Name: 一軸引張ひずみ下での生細胞における核動態の高分解能イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学ぶ 一軸引張ひずみ下での生細胞における核動態の高分解能イメージング手法。ポリジメチルシロキサン基板の再設計と100倍油浸対物レンズを用いた装置カスタマイズにより、細胞応答の詳細な解析が可能となる。

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すべての著者は、シンガポール・ MIT 研究技術連合 (SMART) バイオテクノロジー (スマート) バイオ・マイクロメカニックス (BioSyM) 学際研究グループを通じて、シンガポール国立研究財団からの資金援助を感謝しています。著者の Jagielska 博士とヴァン・フリート博士も、Saks ・ Kavanaugh 財団の資金と支援を感謝しています。著者たちは、この作品に記載されたいくつかの実験のためにラットオリゴデンドロサイト前駆細胞を提供するために、シンガポールの南洋理工大学でウィリアム・ Yian 氏と Dr. シンシンに感謝し、著者らは Shivashankar 博士に感謝した。シンガポール国立大学メカノバイオロジー研究所は、核地域の変動について議論しています。

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<li>Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+plasticity+of+the+nucleus+in+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1, 0-5 (2007).</li>
<li>Talwar, S., Kumar, A., Rao, M., Menon, G. I., Shivashankar, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+spatio-temporal+fluctuations+in+chromatin+compaction+states+characterize+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Correlated spatio-temporal fluctuations in chromatin compaction states characterize stem cells.</a> Biophysical Journal. 104, 553-564 (2013).</li>
<li>Makhija, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+strain+alters+cellular+and+nuclear+dynamics+at+early+stages+of+oligodendrocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanical strain alters cellular and nuclear dynamics at early stages of oligodendrocyte differentiation.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 59(2018).</li>
</ol>

作者は何も開示することはありません。

装置は、接着細胞上の細胞外引張株の適用のために、以前に1が設計されている。その作業におけるポリジメチルシロキサン基層の設計は、生化学的アッセイだけでなく、延伸細胞の低解像度イメージングにも十分であった。本研究では、基層を再設計し、高分解能細胞内細胞イメージングを容易にする新規イメージング構成を導入した。このシステムの利点は多数あります: それは、単純なコンポーネントを使用してラボ内に構築することができます、それは市販のひずみデバイス (500 USD 1 細胞株デバイス) と比較して安価であり、それは上だけでなく、組織培養インキュベーター内に収まるのに十分小さいです顕微鏡。さらに、画像化システムは倒立顕微鏡セットアップでここで説明されているが、直立顕微鏡構成については容易に調整することができる。
サンプル調製およびイメージングには、いくつかの重要な手順が含まれています。まず、細胞の生存を確保するために、細胞播種 (プロトコルステップ 2.8) を行う前に、ポリジメチルシロキサンプレートと四角コンパートメントを完全に洗浄する必要がありま...

体内の細胞および組織は、引張株を含む様々な機械的手がかりを受ける。しかしながら、これらの手掛かりが神経細胞の生物学に及ぼす影響は、未だ広範囲に研究されておらず、十分に理解できていない。中枢神経系において、機械的ひずみの発生源には1、2、3、4の発達的成長、脊髄の屈曲、血液、脳脊髄液などの生理的過程が含まれます。脈動、および外傷などの病的状態、軸索腫脹、グリア瘢痕、または腫瘍増殖5、6、7、8。引張ひずみがオリゴデンドロサイトの分化にどのように影響するかを調査する価値があり、脊椎動物の中枢神経系における重要なプロセスである軸索のその後の髄鞘形成です。カスタム設計されたひずみ装置およびエラストマーマルチウェルの版を使用して、前の作品9、10は、静的な一軸株が遺伝子発現の世界的な変化によってオリゴデンドロサイトの分化を増加できることを示した10.これらの細胞における菌株 mechanotransduction のメカニズムのさらなる理解を得るためには、前の実験装置をここで説明するように再設計しなければならず、生活における核ダイナミクスの高分解能蛍光画像化を可能にする菌株の下の細胞。具体的には、1ウェルポリジメチルシロキサンプレートが開発され、100x オイル浸漬レンズを使用した生細胞の経時的なイメージングを可能にするために、撮像構成が再設計されています。光経路にポリジメチルシロキサンの負の光学的効果を排除するために、細胞は、ポリジメチルシロキサン板を通っていないが、反転位置に、細胞コンパートメントを覆うカバーガラスを介して画像化される。この新しい撮像設計を使用して、何百もの高解像度のタイムラプス動画が、無傷の付着細胞内の個々の細胞核の記録され、ここでクロマチンはヒストン H2B を緑色蛍光タンパク質にタグ付けすることによって標識される。これらの映画は、引張ひずみがオリゴデンドロサイトの分化の進行と一致するクロマチン構造およびダイナミクスの変化を誘導することを実証しています。
適用された緊張の下の生きている細胞のイメージ投射は技術的に挑戦的で、顕微鏡システムと互換性がある装置設計を要求する。ここに記載されているカスタム設計は、商用ソリューションに代わる安価な方法を提供します。その次元は適用された緊張の間に高い空間分解能で顕微鏡の段階および生きている細胞のイメージ投射で取付けを可能にする。イメージングセットアップは、画像品質を低下させ、ほとんどの場合に一般的なポリジメチルシロキサンプレートの層を通してではなく、カバーガラスを通して、最高の透明度を持つ100x オイル浸漬レンズを使用して、生細胞イメージングを容易にするように設計されています。歪みの下でイメージングのセットアップ。この装置は、細胞を含む取り付けられたプレートを用いて、インキュベーター内に容易に貯蔵することもできる。この装置は付着細胞の文化を促進し、複数の日に安定した、均一な緊張を維持する substrata に一軸の緊張を適用するように設計されている。ここに記載されたセットアップは、菌株下の様々な付着細胞型の高解像度画像化に使用することができ、それを細胞メカノバイオロジーの多くの分野での mechanotransduction 研究に適用可能にする。

