Name: 非還元 SDS − PAGE 分析と化学的架橋を組み合わせて、培養中の哺乳動物細胞におけるジスルフィド結合によって安定化された多量体複合体を検出する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: 学ぶ、非還元SDS-PAGEと化学的架橋を組み合わせた手法で、培養中の哺乳動物細胞におけるジスルフィド結合によって安定化された多量体複合体を検出する方法です。U-2 OS細胞を用いた迅速かつ低コストなタンパク質解析技術を解説します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

私たちは、dUTPase ポリクローナル抗体の精製について、ジェニファー・フィッシャー博士が出した努力と、この原稿を編集するためのすべての努力をケリー Ciccaglione に感謝します。この研究は、部分的にニュージャージー健康財団 (グラント #PC 11-18) からの助成金によって支えられました。

1. ヨードアセトアミドを使用して遊離システイン残基を遮断
<ol><li>6 cm2ディッシュの u-2 OS セルを 50% ~ 60% のコンフルエントで、10% のウシ胎児血清と 1% のピルビン酸ナトリウムを 5% co2 で37° c で含有する高グルコースを用いて成長させます。</li>
	<li>使用する直前に 10 mM ヨードアセトアミドの新鮮なストックを作り、未使用の試薬を廃棄します。</li>
	<li>0.1 mM 最終濃度ヨードアセトアミドを細胞培養培地に直接添加する。ゆっくりと室温で2分間皿をロックします。</li>
</ol>2. 細胞の採取
<ol><li>セルからメディアを吸引します。</li>
	<li>5 mL の冷燐酸緩衝生理食塩水 (PBS) で細胞を3回洗浄する。最後の PBS 洗浄溶液を吸引し、冷 PBS の1Ml を追加します。</li>
	<li>セルスクレーパーを使用して、皿の底から細胞をこすります。1つの mL のピペットを使用して PBS および細胞の懸濁液を引き、1.5 mL マイクロ遠心管にすべての液体を分配する。</li>
	<li>4° c で3分間 7500 x gで細胞を回転させる。PBS を吸引し、細胞ペレットを後に残します。細胞のペレットは処理まで-80 ° c で貯えることができる</li>
</ol>3. タンパク質の抽出
<ol><li>DdH2O (材料の表を参照) で希釈した1x 溶解バッファーの100μ l を準備します。使用直前に phenylmethylsulfonyl フッ化物 (PMSF) を 1 mM 最終濃度に添加する。</li>
	<li>1x 溶解バッファーの50μ l をセルペレットに直接追加し、サスペンドします。氷上で5分間インキュベートします。</li>
	<li>超音波処理は、定数パルスモードを 40% で使用して8秒間 (sonicator の材料の表を参照; 異なる sonicators に必要に応じて調整します)、抽出を氷上に保ちます。</li>
	<li>抽出物を4° c で5分間 16000 x gで回転させる。上清は可溶性タンパク質画分である。ブラッドフォード分析は、必要に応じてタンパク質濃度を決定するために行うことができます。</li>
</ol>4. サンプル調製
<ol><li>10μ l の可溶性タンパク質抽出物をとり、1x Laemmli SDS-サンプルバッファー (4% SDS、20% グリセロール、0.004% ブロモフェノールブルー、および 0.125 M トリス-HCl、pH 6.8) の10μ l を加えます。還元試薬を添加しないでください。</li>
	<li>SDS ページ分析をその日に実行する場合は、ice のサンプルを保持します。長期保存の場合は、-20 ° c が適しています。ゲルを実行する前に、サンプルを85° c で5分間加熱します。</li>
</ol>5. 生体内ホルムアルデヒドは、U-2 OS 細胞における内因性タンパク質の架橋
<ol><li>175 cm2フラスコ内の u-2 OS セルを 70% ~ 80% コンフルエントに成長させます (セクション1を参照)。</li>
	<li>
ホルムアルデヒド架橋反応を行う
