗体</td><td>Sigma</td><td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム</td><td></td><td>Roth 9592.2</td><td></td></tr><tr><td>Boc-Gln-OH</td><td>TCI化学物質</td><td>B1649</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td><td>Promega</td><td>G7571</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc XRS+</td><td>Bio-Rad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>DMF、無水、99.8 %</td><td>Acros</td><td>348435000</td><td>Extra Dry over Molecular Sieve</td></tr><tr><td>DMSO、無水、99.7 %</td><td>アクロス</td><td>348445000</td><td>モレキュラーシーブグリ</td></tr><tr><td>シン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15523-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス (HRP 共役)</td> <td>サンタ クルス バイオテクノロジー</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>停止プロテアーゼ &ホスファターゼ阻害剤シングルユースカクテル(100X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1861280</td><td></td></tr><tr><td>Ikaros (D6N9Y) Mab</td><td>Cell signaling</td><td>14859S</td><td></td></tr><tr><td>ImmobilonP Transfer Membrane (0,45&micro;m)</td><td>Merck</td><td>IPVH000010</td><td></td></tr><tr><td>Iodomethane, 99 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8507</td><td>高毒性</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32213-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Mg132</td><td>Selleckchem</td><td>S2619</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot 電気泳動転写セル</td><td>Bio-Rad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>MLN4942</td><td>バイオモール (ケイマン)</td> <td>Cay15217-1</td><td></td></tr><tr><td>マウスで産生されたモノクローナル抗アルファ (B512)</td> <td>シグマ</td><td>T5168</td><td></td></tr><tr><td>N-エチルジイソプロピルアミン、99 %</td><td>アルファ エーザー</td><td>A11801</td><td></td></tr><tr><td>脱脂粉乳</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A0830,0500</td><td></td></tr><tr><td>Nunc F96 MicroWell Whiteポリスチレンプレート</td><td>Thermo Scientific</td><td>136101</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Pomalidomide</td><td>Selleckchem</td><td>S1567</td><td></td></tr><tr><td>RestoreTM Western Blot Stripping Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>46430</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウムドデシル硫酸塩</td><td>カール・ロス</td><td>183.1</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539-500g</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>カール・ロス</td><td>2367.3</td><td></td></tr><tr><td>tert-ブチル N-[2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エチル]カルバメート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89761</td><td>化合物 5</td></tr><tr><td>トリシン</td><td>カール・ロス</td><td>6977.4</td><td></td></tr><tr><td>トリズマ塩基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-500ml</td><td></td></tr><tr><td>WesternBright ECL スプレー</td><td>Advansta</td><td>K-12049-D50</td><td></td></tr></tbody></table>

ポマリドマイドベースのホモ・プロタクによるe3ユビキチン・リゲス・セレブロンの化学的不活性化

Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs

免疫調節薬(IMiDs)サリドマイドおよびその類似体、レナリドミドおよびポマリドマイド、多発性骨髄腫の治療のためのすべてのFDA承認薬は、リンパ球転写因子イカロス(IKZF1)およびアイオロスのユビキチン化および分解を誘導する(IKZF3)プロテアソメ分解のためのセレブロン(CRBN)E3ユビキチンリゲスを介して。IMiDsは最近、CRBN E3リゲスによるユビキチン化およびプロテアソーム分解のための他のタンパク質を標的とするキメラ(PROTAC)を標的とする二機能性プロテオリシスの生成に利用されている。ポマリドマイドベースのホモビ機能PROTACを設計・合成し、CRBNの自己指向ユビキチン化と分解を誘導する能力を解析した。ここで、CRBNは、E3ユビキチンライゲスとターゲットの両方を同時に機能する。ホモ-PROTAC化合物8は、IKZF1およびIKZF3に対する残りの影響を最小限に抑えながら、高い効力を持つCRBNを分解します。化合物8によるCRBN不活性化は、細胞生存率および異なる多発性骨髄腫細胞株の増殖に影響を及ぼさなかった。このホモ-PROTACは、多発性骨髄腫細胞におけるIMiDsの効果を損なう。したがって、当社のホモディメリックポマリドミド系化合物は、CRBNの内因性基質と生理機能を同定し、IMIDsの分子機構を調るのに役立つ可能性があります。

ここでは、CRBNの分解に対するホモディメリックポマリドミドベースのPROTACの設計、合成及び生物学的評価について説明した。当社のPROTACは、2つのCRBN分子と同時に相互作用し、ポマリドミド誘発ネオ基板IKZF1またはIKZF3に対する残りの影響を最小限に抑えながら、CRBNの自己ユビキチン化およびプロテアソーム分解を誘導する三項複合体を形成します。
以前に公表された一連のポマリドミド系PROTAC分子24のうち、化合物8はCRBNの化学的誘導分解において特に有効であった。その合成は以下のように行うことができる(図4)。1,1'-カルボニルジミダゾール促進されたBoc保護l-グルタミンの凝縮は、環化イミド1につながる。N-メチル化アナログ2は、ヨウ化メチ...