<table><tbody><tr>新生児ラットから単離された<td>Primary Cells</td><td></td><td></td><td>Primary Oligodendrocyte Progenitor Cells isolated from Neonatal Rats were provided by Dr. S. Y. Chew's lab at Nanyang Technological University</td></tr><tr><td>Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM high&nbsp; glucose</td><td>Gibco</td><td>11996-065-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15070-063-100ml</td><td></td></tr><tr><td>FGF</td><td>Prospec</td><td>CYT-608-50ug</td><td></td></tr><tr><td>PDGF</td><td>Prospec</td><td>CYT-776-10ug</td><td></td></tr><tr><td>Media ストックコンポーネント</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9418-10G</td><td></td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma</td><td>P8783-1G</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma</td><td>P5780-5G</td><td></td></tr><tr><td>亜セレン酸ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>S5261-10G</td><td></td></tr><tr><td>トリヨードチロニン</td><td>Sigma</td><td>T6397-100MG</td><td></td></tr><tr><td>チロキシン</td><td>Sigma</td><td>T1775-100MG</td><td></td></tr><tr><td>ホロトランスフェリン</td><td></td><td>Sigma T0665-500MG</td><td></td></tr><tr><td>インスリン</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>モールドと PDMS プレート</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS -ダウ コーニング シルガード 184</td><td>エルスワース</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>モールド - 液体プラスチック</td><td>スムース オン</td><td>スムース キャスト 310 - トレイル サイズ</td><td></td></tr><tr><td>基板 コーティング</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリ D-リジン</td><td>シグマ</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>シグマ</td><td>F1141-2MG</td><td></td></tr><<tr><td>ストロング>ヒストン染色</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellLigt H2B-GFP BacMam</td><td>分子プローブ</td><td>C10594</td><td></td></tr><tr><td>Surface functionalization</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma</td><td>A3648-100ml</td><td></td></tr><tr><td>BS3</td><td>Covachem</td><td>13306-100mg</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 緩衝液 pH 8.0</td><td>Alfa Aesar</td><td>J63578-AK-250ml</td><td></td></tr><tr><td>細胞剥離</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アキュターゼ</td><td>Invitrogen</td><td>A1110501-100ml</td><td></td></tr></tbody></table>