	<ol>
<li>発煙のフードでは、アリコートは商業源から購入した 37% のホルムアルデヒドの解決を提供する。ホルムアルデヒド固定液を培地に直接 1% の最終濃度に添加し、穏やかな攪拌で15分間室温でインキュベートします。</li>
		<li>反応をクエンチするために、0.125 M の最終濃度に 1.25 M グリシンを追加し、5分間ロッカーの穏やかな攪拌で室温でインキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>5 mL のコールド PBS で細胞を3回洗浄する。最終的な PBS 洗浄溶液を吸引し、PBS の10ml を追加します。セルスクレーパーを使用して、フラスコの底部から細胞を削ります。</li>
	<li>10の mL のピペットを使用して、PBS および細胞の懸濁液を引き、15の mL の円錐形の遠心管に液体のすべてを分配する。4° c で2分間 500 x gで細胞を回す。PBS を吸引し、細胞ペレットを後に残します。</li>
</ol>6. 原子核の分別
<ol><li>10 mL の均質化バッファーを準備します: 0.25 M ショ糖、1 mM EDTA、10 mM HEPES、pH 7.4 で 0.5% BSA。使用直前に PMSF を加えて、1 mM の最終濃度にし、核懸濁液バッファーの 3mL (0.1% のトリトン X-100 PBS 中) にします。</li>
	<li>5 mL の均質化バッファーを細胞ペレットに直接追加し、完全にサスペンドします。懸濁液を4° c で2分間 500 x gで遠心し、上清を捨てる。</li>
	<li>ペレットを 5 mL の均質化バッファーに懸濁させる。堅いガラステフロンのホモジナイザーを使用して、dounce は10の打撃/500 の rpm で細胞を均質にする。</li>
	<li>懸濁液を4° c で10分間 1500 x gで遠心し、その上清を廃棄する。 注:10分間 1万 x gで centrifuging することによってミトコンドリアの単離のため上清を使用してください。</li>
	<li>ペレットを 1 mL の核懸濁液のバッファーに懸濁し、氷上で10分間インキュベートします。</li>
	<li>10分間 600 x gで遠心上清を捨てる。</li>
	<li>ペレットを 1 mL の核懸濁液バッファーに懸濁し、再度遠心分離する。上清を破棄します。最終的なペレットは、孤立した核となります。</li>
</ol>7. タンパク質の抽出
<ol><li>セクション4を繰り返し、その後懸濁させる1x 溶解緩衝液の25μ l を細胞ペレットに直接加えることを除いて。</li>
</ol>8. サンプル調製
<ol><li>可溶性タンパク質抽出物を10μ l ずつ採取し、10μ l の 2x Laemmli SDS-サンプルバッファーと1μ l の 2-メルカプトエタノール (BME) を加えることによって、SDS-PAGE のサンプルを2つ用意します。</li>
	<li>1つのサンプルを37° c で5分間加熱し、98° c で15分間2回目のサンプルを使用して、ホルムアルデヒド相互リンクを逆転させる。</li>
</ol>9. SDS-ページ分析
<ol><li>1 L の1x トリス-グリシンランニングバッファ (25 mM トリス、192 mM グリシン、0.1%(w/v) SDS) を準備します。</li>
	<li>
SDS-ページ実行装置をセットアップします。 注:このプロトコルは 16% プレキャスト TGX SDS ページを使用します。注として、任意の割合のゲルを使用することができます。<ol>
<li>メーカーのプロトコルごとに、ゲルが格納されているパッケージを開き、カセットを取り外します。</li>
		<li>ウェルを裏打ちしている櫛とカセットの底面からテープを取り外します。</li>
		<li>実行中の装置にジェルを入れます。</li>
		<li>ウェルが液体に浸漬されるまで、1x 実行バッファをチャンバに充填します。プラスチック製の pipet を使用して、実行中のバッファでウェルをすすぎます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ゲルのサンプルを10μ l のスタンダードバリュー標準マーカーと共にロードしてください。</li>
