Name: 組織や細胞イメージング質量分析を使用しての間の小分子通信をキャプチャ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 学ぶイメージング質量分析法による細胞・組織間の小分子通信マッピング技術。卵巣がん転移における小分子の役割を標識フリーで解明し、新規治療標的発見に貢献する革新的アプローチです。

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シカゴのコミュニティ信頼 (C-076) (L.M.S.); でサール資金からサポートとシカゴ医療コンソーシアムによって提供された資金イリノイ大学シカゴ スタートアップの資金 (L.M.S.);卵巣癌研究基金同盟 (医学博士); から 543296 を付与します。UG3 ES029073 (ジェブ) と進んで並進、国立衛生院、グラント UL1TR002003 を通じて (ジェブ ・ LMS) のための国立センター。

すべての動物の手続きケアと実験動物の使用のための国民の健康ガイドライン機関に従って、イリノイ大学シカゴ校制度上の動物の使用とケア (IACUC) 委員会によって承認されました。
1. 試薬の調製
<ol><li>マウス卵管上皮 (萌) 細胞 10% 牛胎児血清を添加したアルファ最小必須培地 (アルファ MEM) メディアで加湿のインキュベーターで 5% CO2と 37 ° c (FBS)、2 mM L-グルタミン、10 mg/mL インスリン、トランスフェリン、セレン (ITS) を維持します。、1.8 ng/mL 上皮成長因子 (EGF)、100 U/mL ペニシリン-ストレプトマイシン、1 mg/mL ゲンタマイシン 18.2 ng/mL エストラジ オール-17 β。セルごとに 3-4 日を渡すと、同じ日に十分なセルがあることを確認、マウスが犠牲に。</li>
	<li>2% の agarose を準備するには、低融点アガロースの 1 g を 50 mL の蒸留水を混合します。クールに、オートクレーブ、アガロースを許可して、因数 (1 mL) 2 ml 管 (材料表参照) agarose が固化する前に。アガロースは、-20 ° C で無期限に格納できます。</li>
	<li>1 x ダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) メディアの少なくとも 2 mL を準備します。</li>
	<li>MALDI-TOF MS のマトリックスの準備 5 mg/mL を 10 mL の 1:1 α-シアノ-4-hyroxycinnamic 酸 (CHCA): ジヒドロキシ安息香酸 (DHB) (材料表参照) 90: 10 ACN:H2O + 0.1% トリフルオロ酢酸 (TFA)。マトリックスを溶解するまでのソリューションの超音波照射します。</li>
</ol>2. マウスのコロニーおよび卵巣除去
<ol><li>住宅の標準的なプロシージャを使用して CD 1 マウスの繁殖ペアを維持します。分娩の日、近くの子犬時代が知られているのでで、マウスを毎日チェックします。</li>
	<li>NIH のガイドラインあたりの CO2吸入で 16-18 日齢で子犬を安楽死させます。配信 CO2 (100%)流れ率 10% – 20% の 1 分あたりのボリュームを商工会議所、呼吸が停止していた後 2 分間続けます。頚部転位して安楽死を確認します。</li>
	<li>70% のエタノールの沈没によってすべての手術用機器を消毒します。1 x ペニシリン-ストレプトマイシンを 37 ° C でリーボビッツの L-15 メディアをウォーム アップします。</li>
	<li>領域を消毒し、毛の混入を最小限に抑えるための 70% のエタノールと腹部の表面を湿らせます。把握は腹壁を覆っている皮膚を使用して鈍い鉗子と使用外科はさみ、大きな V 字カット皮膚と腹壁を通して臓器の内部を公開します。</li>
	<li>内臓を鉗子を使用する側に移動します。個別に微細鉗子でそれぞれの子宮角をつかむし、少し持ち上げてください。</li>
	<li>卵巣、腎臓のすぐ下の子宮角の終わりにあるを探します。外科はさみを使用して、結合組織の無料の卵巣を解剖します。その後、卵巣のホーンを半分にカットします。</li>
	<li>卵巣、卵管および約 1 つ移動に予め温めておいたリーボビッツの L-15 メディアにそれぞれの子宮角の半分。</li>
	<li>解剖顕微鏡下卵管やブルサ、任意の脂肪組織から解放、周囲滑液包からそれぞれの卵巣を慎重に移動します。リーボビッツの L-15 メディアの新しい皿にそれぞれの卵巣を移動します。</li>
	<li>軸それぞれの卵巣は半分にカットします。卵巣部分 (今呼ばれる植) agarose のめっきまで 37 ° C で保管をしてください。</li>
</ol>3. 設定と共培養系の伊藤扱われるスライドをインキュベート
<ol><li>
分割されていない共培養系
	<ol>
<li>70 ° C のホット プレート上でアガロースをゆがみ。</li>
		<li>インジウム酸化スズ (伊藤) の上に 8 もディバイダーを配置-扱われたスライド (図 1 a)。スライド接着におけるエイズの仕切り部分をゴム底が漏洩しないまたは井戸間混合ように agarose めっき中に連続下向きの圧力を適用することを確認します。</li>
		<li>15 mL コニカル管、遠心分離機 (800 rpm で 5 分) の細胞を収集し、50 k に 1 x DMEM メディアで 150 μ L あたりの細胞を再懸濁します。異なるセル密度が最適の場合は、このステップで、細胞懸濁液は 2 x (例えば、300 μ L、この段階での細胞密度の 50,000 セルの最終濃度は 150 μ L の 50,000 セル) の最終の密度が必要なを確認します。</li>
