Bioprinter で設計されたバイオフィルムの三次元パターン化

細菌による3Dバイオプリンティングは、新たに開発された技術です。このプロトコルは、細菌と印刷された3Dの設計されたバイオフィルムを構築する簡単な方法を提供します。この技術の主な利点は、安価な家庭用3Dプリンタを使用して3Dプリントバイオフィルムを製造できることです。

当社の3Dプリンタの応用の1つは、新しい抗菌療法の開発に使用できる再現可能なモデルバイオフィルムを作成することです。当社の3Dプリンティングアプローチは、アルギン酸ベースのバイオインクと互換性のあるあらゆる種類の細菌に適用できます。バイオインクと印刷基板の調製は、3D印刷プロセス、特にZ軸のキャリブレーションは、いくつかの練習を必要とする重要なステップである一方で、かなり標準的な手順です。

設定されたアクセス高さのキャリブレーションは、当社の3Dプリンタの解像度に影響を与え、個人的な経験に強く依存します。この手順では手動で調整する必要があり、書き込み形式で記述することは困難です。200マイクロリットルのピペットチップをシリコンチューブの長さに接続し、元の押出機の代わりにピペットチップを3Dプリンタの押出機ヘッドに取り付けます。

次に、5つのモル塩化カルシウム溶液の4ミリリットルをルリア・ベルタニのスープに溶解した1%寒天の400ミリリットルに加え、適切な抗生物質および誘導剤で補う。次いで、LB寒天溶液の20ミリリットルを各150ミリメートル、15ミリメートルペトリ皿に分配する。蓋を半分開けた状態で、皿を室温で30分間乾燥させます。

3%のアルギン酸ナトリウム溶液を調製し、沸点に3回加熱して溶液を殺菌する。その後、滅菌溶液を摂氏4度で使用するまで保存します。バイオインクの細菌成分を調製するために、抗生物質を含むLB培地の50ミリリットルで構成的なGFP発現のためのプラスミドを運ぶ大腸菌を増殖させる。

一晩で250 RPMと摂氏37度で文化を振ります。培養の一晩の成長の後、3、220倍の重力で5分間細菌をペレットし、その後上清を除去する。10ミリリットルのLB培地で細菌ペレットを再懸濁し、3%アルギン酸ナトリウムの10ミリリットルを加える。

3D プリンターをコンピューターに接続し、3D 印刷ソフトウェアを開きます。X、Y、Z 軸の [ホーム] ボタンをクリックして、プリント ヘッドをホーム位置に移動します。各印刷物について、準備した印刷基板をプリントベッドの特定の場所に置きます。

手動制御の下で22ミリメートル以上の高さにプリントヘッドを上げ、動きの間にペトリ皿の端と衝突しないようにします。プリントヘッドをプレートの上部に置き、ピペットチップが印刷面に接触するまで下に移動します。この Z 軸の位置を、印刷サーフェスの高さの Z1 として割り当てます。

次に、プリントヘッドを上げ、手動でプレート領域の外側に移動します。印刷ヘッドと版表面の間の作業距離が Z2 と定義されている場合は、印刷時に印刷サーフェイスの高さと作業距離を入力して、印刷プログラムに Z 値を設定します。必要な形状を印刷するためのコマンドを含む、事前にプログラムされた G コード ファイルを読み込みます。

各コマンド ラインで、印刷ヘッドの位置は X、Y、Z 軸で変更できます。印刷面の高さと作業距離を加えた高さとして、すべての印刷手順で Z 値を入力してください。液体バイオインクを注射器にロードし、3Dバイオプリンターの注射器ポンプに取り付けます。

次に、押し出し速度を1時間あたり0.3ミリリットルに設定します。印刷ボタンをクリックして、印刷基板にバイオインクを印刷します。印刷が開始されてから印刷ヘッドが印刷面に接触するまで、シリンジポンプを開始するのを待ちます。

印刷中に、ソフトウェアで印刷ヘッドの動きを完全に制御します。印刷ヘッドが印刷の最後のポイントに到着するとすぐにシリンジポンプを停止し、それ以外の場合は、余分なバイオインが印刷基板にドロップし、印刷解像度を低下させます。3D構造の構築のために、印刷ヘッドのすべての動きは、Gコードエディタで制御されます。

2 番目のレイヤーの印刷高さを大きくするには、1 番目のレイヤーの印刷高さを入力し、コードの Z 値を 0.2 ミリメートル大きくします。その後、Z値を0.1ミリメートル増加させ、より高い層に移動する場合。印刷したサンプルを室温で3~6日間インキュベートし、Curli繊維などのバイオフィルム成分を製造できるようにします。

次に、プレートを蛍光スキャナーに置き、プレートをイメージします。アルギン酸マトリックスを溶解するには、pH7で0.5モルクエン酸ナトリウム溶液20ミリリットルを、印刷された基板に加える。30rpmで振りながら、室温でプレートを2時間インキュベートします。

次いで、再度プレートをイメージして液体を捨てて、クエン酸処理前後のプレートの画像と比較する。3Dバイオプリンターは、ヒドロゲルを様々な2次元および3次元形状にカプセル化する細菌を作り出すことができる。これらの印刷された形状は、バイオフィルムの形成が成功したかどうか、またはアルギン酸マトリックスがクエン酸ナトリウム溶液を使用して完全に溶解しているかどうかを評価するために使用することができます。

誘導性のカリ生産プラスミドを含まないビオインクの場合、クエン酸ナトリウム処理後に印刷パターンを完全に溶解させ、バイオフィルムCurliネットワークが形成されていなかったことを示す。誘導性のカール生産プラスミドを含む細菌は、クエン酸ナトリウム処理後に溶解せず、印刷された細菌が、印刷された細菌のパターンを安定化するのに十分な広範なCurliネットワークを形成できたことを示している。多層構造を構築するために、G コード エディターを制御することによって追加のレイヤーを印刷できます。

サンプルの印刷レイヤー数を増やすと、印刷された構造体の幅と高さが徐々に増加しました。多層構造に印刷されたCurliタンパク質を生産するように設計された大腸菌では、クエン酸ナトリウム処理ではサンプルが溶解せず、非Curli産生大腸菌を含む多層構造が溶解した。3D印刷手順の最も重要な部分は、Z軸のキャリブレーション、および印刷を開始してシリンジポンプを開始する調整です。

このプロセスのために開発されたバイオインクはかなり柔らかく、靭性が低い。機械安定性を提供し、改善するために、バイオインクにさらなる変更を加えることができる。この3Dプリンティング技術は、バイオフィルムの製造を可能にし、バイオミメティック材料の製造を可能にする優れた機械的特性を有する。

これらの細菌を扱う場合は、手袋などの適切な保護を着用してください。