本研究では、サリドマイド類似体の標的であるE3ユビキチン・リゲス・セレブロン(CRBN)のユビキチン化および分解を誘導する新規アプローチとして、ポマリドマイドベースの二機能ホモ-PROTACの合成と特徴付けについて述べている。

ポマリドマイドベースのホモ・プロタクによるE3ユビキチン・リゲス・セレブロンの化学的不活性化

The immunomodulatory drugs (IMiDs) thalidomide and its analogs, lenalidomide and pomalidomide, all FDA approved drugs for the treatment of multiple ...

当社のホモジメリックPROTACは、セレブロンの最初の化学阻害剤であり、サリドマイド類似体の分子機構をさらに解明し、セレブロンの生理学的機能を調べるのに役立つ可能性があります。この新しいPROTACプラットフォーム技術は、他の方法では追跡不可能と考えられている目的のタンパク質を特異的に標的化するのに非常に役立ちます。CRBN阻害だけでは抗腫瘍活性を有しない。しかし、CRBN分解剤は、肥満、感染症、および他の障害に臨床的な影響を与える可能性があります。合成は困難であり、PROTAC化合物を設計する際に効果的なタンパク質分解剤を生成するための最適なリンカーとアタッチメントを見つけるのは難しいです。まず、ボック保護L-グルタミン2.46グラムとテトラヒドロフラン50ミリリットルを100ミリリットルの丸底フラスコに入れ、800rpmで1分間かき混ぜます。次に、1.95グラムの1、1'カルボニルジミダゾール、触媒量の4-ピリジンを加えます。還流で10時間撹拌を続け、グルタリミド化合物の透明な無色溶液を得る。溶液を室温まで冷やし、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去する。酢酸エチルの200ミリリットルで残渣を再溶解し、セパレーター漏斗に注ぎます。有機層を脱イオン水と塩水をそれぞれ50ミリリットルで洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させます。グリシカゲルを通して溶液を重力濾過し、乾燥剤を除去し、次いで200ミリリットルの酢酸エチルでシリカゲルをリンスする。真空下で濾液から溶媒を除去し、無色固体として化合物1を得た。使用する前に、真空下で一晩乾燥させます。次に、0.50グラムの酢酸ナトリウムを20ミリリットルの氷酢酸に100ミリリットルのラウンドボトムフラスコに溶かします。3-フルオロフタル無水物1.25グラムとグルタリミド1.14グラムを加え、還流で6時間かき混ぜて化合物3の紫色の溶液を得る。混合物を室温まで冷ましてから、100ミリリットルの脱イオン水に注ぎ、化合物3を沈殿させるために10分間かき混ぜます。ろ過して固体を回収し、水と石油エーテルで洗浄し、真空下で2日間乾燥させます。次に、化合物3の0.83グラムと乾燥ジメチルスルホキシドの20ミリリットルを50ミリリットルのシュレンクフラスコに入れ、2分間かき混ぜます。アルファオメガジアミンリンカー化合物6の0.22グラム、N、N-ジイソプロピレチルアミンの1.05ミリリットルを加え、90°Cで18時間アルゴンの下で混合物をかき混ぜて、濃緑色の混合物でホモジマー8を得る。混合物を室温まで冷やし、100ミリリットルの脱イオン水に注ぎます。酢酸エチルの3つの50ミリリットルの部分に製品を抽出し、有機層を組み合わせ、水と塩水のそれぞれ50ミリリットルでそれらを洗浄します。洗浄した有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、乾燥剤を濾過し、真空下で溶媒を除去します。残渣を最小限のクロマトグラフィー溶媒に再溶解し、精製のためにシリカゲルカラムに塗布します。蛍光生成物の分画を集め、それらを組み合わせ、溶媒を除去し、ホモモディマー8を黄色の固体として得る。まず、グルタリミド1の2.28グラムをジメチルホルムアミドの25ミリリットルに100ミリリットルの丸底フラスコに溶解する。この溶液中の粉砕炭酸カリウムの2.76グラムを中断します。その後、20ゲージの針を備えた注射器に0.62ミリリットルのヨウドメタンを引き込みます。10秒間にわたってヨードメタンをドロップワイズ追加します。ゴム中隔でフラスコをストッパーし、ベント針を追加します。混合物を室温で2時間超音波処理し、グルタリミド化合物2を得る。