一軸引張ひずみ下での生細胞における核動態の高分解能イメージング

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

細胞外機械的株は、セルの表現型応答を惹起することが知られており、いくつかの組織系において生理学的関連性を有する。生化学的アッセイによって細胞集団に適用された細胞外引張株の効果を捕捉するために、デバイスは、単に作製することができ、組織培養インキュベーター内だけでなく、内部に収まるほど小さいものであることがあらかじめ設計されている顕微鏡の段階。しかし、ポリジメチルシロキサン基層の以前の設計では、油浸目的で高分解能の細胞内イメージングを行うことはできませんでした。本研究では、ポリジメチルシロキサン基層の再設計された幾何学的形状と、適用した菌株下での生細胞の高解像度の細胞内イメージングを容易にするカスタマイズ画像設定について説明する。この基層は、同じ、以前に設計されたデバイスで使用することができ、したがって、高解像度の光学イメージングを可能にすることに加えて、上記と同じ利点を有します。ポリジメチルシロキサン基層の設計は、ひずみの適用の前後に同じセルを追跡することを容易にするグリッドを組み込むことによって改善することができます。代表的な結果は、ここで説明した方法を用いて捕捉された、歪んだ細胞内での蛍光標識核の高解像度タイムラプス撮影を示している。これらの核力学データは、オリゴデンドロサイト前駆細胞の分化を促進する引張ひずみを適用するメカニズムについての洞察を与えます。

オリゴデンドロサイト10に対する引張歪の影響を調査することを目的とした最近の研究では、10% の一軸引張株が、遺伝子発現の世界的変化によってオリゴデンドロサイト前駆細胞の分化を促進することを示した。遺伝子発現におけるこれらの変化の背後にあるメカニズムは、細胞骨格構造、転写因子局在、核力学およびクロマチン組織などの細胞内パラメータの画像化を介してプローブすることができる。しかし、ポリジメチルシロキサン基層の以前の形状では、高分解能の単一細胞イメージングができませんでした。この作業で説明したように、ポリジメチルシロキサン基層の再設計されたジオメトリとイメージングセットアップは、セルと目的の間の距離を最小化しました。これにより、100x オイル浸漬の目的を使用して、蛍光標識された細胞核のタイムラプス画像をキャプチャすることができます (図 6a)。
核...

このペーパーでは、以前に設計したデバイスを使用して接着細胞に機械的ひずみを適用し、再設計された基層ジオメトリと、100x オイル浸漬の目的で歪んだセルを高解像度の単一細胞イメージング用にカスタマイズした装置について説明します。

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...