	<li>染料の前面がゲルの底部から約1cm になるまで 200 V でゲルを走らせる。</li>
</ol>10. ウェスタンブロット
<ol><li>1 L の1x 転写バッファー (25 mM トリス、192 mM グリシン、20% メタノール) を用意し、使用まで4° c で保管してください。</li>
	<li>慎重にゲルを取り出し、カセットを開けます。かみそりを使用して、積み重ねのゲルを注意深く切り、捨てる。1つのコーナーを使用してゲルをピックアップし、転送バッファとトレイにそれを配置し、5分間穏やかにロックすることができます。</li>
	<li>ゲルが揺れている間、(-20 ° c に保存されている) 氷ブロックを移送タンクに入れ、3/4 に完全に移動バッファを追加します。</li>
	<li>100% メタノールに30秒間浸してフッ化物ビニリデン (PVDF) 膜を湿らせる。</li>
	<li>5分が経過したら、転送バッファ付きトレイに転送を設定するための準備をします。移送バッファは、ブロットを完全に水没させるのに十分なものでなければなりません。ブロット転写を次のように設定します: 下部、カセットホルダーの底面 (黒)。その後、厚いスポンジ、余分な厚吸い取り紙、ポリアクリルアミドゲル、PVDF 膜、余分な厚吸い取り紙、厚いスポンジ。最後にカセットホルダーの上部 (白) を上にします。</li>
	<li>カセットをロックし、この装置を転写槽に入れ、PVDF メンブレンを正の陽極に向かって、ゲルを負の方向に向けます。転送バッファーが完全に水没するまで、転送バッファを使用してユニットの上面をオフにします。</li>
	<li>攪拌プレートの上にユニットを置きます。単位に撹拌棒を加え、125の rpm で撹拌を始めなさい。</li>
	<li>60 min で 100 V で実行してください。</li>
	<li>転写が実行されている間、トゥイーン-20、pH 7.5 (TBST) で、トリス緩衝生理食塩水に溶解した 5% の粉ミルクの溶液を準備します。</li>
	<li>ユニットを解体し、どの側がゲルと接触していたかを指摘して、膜を除去します。残りの手順については、この側面がトレイに留まるようにしてください。</li>
	<li>トリス緩衝生理食塩水 (TBS) に2分間浸漬した後、5 mL の乳 TBST 溶液を5ml で室温にて30分間インキュベートすることによって膜を遮断する。</li>
	<li>牛乳を 5% ミルク TBST 溶液の新鮮な 4 mL に交換し、適切な希釈で一次抗体を加え (この場合、私たちの希釈は dUTPase 抗体に対して 1: 2000)、4° c で穏やかにロッキングして一晩インキュベートします。</li>
	<li>翌日、4° c ロッカーから室温ロッカーにブロットを除去し、一次抗体溶液を廃棄する。</li>
	<li>ブロットを完全に水没させるのに十分な液体を使用し、3回の洗浄、それぞれ5分間の TBST でゆっくりとロッキングします。</li>
	<li>最後の洗浄に続いて、5% のミルク TBST 溶液の 5 mL を加え、その後、その後、廃棄する15分間ブロットをロックします。</li>
	<li>所望の濃度で 5% 乳 TBST で希釈した二次抗体を添加する。(この場合、1: 5000 ヤギ抗ウサギの希釈 5% ミルク-TBST 溶液)</li>
	<li>室温でインキュベートし、1時間揺動した後、溶液を廃棄します。</li>
	<li>TBST で3回のクイックウォッシュを行い、続いて3つの洗浄、5分ずつ、ゆっくりとロッキングし、最後の洗浄を破棄して、5 mL の TBS を加えます。</li>
	<li>ECL 化学発光検出液 (2 mL の最終容量に対して各試薬 1 mL) の1:1 混合物を調製し、これを1分間のブロットに直接添加します。</li>
	<li>ピンセットで膜を取り出し、研究室拭きで角を軽くし、余分な溶液を取り除きます。膜をシュリンクラップで置き、タンパク質側を x 線カセットに入れます。</li>
	<li>膜を x 線フィルムにさらす。露光の時間は異なります。</li>
</ol>