酢酸エチル50ミリリットルで混合物を希釈し、セパレーター漏斗に注ぎます。フラスコを酢酸エチルの別の50ミリリットルで漏斗にリンスします。製品を製造し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、グルタリミド2を無色固体として得ます。グルタリミド化合物1および2の保持時間を比較し、N-メチル化が成功したことを確認した。検証を開始するには、多発性骨髄腫細胞を目的の化合物で処理します。関連するタンパク質を分離し、タンパク質分解のウェスタンブロット分析用サンプルを調製します。次に、SDS-PAGE用のゲルサンドイッチを準備し、アノードバッファータンクにpH 8.9 tris-HCl溶液を充填します。タンパク質サンプルをゲルにロードし、70ボルトで20分間実行し、続いて115ボルトを150分間実行します。次に、免疫ブロッティング用に1x転送バッファを調製し、ゲルをカセットから転写バッファーに慎重に移動して平衡化します。カセットからゲルを取り除くと、破裂して非常に迅速にくしゃくしゃになる可能性があるため、非常に注意する必要があります。0.45マイクロメートルのポリビニリデンジフルオリド膜を純粋なメタノールに少なくとも20秒間浸漬して活性化し、それを1x転送バッファに浸します。ゲルと膜を10分間平衡させます。次いで、ウェスタンブロッティングカセットを組み立て、180ミアンペアを90分間塗布して、タンパク質を膜に移します。その後、免疫染色によりタンパク質を可視化する。細胞生存率に及ぼす影響を評価するために、まず、生物学的三重化における96ウェルプレートのウェル当たり種子50,000多発性骨髄腫細胞。DMSOを含む培地の各ウェル100マイクロリットル、または化合物8、化合物9、またはポマリドミドの0.1、1、または10マイクロモルを加える。細胞生存率救助実験を行うために、代わりに、1つのマイクロモル溶液を加える前または後に、化合物8の100ナノモル溶液で細胞を3時間処理する。5%の二酸化炭素雰囲気で24、48、または96時間摂氏37度で細胞をインキュベートし、発光アッセイで細胞の生存率を測定する。プロトンおよびカーボンNMRで同二量体PROTAC 8の構造を確認した。ヘテロ二量体PROTAC 9は、負の対照として合成され、グルタリミド部分内のN-メチル化として、セレブロン、またはCRBN、結合能の喪失をもたらす。ホモPROTAC 8は、リンパ系転写因子IKZF1およびIKZF3に対する影響を最小限に抑え、完全なプロテオソームCRBN分解に近い誘導を行った。これに対し、ヘテロPROTAC9は、ポマリドミドと同様の挙動を示した。CRBN分解を誘導した化合物8は、プロテアソームの直接阻害剤によって遮断することができ、またはネチリル化阻害によって間接的に遮断される。化合物8で前処理された細胞は、IKZF1およびIKZF3に対するポマリドミドの影響に有意に抵抗した。化合物8誘導CRBN分解は、化合物9およびポマリドミドからのIKZF1およびIKZF3分解よりも96時間後の多発性骨髄腫細胞生存率に対する影響のはるかに少なかった。化合物8で前処理された多発性骨髄腫細胞は、未治療細胞よりもポマリドミドに曝露した場合に有意に高い生存率を有し、化合物8が免疫調節性IMiD薬物耐性を模倣するために使用できることを示唆した。化合物8は、セレブロンの完全なプロテアソーム分解を誘導し、IKZF1およびIKZF3細胞の生存率および増殖に副作用がないことを発見した。プロジェクト技術を他のターゲットに拡張することは、がんやその他の疾患に関連するタンパク質を不活性化し、追跡する可能性を秘めています。他の薬物やタンパク質にこの技術を適応させる場合は、薬物の分子構造とタンパク質標的を慎重に調査して、最適なリンカーと添付ファイルを選択する必要があります。IMiDsはセレブロンの点突然変異のためにマウスでは機能しませんが、さらなる動物実験に使用できるトランスジェニックノックインマウスモデルが存在します。ポマリドマイドは、非常に催奇性である類似サリドマイドであるため、妊婦がこれらの薬物を使用することはお勧めしません。

chemical-inactivation-e3-ubiquitin-ligase-cereblon-pomalidomide-based

Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

有糸分裂を受けている癌細胞でナントPJ-34の細胞傷害活性は、ライブ共焦点イメージングによりリアルタイムで文書化されました。...