我々は以前に付着細胞に機械的なひずみを適用する装置を設計した。現在の作業では、下層部の形状を再設計し、これらの歪みセルの高解像度イメージング用の設定をカスタマイズしました。この細胞伸張システムの主な利点は、100xの株細胞での高解像度の細胞下イメージングを提供することです。私の研究室の研究アシスタントであるヴィッキーは、皮下製作のデモンストレーションを行います。付属のテキストプロトコルに従って、単一ウェルポリジメチルシロキサン型を設計することで始めます。次に、ポリジメチルシロキサンベースの20部を、使い捨てカップに1部硬化剤と混合します。混合したら、ポリジメチルシロキサンミックスを0.8バールの真空脱ガッサーに30分間置き、混合物から気泡を取り除きます。次に、ポリジメチルシロキサンミックスをカビと皿に注ぎます。この段階で、0.8バー真空で30分間再びガスを脱ガスすることによって、追加の気泡を取り除きます。脱ガスが完了したら、レベリングテーブルで80°Cでサンプルを2時間焼きます。次に、慎重にオーブンからサンプルを取り出し、室温まで冷却させます。刃で縁を切り、硬化したポリジメチルシロキサンを静かに剥がします。直径150ミリメートルのポリジメチルシロキサンに、マーカーを持つ2センチメートルのグリッドを2センチメートル引きます。各正方形内では、1センチメートル×1センチメートルの正方形を描き、すべての側面に0.5センチメートルのマージンを残します。ブレードを使用してラインに沿って慎重に切断し、正方形のコンパートメントを取得します。次に、サンプルを100%アセトンで4時間、100%エタノールでさらに4時間インキュベートし、次に4時間オートクレーブ水で洗浄します。洗浄したサンプルをパラフィンフィルムバッキングペーパーの直径150ミリメートルのプラスチック皿の中に入れ、サンプルを80°Cのオーブンで4時間乾燥させます。完成したら、パラフィンフィルムで封じ、さらに使用するまで冷たい部屋に保管してください。前駆細胞を調製し、増殖培地でそれらを中断します。これらの細胞をPDLコーティングされたプラスチック表面に1平方センチメートルあたり35,000個の細胞の密度で播種します。拡散媒体の体積を表面積の10センチメートル平方メートルあたり3ミリリットルに調整します。メディアの量が少なくなると、表面張力に起因する細胞の凝集につながる可能性がありますが、皿の中のメディアの量が多いとメディアがこぼれる可能性があります。播種後3日目に、細胞を収穫し、ヘモサイトメーターを使用して数えます。次いで、700マイクロリットルの増殖培地を有するポリジメチルシロキサンプレート当たり35,000個の細胞をシードする。次に、メーカーの指示に従って、細胞のヒストンH2B複合体を緑色蛍光タンパク質で標識するためのプラスミックコンストラクトを追加します。24時間後、ポリジメチルシロキサンサンプルを、単軸歪み装置上に伸ばされる細胞と一緒に取り付ける。次に、すべてのサンプル中の培地を分化培地に変更します。不訓練セルコンパートメントの長さを測定し、ステージマイクロメータのネジを回して、所望の歪み量だけセルコンパートメントの長さを増やします。伸ばした伸ばした伸ばしていないポリジメチルシロキサンサンプルを、イメージングまで37°Cのインキュベーターに残します。インキュベーター温度を摂氏37度に設定して、ライブイメージング用の顕微鏡インキュベーターを準備します。次に、目標ターンイットは後でアクセスできなくなるので、100x油浸漬目標を中央の位置に持ち込みます。位置に入ったら、目的を緩めて、客観的なリングと一緒にねじ込んで、目的を細胞に近づけることができます。その後、目的に油を一滴追加します。カスタムプリントホルダーを使用して、窓の周囲に真空グリースでホルダーをコーティングし、ホルダーの上面に厚さ0のガラスカバースリップを置きます。プラスチック製の窓を顕微鏡のステージにテープで貼ります。次に、Z変換ステージを顕微鏡ステージにねじ込み、最上のZ位置に移動します。画像化する伸ばしたポリジメチルシロキサンプレートから培地の500マイクロリットルを取り除き、白いプラスチック窓のガラスカバースリップにこの培地を加えます。次に、滅菌用ピンセットを使用して、ポリジメチルシロキサンプレートから正方形のコンパートメントを慎重に取り外します。細胞が白いプラスチック窓の上に向くように歪み装置を直立した位置に保持し、慎重に歪み装置を反転させて、余分な媒体がガラスカバースリップの真ん中に直接落とすようにして、細胞を下に向けます。歪み装置の底部を、両面テープを使用してZ変換段階に置き、所定の位置に保持します。明るいフィールドの下で接眼レンズを見ながら、非常にゆっくりと歪み装置を下に持って来て、細胞に焦点を合わせるために目標を上に移動します。Z変換段階の低下と目標の引き上げの間で交互に、この焦点合わせステップをゆっくりと実行します。Z変換段階が低下しすぎると、細胞が圧縮され、死ぬ可能性があります。目標を高くしすぎると、ガラスのカバースリップが壊れ、媒体が漏れる可能性があります。XおよびY方向のポリジメチルシロキサンプレートをスキャンして、488ナノメートルの励起でエピフロリセンスを使用して、蛍光核を有する細胞を見つける。また、明視野下のサンプルを見るとき、細胞が適切な形態を持っていることを確認してください。488ナノメートルの波長励起を有する核の広視野または開いたピンホール画像を、フレームあたり30秒間隔で、少なくとも30分間の明視野励起を有する細胞の画像を記録する。ポリジメチルシロキサンのサブストラタムの再設計された幾何学と、このビデオに示すイメージング設定は、細胞と目的との間の距離を最小限に抑えます。これにより、100x油浸出目的を用いて蛍光標識された細胞核のタイムラプスイメージングが可能になります。核変動を測定するには、まず核面積対時間をプロットする。次に、3 次多項式を使用してデータのトレンドを解除します。最後に、残差変動をプロットし、残差変動の標準偏差を計算します。オリゴデンドロシテ前駆細胞の核変動は、10%引張歪みの有無にかかわらず分化の化学的誘導に続いて、化学的誘導単独で、核変動の振幅が48時間で有意な減少を示したが、24時間では示さなかったことを示している。一方、10%引張歪みと共に化学誘導は24時間で有意な減少を示し、48時間で更に減少することなく一定の状態を保った。覚えておくべき最も重要なことは、選択された目的の作業距離は、セルコンパートメントの深さとカバースリップの厚さを加えたもの以上でなければならないということです。データセットの前後のタイプは実験エラーからのノイズを低減するので、このサブストラタムはグリッドを組み込んで、歪みの適用前後に同じセルをイメージングしやすくするように再設計することができます。このイメージング設定を用いて、接着生細胞内の多くの細胞内現象、例えばタンパク質の局在化または細胞成分のダイナミクスなど、機械的歪みを適用した数秒以内に画像化することができる。

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