<ol><li>Klomsiri, C., Karplus, P. A., Poole, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine-based+redox+switches+in+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Cysteine-based redox switches in enzymes.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1065-1077 (2011).</li>
<li>Antelmann, H., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-based+redox+switches+and+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Thiol-based redox switches and gene regulation.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1049-1063 (2011).</li>
<li>Brandes, N., Schmitt, S., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-based+redox+switches+in+eukaryotic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Thiol-based redox switches in eukaryotic proteins.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 11 (5), 997-1014 (2009).</li>
<li>Groitl, B., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-based+redox+switches%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Thiol-based redox switches.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1844 (8), 1335-1343 (2014).</li>
<li>Stern, B. D., Wilson, M., Jagus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+nonreducing+SDS-PAGE+for+monitoring+renaturation+of+recombinant+protein+synthesis+initiation+factor%2C+eIF-4+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Use of nonreducing SDS-PAGE for monitoring renaturation of recombinant protein synthesis initiation factor, eIF-4 alpha.</a> Protein Expression and Purification. 4 (4), 320-327 (1993).</li>
<li>Gorman, J. J., Wallis, T. P., Pitt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+disulfide+bond+determination+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Protein disulfide bond determination by mass spectrometry.</a> Mass Spectrometry Reviews. 21 (3), 183-216 (2002).</li>
<li>Li, X., Yang, X., Hoang, V., Liu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Protein+Disulfide+Linkages+by+MS+In-Source+Dissociation+Comparing+to+CID+and+ETD+Tandem+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Characterization of Protein Disulfide Linkages by MS In-Source Dissociation Comparing to CID and ETD Tandem MS.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. , (2018).</li>
<li>Kelly, S. M., Price, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+circular+dichroism+in+the+investigation+of+protein+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protein+and+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">The use of circular dichroism in the investigation of protein structure and function.</a> Current Protein and Peptide Science. 1 (4), 349-384 (2000).</li>
<li>Klockenbusch, C., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+formaldehyde+cross-linking+for+protein+interaction+analysis+of+non-tagged+integrin+beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 927585(2010).</li>
<li>Gavrilov, A., Razin, S. V., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+formaldehyde+cross-linking%3A+it+is+time+for+black+box+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">In vivo formaldehyde cross-linking: it is time for black box analysis.</a> Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 163-165 (2015).</li>
<li>Rotoli, S. M., Jones, J. L., Caradonna, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine+residues+contribute+to+the+dimerization+and+enzymatic+activity+of+human+nuclear+dUTP+nucleotidohydrolase+%28nDut%29%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Cysteine residues contribute to the dimerization and enzymatic activity of human nuclear dUTP nucleotidohydrolase (nDut).</a> Protein Science. , (2018).</li>
<li>Caradonna, S., Muller-Weeks, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nature+of+enzymes+involved+in+uracil-DNA+repair%3A+isoform+characteristics+of+proteins+responsible+for+nuclear+and+mitochondrial+genomic+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protein+and+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">The nature of enzymes involved in uracil-DNA repair: isoform characteristics of proteins responsible for nuclear and mitochondrial genomic integrity.</a> Current Protein and Peptide Science. 2 (4), 335-347 (2001).</li>
<li>Macpherson, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noxious+compounds+activate+TRPA1+ion+channels+through+covalent+modification+of+cysteines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Noxious compounds activate TRPA1 ion channels through covalent modification of cysteines.</a> Nature. 445 (7127), 541-545 (2007).</li>
<li>Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation (ChIP).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).</li>
</ol>