ライブ癌細胞で共焦点イメージングで観測異常有糸分裂と関連付けられる細胞死

環境化学物質、酵素中間体の共有結合 DNA の生成に bioactivated が付加体に薬剤の効力を評価するがんとその治療法の開発に重要な分野です。DNA...

共有結合 DNA 付加体生成活性酵素によって発ガン性物質の in Vitro薬物と32p-ポストラベルで決意

本稿は、化学剤のスクリーン ライブラリに阻害剤と T 細胞受容体のシグナル伝達に影響を与えるそれらのターゲットを識別するためフロー ベース フローサイトメトリー分析を使用します。ここで説明する方法は、ハイスループットス...

T 細胞受容体を介してライブラリ化学阻害剤のスクリーニングのメディエーターの同定

このプロトコルは、治療または表現型などの特定の状態に関連するこれらの種類の翻訳後修飾(PTM)の変化を同定するために、ユビキチン(Ub)およびユビキチン様(Ubls)特異的プロテオームを確立することを目的としています。...

ユビキチンおよびユビキチン様依存性翻訳後修飾のプロファイリングと有意な変化の同定

このプロトコルは、標的タンパク質に融合した抗体フリーの内因性タンパク質検出タグを発現させるためにCRISPR/Cas9を使用して操作された生細胞におけるタンパク質分解動態の定量的発光検出について説明しています。定量的劣化パラメータ、レート、Dmax、DC...

HiBiT CRISPR細胞株を用いた標的タンパク質分解化合物のハイスループット細胞プロファイリング(英語)

ここでは、以前に合成したスピロ環式オキシムをテストするために、3-(4',5'-ジメチルチアゾール-2'-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)を使用するバイオアッセイについて説明します。...

官能化スピロ環複素環合成および細胞毒性アッセイ

本プロトコルは、トポイソメラーゼ阻害剤およびホルムアルデヒドによって誘導されるユビキチン化、SUMO化、およびADPリボシル化を含む、DNA-タンパク質架橋(DPC)およびそれらの翻訳後修飾(PTM)を検出および定量するための改変方法を強調し、それによってDPCおよびそのPTMの形成および修復の研究を可能にする。...

DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

本稿では、CRISPR/Cas9システムと3つの表現型ベースのスクリーニング戦略を用いたセントロメア関連プロテインE(CENP-E)ノックアウト細胞の構築について報告します。私たちは、...

CRISPR/Cas9システムを用いたセントロメア関連プロテイン-E CENP-E-/-ノックアウト細胞株の作製

ここでは、ユビキチンリガーゼVon Hippel-Lindau E3リガーゼ(VHL)およびセレブロン(CRBN)を含むキメラ(PROTACS)を標的とするタンパク質分解によって誘導される三元複合体形成の生物物理学的特性評価のためのプロトコルについて説明します。 本明細書に例示される生物物理学的方法には、表面プラズモン共鳴(SPR)、生物層干渉法(BLI)、および等温滴定熱量測定(ITC)が含まれる。...

キメラを標的としたタンパク質分解による三元複合体形成評価のための生物物理学的アッセイの開発と応用(PROTACS)

我々は、2次元（2D）前駆体から、パターン化と再構成可能な粒子の合成の実験の詳細を説明します。この方法論は、ミクロからセンチメートルスケールに至る長さスケールで多面体と把持装置を含む、様々な形状の粒子を作成するために使用できます。...

折り紙インスパイアパターン化され、再構成可能な粒子の自己組織化

学ぶポマリドマイドベースのホモ・プロタクを用いたE3ユビキチン・リゲス・セレブロンの化学的不活性化手法。CRBN分解誘導剤の合成と特性評価により、肥満や感染症などの治療への臨床応用可能性を探索する。

ポマリドマイドベースのホモ・プロタクによるE3ユビキチン・リゲス・セレブロンの化学的不活性化

さらに動画を探す