イメージング インテグリン張力と細胞の力でサブミクロン解像度統合テンション センサーで
2019年4月25日
インテグリンの緊張は、様々 な細胞機能に重要な役割を果たしています。統合テンション センサーとインテグリンの緊張はピコニュートン (pN) 感度を校正、サブミクロンの分解能でイメージします。
このDNAベースの統合張力センサ(ITS)は、力信号を蛍光に局所的に変換することで、蛍光顕微鏡による細胞力の直接イメージングを可能にする。ITSは高い空間分解能と高感度を有する。活性化閾値は調整可能であり、異なるレベルでのインテグリン張力の選択的なイメージを可能にする。
カスタマイズされた一本鎖DNA(ssDNA)を受け取って、RGDペプチドをチオラ化ssDNAクエンチャーに結合させた後、まず、400マイクロリットルの水で0.5モルEDTAの100マイクロリットルを、作製したTCEP溶液の約450マイクロリットルに加えます。次に、TCEP-EDTA溶液の10マイクロリットルをPBSの1ミリモルチオールDNAクエンチャーの20マイクロリットルに加え、室温で30分間インキュベーションします。RGDアミンをスルフォ-SMCCと結合するには、調製した23ミリモルスルフォ-SMCCを40マイクロリットル加え、100マイクロリットルの新鮮な11ミリモルRGDアミン溶液を室温で20分間インキュベーションします。
RGDアミンSMCCをチオラ化ssDNAクエンチャーと共役にするには、チオラ化されたssDNAクエンチャー溶液の全容をRGDアミンSMCC溶液の全容と混合し、室温で1時間のインキュベーションを行います。インキュベーションの終了時に、溶液を一晩で摂氏4度の貯蔵に移します。翌朝、塩化3モルの塩化ナトリウムとチオール共役DNA溶液とマイナス20度の摂氏を混ぜ、冷やし、100%エタノールを1対10~25比で混合し、反応をマイナス20度で約30分間置きます。
DNAが沈殿したら、遠心分離によってDNAを採取し、PBS中のペレットを再懸濁して分光器上のDNA濃度を測定する。統合張力センサー(ITS)の場合、合成は、上鎖と下の鎖DNA溶液を1.1モル比で混合し、反応を摂氏4度で一晩インキュベートしてから、混合物のアリコートをマイナス20°Cで長期保存します。ITS固定化のために、直径29ミリメートルのガラス底ペトリ皿に0.1ミリリットル当たり0.1ミリグラムのビチニ酸シウ血清アルブミン(BSAビオチン)を摂氏4度で30分間コーティングします。
BSAビオチンがガラス表面に物理的に吸着した場合、洗浄ごとに200マイクロリットルの新鮮なPBSで皿を3回洗い、続いて4度で30分間、1ミリリットル当たり50マイクログラムの200マイクロリットルをインキュベートします。インキュベーションの最後に、示されているようにPBSで皿を3回洗い、0.1マイクロモルITSの200マイクロリットルを加えて、摂氏4度でさらに30分のインキュベーションを行います。インキュベーションの終わりに、PBSで皿を3回洗い、最後の洗浄を細胞メッキするまで皿に残します。
魚の角質細胞培養を開始するには、平らな先端のツイーザーを使用して魚からスケールを摘み取り、スケールの内側がガラスに接触して、変更されていないガラス底のペトリ皿の井戸にスケールを軽く押し込みます。魚のスケールが皿のガラス表面に付着するまで約30秒待ってから、完全なIscoveの修正されたダルベッコの媒体の1ミリメートルでスケールをカバーします。その後、暗くて湿度の高い箱の中で、室温で6〜48時間スケールをインキュベートします。
角質細胞をITS表面にプレートするには、ケサイトー細胞培養皿の培地を1X細胞剥離溶液に置き換え、室温で3分間インキュベーションします。インキュベーションの最後に、剥離溶液を新鮮な完全な媒体に置き換え、穏やかなピペットで細胞を解離します。次に、細胞をめっきに適した濃度に調整し、イメージング前に室温でITSコーティング皿に30分間播種します。
生細胞での準リアルタイムインテグリンテンテグリン張力イメージングの場合、細胞を蛍光顕微鏡の段階に移し、目的の40倍または100倍を選択します。イメージングソフトウェアでは、露出時間を1秒に、フレーム間隔を20秒に設定して、ITS画像の映像を取得します。次に、適切な画像解析ソフトウェアプログラムを使用して、ITSビデオの前のフレームを現在のフレームから減算し、最新のフレーム間隔で新たに生成されたITS信号を計算します。
新たに生成されたITS信号は、最新のフレーム間隔で発生したインテグリンテンションを表し、それによって細胞力を準リアルタイムで報告する。ここで、インテグリン張力マッピングは、角膜細胞移動中の2つの力の線路におけるインテグリン張力の誘導を示す。フォースマップの解像度は、0.4マイクロメートルに較正することができます。
高いインテグリン張力は、モチル魚の角質細胞の後部マージンに集中する。非可動細胞では、高速移動角膜細胞で観察されるのとは全く異なる特定のインテグリンテンステンションパターンが形成される。魚の角質細胞の焦点接着とインテグリン張力を共像化して、対象細胞におけるインテグリン張力と細胞構造との関係を評価することができる。
ITSでは、細胞接着力は、細胞構造イメージングに匹敵する分解能と感度で見えるようになります。この技術は、細胞における力構造相互作用の研究のための道を開きます。
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概要
本記事では、高い空間分解能と感度で細胞力を直接イメージングすることを可能にする、DNAベースの統合的張力センサー（ITS）の開発について解説します。このセンサーは、picoNewtonレベルの感度でインテグリンの張力を校正することが可能であり、研究者がさまざまな細胞機能を研究することを可能にします。
研究の主要構成要素
科学分野
- 細胞生物学
- 生物物理学
- 蛍光顕微鏡法
背景
- インテグリンは細胞機能において重要な役割を果たしています。