著者らは、この原稿の内容と利益相反がないと宣言している。

ここで概説される方法は、ジスルフィド結合を介して安定化された多量体錯体の分析のためのストレートフォワードプロトコルを与える。このプロトコルは、他の細胞培養ライン、組織および生物に容易に適応することができ、広範囲の用途を可能にする。
この手順の重要なステップは、ジスルフィド結合が抽出手順の結果ではないことを確認することです。遊離システイン残基は、ヨードアセトアミド13を使用してブロックすることができます。このアルキル化剤は、それらのチオール基を介して結合されたシステイン残留物に連結し、新しいジスルフィド結合の形成を阻害する。しかし、ジスルフィド結合が治療時に存在する場合、この薬剤はそれを破壊しない。ヨードアセトアミドの最適化は、濃度と時間のバリエーションを使用して行うことができます。しかし、この試薬に曝露すると細胞死を引き起こすことになる。
役に立つかもしれないこのプロトコルへの追加ステップは、ホルムアルデヒド架橋の最適化です。ホルムアルデヒドの割合の変動は、架橋<sup clas...

ジスルフィド結合は長い間多くのタンパク質の構造を安定化させることが知られている。最近の仕事では、この結合はまた、可逆的な翻訳後修飾として分類されており、タンパク質機能、位置および相互作用1、2の変調を可能にするシステインベースの「レドックススイッチ」として機能し、 3、4。したがって、この変更を研究することができることが重要です。これらのシステイン安定化多量体複合体を分析する簡単な方法は、非還元性 SDS − PAGE 分析5を介して行う。SDS − PAGE 分析は、多くの実験室で用いられる技術であり、その結果は、迅速かつ容易に、かつ最小限のコストで解釈することができ、質量分析などのジスルフィド結合を同定するために使用される他の技術よりも有利である。 、7及び円形二色性8.
この方法が研究に役立つ適切な技術であるかどうかを決定するための1つの重要なステップは、関心のあるタンパク質の一次配列を徹底的に調べて、システイン残基 (複数可) が存在することを保証することである。もう一つの有用なステップは、公開またはバイオインフォマティクスアプリケーションを使用して、システイン残基 (複数可) が位置することができる場所を視覚化するために、目的のタンパク質の三次元構造を探索するために、以前の結晶構造を研究することです。残渣 (複数可) が外面上に存在する場合は、構造体の内側に埋設されたシステイン残基ではなくジスルフィド結合を形成する方が良い候補であり得る。しかしながら、タンパク質は、基質相互作用またはタンパク質-蛋白質相互作用によって、これらの残留物が環境にも暴露されるようになると構造的な変化を起こす可能性があることに注意することが重要です。
同定された多量体複合体は、ホルムアルデヒドを使用して化学架橋で検証することができます。ホルムアルデヒドは、2-3 Åの高い細胞透過性および短い架橋スパンによるこの検証技術のための理想的なクロスリンカーであり、特定のタンパク質-蛋白質相互作用の検出を確実にする9,10。ここで、この方法は、ヒト骨骨肉腫細胞株 dUTPase OS11からの原発性の核アイソフォームを解析することにより図示される。しかし、このプロトコルは、他の細胞株、組織および生物に適合させることができる。

<table><tbody><tr><td>16% プレキャスト TGX ゲル</td><td>ThermoFisher</td><td>Xp00160</td><td></td></tr><tr><td>175 cm2 フラスコ</td><td>セル スター</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>18CO</td><td>ATCC</td><td>CRL-1459</td><td></td></tr><tr><td>6 cm2 ディッシュ</td><td>VWR</td><td>10861-588</td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>アマシャム ECL 検出キット</td><td>GE</td><td></td><td></td>16817200</tr><tr><td>ブロット転写装置</td><td>Biorad</td><td>153BR76789</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Bradford protein reagent</td><td>Biorad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>99985</td><td></td></tr><tr><td>細胞溶解バッファー</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>9803</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendor</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>ドリル</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M101</td><td></td></tr><tr><td>電気泳動装置</td><td>Invitrogen</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>極厚ウェスタンブロッティングペーパー</td><td>ThermoFisher</td><td>88610</td><td></td></tr><tr><td>胎児ウシ血清</td><td>Gibco</td><td>1932693</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>ThermoFisher</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>ガラステフロンホモジナイザー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>65516</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>RPI</td><td>636050</td><td></td></tr><tr><td>ヒートブロック</td><td>デンビル</td><td>10285-D</td><td></td></tr><tr><td>ヘペ</td><td>スシグマ アルドリッチ</td><td>H0527</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>VWR</td><td>2018010431</td><td></td></tr><tr><td>ヨードアセトアミド</td><td>サーモフィッシャー</td><td>90034</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Pharmco</td><td>339000000</td><td></td></tr><tr>無<td>脂肪粉ミルク</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>99995</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>シグマ Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>329-98-6</td><td></td></tr><tr><td>ポジクリック管</td><td>デンビル</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>電源</td><td>バイオラッド</td><td>200120</td><td></td></tr><tr><td>染色マーカー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>26619</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 膜</td><td>バイオラッド</td><td>162-0177</td><td></td></tr><tr><td>ロッカー</td><td>信頼性 科学</td><td>55</td><td></td></tr><tr><td>Saos2</td><td>ATCC</td><td>HTB-85</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Biorad</td><td>161-0302</td><td></td></tr><tr><td>二次抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>70748</td><td></td></tr><tr><td>スモールセルスクレーパー</td><td>Tygon</td><td>S-50HL class VI</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>RPI</td><td>S23020</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>450</td><td></td></tr><tr><td>ブロッティング用スポンジパッド</td><td>Invitrogen</td><td>E19051</td><td></td></tr><tr><td>攪拌プレート</td><td>コーニング</td><td>PC353</td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-1888</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>RPI</td><td>T60040</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffered Saline, with Tween 20, pH 7.5</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SRE0031</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glycine Running buffer</td><td>VWR</td><td>J61006</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>トゥイーン 20</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>U-2 OS</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>X 線フィルム</td><td>サーモフィッシャー</td><td>34090</td><td></td></tr></tbody></table>

非還元 sds − page 分析と化学的架橋を組み合わせて、培養中の哺乳動物細胞におけるジスルフィド結合によって安定化された多量体複合体を検出する

Combining Non-reducing SDS-PAGE Analysis and Chemical Crosslinking to Detect Multimeric Complexes Stabilized by Disulfide Linkages in Mammalian Cells in Culture

多くのタンパク質の構造は共有性ジスルフィド結合によって安定化されます。最近の仕事では、この債券も翻訳後修飾として分類されています。このように、生細胞におけるこの修飾を研究することができることが重要である。これらのシステイン安定化多量体複合体を分析する簡単な方法は、非還元 SDS − PAGE 分析およびホルムアルデヒド架橋の2ステップ法を介して行う。この二段階法は、その技術的容易さと低運転コストのためにジスルフィド結合によって安定化された多量体錯体を明らかにする最初のステップとして有利である。ここで、ヒト骨骨肉腫細胞株 U-2 OS は、dUTPase の核アイソフォームを特異的に分析することによりこの方法を説明するために用いられる。

核 dUTPase は、各モノマータンパク質11の第3のアミノ酸に位置付けられた2つのシステイン残基の相互作用を通じて安定な二量体構成を形成する分子間ジスルフィド結合体を形成する。これは図 1a、Bに示されています。このジスルフィド結合が非還元環境における遊走異常による非特異的相互作用ではなかったことを確認するために、t は適切な制御を含めることが不可欠であった。注目すべきは、核 dUTPase はヒトに存在する4つのアイソフォームのうちの1つである。4つのアイソフォームのうち3つは、共通の触媒コア11,12を共有しながら固有のアミノ末端ドメインを有する。ウエスタンブロットに見られるように、収穫時のヒト細胞における dUTPase の単量体確認は、dUTPase の少なくとも3種のアイソフォーム (ミトコンドリアのア...

ジスルフィド結合は長い間多くのタンパク質の構造を安定化させることが知られている。これらのリンケージによって安定化された多量体複合体を分析する簡単な方法は、非還元 SDS − PAGE 分析を介して行う。ここで、この方法は、ヒト骨骨肉腫細胞株 dUTPase OS からの原発性の核アイソフォームを解析することにより図示される。

非還元 SDS − PAGE 分析と化学的架橋を組み合わせて、培養中の哺乳動物細胞におけるジスルフィド結合によって安定化された多量体複合体を検出する

The structures of many proteins are stabilized through covalent disulfide linkages. In recent work, this bond has also been classified as a ...