- インテグリンの張力を理解することは、細胞挙動の研究において重要です。
- 既存の手法では、詳細な解析に必要な感度や分解能が不足している可能性があります。
- ITSは、インテグリンの張力を正確に測定するための新しいアプローチを提供します。
研究目的
- インテグリンの張力を高感度で測定できるセンサーを開発すること。
- 細胞力のリアルタイムイメージングを可能にすること。
- さまざまな細胞プロセスにおけるインテグリンの役割を研究するためのツールを研究者に提供すること。
使用された手法
- RGDペプチドのチオール化ssDNAクエンチャーへの結合。
- センサー活性化のためのTCEP-EDTA溶液の調製。
- チオールDNAクエンチャーとTCEP-EDTAのインキュベーション。
- センサー機能付与のためのRGDアミンとsulfo-SMCCの結合。
主な結果
- ITSはイメージングにおいて高い空間分解能を示しました。
- インテグリン張力の測定において、ピコニュートン（picoNewton）レベルの感度を達成しました。
- このセンサーの活性化閾値は調整可能です。
- 細胞力の直接的なイメージングに成功しました。
結論
- ITSはインテグリンの張力を研究するための有用なツールです。
- これにより、細胞生物学および生物物理学の研究における新たな道が開かれます。
- 今後の研究では、この技術を活用して細胞力学を探索することが可能です。
よくある質問
産業界における重要性
サブミクロン解像度でインテグリン介在性の細胞力を直接可視化することで、分子張力と表現型の結果を関連付け、ターゲットバリデーションにおけるメカニズム的なリスク低減が可能になります。この機能は、線維症、血栓症、およびがん転移に関連するメカノトランスダクション経路を定量化することで、初期探索における予測精度を向上させます。調整可能な力感度（10–60 pN）は、生理的なインテグリン張力の範囲と一致しており、メカノセンシティブなターゲットスクリーニングのためのアッセイ開発を促進します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 細胞の遊走および接着時におけるインテグリン張力のダイナミクスを可視化することにより、治療仮説を検証する。
- 運用上の価値： 生細胞および固定細胞における力と構造の相関を通じて、パスウェイの明確化を可能にする。
- 予測的価値： 病的なインテグリンシグナルを調節する化合物を特定し、ポートフォリオの優先順位付けを支援する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- アッセイの準備：ITSコート基質を用いて、ダウンストリームスクリーニング用のバリデート済み生物学的システムを調製します。
- 定量的出力：蛍光ベースの張力測定値を生成し、化合物の効果の比較を可能にします。
- スクリーニングの関連性：血小板収縮および細胞遊走モデルにおけるメカノセンシティブな標的の同定を支援します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患との関連性：血小板の収縮およびケラトサイトの遊走研究を通じて、血栓症および創傷治癒モデルに適用されます。
- トランスレーショナルな連続性：焦点接着における力と構造の相互作用を可視化することで、基礎研究から前臨床検証への橋渡しを行います。
- リスク調整後の意思決定：インテグリンの張力と細胞表現型の間のメカニズム的な関連性を明らかにすることで、研究の推進に関する判断に寄与します。
パイプラインおよびワークフローの統合
ITSは、標的仮説の検証からリード化合物の同定、そして前臨床段階でのメカニズム検証に至る創薬の連続的なプロセスに適合しており、特にメカノトランスダクション経路における標的に対して有用です。
- 探索生物学： 細胞移動などの細胞挙動におけるインテグリンの張力パターンのマッピングにより、仮説検証をサポートします。
- スクリーニング： インテグリン活性化の再現性のある蛍光読み取りにより、アッセイの標準化を可能にします。
- 分析： 定量的な張力測定（pN範囲）を提供し、化合物または遺伝的摂動の比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： 焦点接着と張力パターンの構造的な共イメージングを通じて、前臨床研究へと繋げます。
- エンタープライズ再利用： 複数の疾患領域におけるメカノセンシティブな標的バリデーションのための、再利用可能なプラットフォームとして機能します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： インテグリン-リガンド結合における力伝達を直接可視化することで、メカニズム的な曖昧さを軽減します。
- 運用上の価値： 調整可能な活性化閾値とサブミクロンイメージングにより、標準化と再現性を確保します。
- 戦略的価値： メカノトランスダクションにおける役割が不明確なターゲットのリスクを排除することで、go/no-go判断を改善します。
- ポートフォリオへの影響： 力伝達経路の検証データに基づいた、リスク調整後のターゲット優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- DNAコンジュゲーション、蛍光顕微鏡観察、および細胞培養技術の専門知識が必要です。
- TCEP-EDTAの調製、sulfo-SMCCコンジュゲーション、およびガラス基板上へのITS固定化のための装置が必要です。
- 一貫したITSコーティングおよび細胞播種手順を実現するため、チーム間での標準化が求められます。
- 異なる細胞種（例：角膜細胞、血小板）や基板の機能化に対する適応上の検討事項が含まれます。
- 実験モデルごとのRGDペプチドコンジュゲーションの最適化および張力校正の必要性による制約があります。