多くのタンパク質の構造が共有的な二硫化物結合で安定していることは十分に確立されています。最近の研究では、この結合は翻訳後修飾として分類されている。したがって、迅速かつ簡単な方法を使用して、生細胞のシステイン安定化多数体複合体を同定できることが重要です。この手法の主な利点は、結果を得て、迅速に、簡単に、そして最小のコストで解釈できることです。まず、U-2 OS細胞を最小必須中高グルコースの6平方センチメートルの皿で成長させ、5%の二酸化炭素で摂氏37度で10%FBSと1%のピルビン酸ナトリウムを補う。使用直前に10ミリモルヨウアセトアセトアミドの新鮮なストックを作ります.細胞が50〜60%の合流度に達した後、細胞培養培地に直接0.1ミリモルの最終濃度ヨウドアセトアミドを加える。室温で2分間ゆっくりと皿を揺らす。次に、細胞から培地を吸引し、5ミリリットルの冷たいPBSで細胞を3回洗浄する。最終PBS洗浄液を吸引し、1ミリリットルの冷たいPBSを加える。セルスクレーパーを使用して、皿の底から細胞を削り取ります。1ミリリットルのピペットを使用して、PBSと細胞懸濁液を引き出し、すべての液体を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに分配します。セルを摂氏4度で7、500倍に3分間回転させます。細胞ペレットを残してPBSを吸引する。細胞ペレットは、処理までマイナス80°Cで保存することができます。タンパク質を抽出するには、1Xリシスバッファーの100マイクロリットルを二重蒸留水で希釈して調製します。1 ミリモルの最終濃度に使用する直前に PMSF を追加します。.その後、細胞ペレットに直接1Xライシスバッファーの50マイクロリットルを追加し、再中断します。抽出物を氷の上で5分間インキュベートします。氷上の抽出物を保つ40%で定パルスモードを使用して8秒間超音波処理します。抽出物を摂氏4度、16,000倍gで5分間回転させます。ブラッドフォード分析を行い、必要に応じてタンパク質濃度を決定します。試料を調製するために、可溶性タンパク質抽出物の10マイクロリットルを取り、1XレムリSDSサンプルバッファーの10マイクロリットルを加える。サンプルを氷の上に置いておきなさい。ゲルを動かす前に、サンプルを摂氏85度で5分間加熱します。ホルムアルデヒド架橋を開始するには、U-2 OS細胞を175平方センチメートルのフラスコで70〜80%のコンフルエンシーに成長させます。ヒュームフードでは、ホルムアルデヒド固定剤を培地に直接加えて、最終濃度の1%にし、室温で15分間穏やかな攪拌でインキュベートします。反応を焼くために、0.125モルの最終濃度に1.25モルグリシンを加え、5分間ロッカーに穏やかな攪拌で室温でインキュベートします。冷たいPBSの5ミリリットルで細胞を3回洗います。最終的なPBS洗浄液を吸引し、PBSを10ミリリットル加えます。セルスクレーパーを使用してフラスコの底部から細胞を削り取ります。10ミリリットルのピペットを使用して、PBSと細胞懸濁液を引き出し、すべての液体を15ミリリットルの円錐形遠心分離管に分配します。500倍gと摂氏4度で細胞を2分間回転させます。細胞ペレットを残してPBSを吸引する。0.25モルスクロース、1ミリモルEDTA、10ミリモルHEPES、pH 7.4で0.5%BSAを加えて均質化バッファーの10ミリリットルを調製します。使用直前に、1ミリモルの最終濃度と核懸濁液の3ミリリットルにPMSFを加える。5ミリリットルの均質化バッファーを細胞ペレットに直接加え、完全に再中断します。サスペンションを500g、摂氏4度で2分間遠心分離する。遠心分離後、上清を捨て、ペレットを5ミリリットルの均質化バッファーに再懸濁します。その後、タイトなフィッティングガラスでテフロンホモジナイザーは、500 RPMあたり10ストロークで細胞を均質化し、10分間1、500グラム、摂氏4度で懸濁液を遠心分離します。遠心後上清を捨てる。ペレットを核懸濁液の1ミリリットルに再懸濁し、氷の上で10分間インキュベートする。インキュベーション後、600回gで遠心分離機を10分間行う。遠心分離後、上清を捨てて、再度核懸濁液と遠心分離機の1ミリリットルにペレットを再懸濁する。最終的なペレットは、単離された核になります。1Xリシスバッファーの 25 マイクロリットルを細胞ペレットに直接添加する前に説明したとおりにタンパク質を抽出します。次に、可溶性タンパク質抽出物をそれぞれ10マイクロリットルずつ採取してSDS PAGE用に2サンプルを調製し、10マイクロリットルの2X Laemmli SDSサンプルバッファーと1マイクロリットルのBMEを追加します。1サンプルを摂氏37度で5分間加熱し、2番目のサンプルを摂氏98度で15分間加熱してホルムアルデヒドのクロスリンクを逆にします。25ミリモルトリス、192ミリモルグリシン、体積SDあたり0.1%重量を混合して、1Xトリスグリシンランニングバッファーの1リットルを準備します。次に、SDS PAGE 実行装置をセットアップします。メーカーのプロトコルに従って16%プレキャストTGX SDS-PAGEパッケージを開き、カセットを取り外します。カセットの底部から井戸とテープを裏打ちしている櫛を取り外し、ゲルを実行装置に入れる。ウェルが液体に沈むまで、1Xランニングバッファでチャンバーを満たします。プラスチックピペットを使用して、ランニングバッファで井戸をすすいでください。サンプルを、染色済みの標準マーカーの10マイクロリットルと一緒にゲルにロードします。最後に、染料の前面がゲルの底部から約1センチメートルになるまで200ボルトでゲルを実行します。BME還元剤の不存在下における全細胞抽出物のウェスタンブロット分析は、異なるヒト細胞集団における多量体複合体形成を示した。この複合体は、調べた4つの細胞株すべてにBMEを添加して消失し、ジスルフィド結合の存在を示す。収穫時のヒト細胞におけるdUTPaseの単量体確認は、dUTPaseの少なくとも3つのアイソフォームの組み合わせである:ミトコンドリアアイソフォーム、核アイソフォーム、およびM24で指摘された切り捨てられたバージョンである。対照として用いたミトコンドリアアイソフォームは、ジスルフィド結合体を形成せず、単量体タンパク質の予測分子量に移行した。核dUTPaseのホルムアルデヒド架橋は多量体錯形成を示した。95°Cでサンプルを15分間インキュベートしてクロスリンクを逆転させると、複合体は不安定になり、単量体状態で視覚化することができました。ヨドアセトアミドを添加することは、遊離システイン残基をブロックし、ジスルフィド結合が抽出手順の結果ではないことを保証するために、この手順の重要なステップである。サンプルに存在するジスルフィドリンケージが減少するため、BMEやDDTなどの還元剤をSDS-PAGEサンプルに追加しないことを覚えておくことが重要です。

combining-non-reducing-sds-page-analysis-chemical-crosslinking-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

細胞透過性架橋剤DSP [ジチオビス -...

不安定な多タンパク質複合体の単離で in vivoで制御セルラー架橋及び免疫磁気アフィニティークロマトグラフィー

キャプチャ化合物は、光架橋および精製に続いて​​機能的な可逆小分子 -...

メチルトランスフェラーゼのプロファイリングおよびその他の S -アデノシル- L</subキャプチャの複合質量分析法（CCMS）別> -ホモシステイン結合タンパク質

このビデオでは、組織ホモジネートからネイティブタンパク質複合体を分離するための多量体PAGEについて説明します。この手法は、青色のネイティブPAGE技術とSDS-PAGE技術のハイブリッドです。分離された複合体は、細胞機能におけるそれらの役割について特徴付け、研究することができます。...

ネイティブタンパク質複合体を分離するためのMultimer-PAGE:青色のネイティブPAGEとSDS-PAGEからなるハイブリッド分離技術により、組織ライセートからインタクトな多量体タンパク質を分離します

このビデオでは、非還元性SDS-PAGEによってタンパク質サンプルを分離し、多量体タンパク質複合体を解析する技術について説明しています。この手法は、ジスルフィド結合によって保持されるタンパク質のマルチマーサブユニットを保持し、後でウェスタンブロッティングで分析することができます。...

Non-Reducing SDS PAGE:ジスルフィド結合多量体タンパク質複合体の解析法

膜に埋め込まれたタンパク質ドメイン間の相互作用の生物物理学的および生化学的研究は多くの技術的課題は、適切な教材を入手されているの最初に直面しています。この記事では、ソリューションの核磁気共鳴（NMR）およびその他の分析アプリケーションによる構造解析に適しているジスルフィド安定化膜貫通ペプチド複合体を製造し、精製するためのプロトコルについて説明します。...

構造研究のためのジスルフィド安定化膜貫通ペプチド複合体の生産

この記事では、非変性PAGEとウェスタンブロット分析の組み合わせを使用して、ヒト細胞のライセートからのダイナミン様GTPase...

非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたヒトのMxAのマルチサブユニットタンパク質複合体のキャラクタリゼーション

新規二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）システムが提示されるに結合アミン反応性タンパク質架橋剤を用いて修飾されていない組織溶解物から天然タンパク質複合体を安定化し、分離するための方法。...

多量-PAGE：生体試料中のキャプチャと解決タンパク質複合体のための方法

タンパク質複合体の建築はその機能は欠かせません。様々...

化学架橋と複合体タンパク質複合体の建築を学びそのまま蛋白質の複合体の質量分析法を組み合わせた

ここでは、架橋器の存在下でのグリセロール勾配遠心分離であるグラフィックス(勾配固定)の利用について、一過性にスプライセソーム複合体に結合するスプライシング因子間の相互作用を同定する。...

サッカロミセス・セレビシエ・スプライセソソーム・サブコンプレックスの過渡性インターアクター検出のためのグラフィックスの利用

本プロトコルは、トポイソメラーゼ阻害剤およびホルムアルデヒドによって誘導されるユビキチン化、SUMO化、およびADPリボシル化を含む、DNA-タンパク質架橋(DPC)およびそれらの翻訳後修飾(PTM)を検出および定量するための改変方法を強調し、それによってDPCおよびそのPTMの形成および修復の研究を可能にする。...

DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

学ぶ、非還元SDS-PAGEと化学的架橋を組み合わせた手法で、培養中の哺乳動物細胞におけるジスルフィド結合によって安定化された多量体複合体を検出する方法です。U-2 OS細胞を用いた迅速かつ低コストなタンパク質解析技術を解説します。

非還元 SDS − PAGE 分析と化学的架橋を組み合わせて、培養中の哺乳動物細胞におけるジスルフィド結合によって安定化された多量体複合体を検出する

さらに動画を探す