		<li>細胞培養をメッキする前に追加卵巣植よく (図 1 b) の中心に。</li>
		<li>めっき前に個々 の 2 mL 管各細胞の培養にアガロースを追加します。各ウェルの細胞懸濁液 200 μ L、200 μ L 2 mL 管で液化 agarose を組み合わせます。たとえば、4 つの井戸を組み合わせて細胞懸濁液を 800 μ l 添加し、800 μ L 2% の agarose の。いくつかの混合物が残されるが、ピペッティング時に空気の泡を回避必要以上少しを作るします。<ol>
<li>すぐにその細胞の培養をメッキする前に個々 の細胞培養にアガロースを追加します。Agarose が 1 分未満でクールなプレートすぐに用意されます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>すぐに各ウェル (図 1) に細胞・ アガロース培養混合物の 300 μ L を追加します。図 1は、各メッキ卵巣と 3 つのセルの条件と 1 つのメディアの状態を示しています。</li>
		<li>加湿のインキュベーターで CO2を 37 ° C、5% でスライドを孵化させなさい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
分割共培養系。
	<ol>
<li>薄く、滑らかなプラスチック (図 2 a) から仕切りをカットします。 注: この実験は、平らで薄いので滅菌使い捨てメディア洗面器の側面を使用します。それらはちょうどよく (~ 13 mm) の斜辺にぴったり収まる幅をカットします。</li>
		<li>70 ° C のホット プレート上でアガロースをゆがみ。</li>
		<li>伊藤治療スライド (図 2 b) の上に 8 も区切りを配置します。スライド接着におけるエイズの仕切り部分をゴム底が漏洩しないまたは井戸間混合ように agarose めっき中に連続下向きの圧力を適用することを確認します。</li>
		<li>15 mL コニカル管、遠心分離機 (800 rpm で 5 分) の細胞を収集し、50 k に 1 x DMEM メディアで 150 μ L あたりの細胞を再懸濁します。異なるセル密度が最適な場合、この段階で細胞懸濁液は必要に応じて最終密度 x 2 を確認してください (例えば 300 μ L で 50,000 セルの最終的な集中、この段階で細胞密度は、150 μ L の 50,000 のセル)。</li>
		<li>井戸 (図 2) にプラスチックの仕切りを斜めに挿入します。</li>
		<li>めっき直前時に各セル中断の 1 つにアガロースを追加します。各ウェルの細胞懸濁液を 100 μ l 添加し、2 mL 管で液化 agarose の 100 μ L を組み合わせます。たとえば、4 つの井戸を組み合わせて細胞培養の 400 μ L と 2% の agarose の 400 μ L。いくつかの細胞・ アガロース培養混合物が残されるが、ピペッティング時に空気の泡を回避必要以上少しを作るします。<ol>
<li>すぐにその細胞の培養をメッキする前に個々 の細胞培養にアガロースを追加します。Agarose が 1 分未満でクールなプレートすぐに用意されます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>分周器の 1 つの側面の細胞・ アガロース培養混合物の 150 μ L をプレートします。クールし (約 1 分) を固めるし、分周器 (図 2 D) を削除する agarose を許可します。</li>
		<li>卵巣植を井戸の空の半分の中央に配置します。場所 150 μ L メディア ・ アガロース培養混合上卵巣とよく (図 2 e) の正しい側にのみ。</li>
		<li>加湿のインキュベーターで CO2を 37 ° C、5% でスライドを孵化させなさい。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. スライドを乾燥と MALDI-TOF MS の準備
<ol><li>4 日後 (または任意の最寄りの時点) アガロース プラグとスライド (図 1) から商工会議所の区分線を削除します。平らなヘラで商工会議所から agarose の側面を注意深く取り外し、軽く引いてチャンバー、上向き移動任意のアガロース プラグに触らない。彼らが移動を行う場合そっと移動してようにして彼らが互いを触れていません。</li>
	<li>約 4 時間、回転 90 ° 毎の h の 37 ° C のオーブンでスライドを配置します。 注:スライドの回転は、サンプル全体をとおして均等な熱分布を確保することが重要です。</li>
	<li>一度乾燥し、オーブン (図 1E) からスライドを削除します。</li>
	<li>次のパラメーターで (図 1 階)、噴霧器を使用してマトリックス ソリューションを適用: 温度 30 ° C、流量を = = 0.2 mL/分、パス数 = 8、方向 = CC とノズルの距離 = 40 mm。 注: マトリックス スプレーの代わりに芸術的なエアブラシは液体マトリックスを適用する使用できます。スプレー、同じマトリックス ソリューションを使用できますが、約倍のソリューションが必要です。それが垂直にハングアップするので、クランプのスライド、スライドをスプレー 90 ° の角度から離れておよそ 1 フィートから (ホフマン15から適合) 行列までレイヤーが表示されます。</li>
	<li>Calibrant の 1 μ L を追加 (ターゲットのリン赤 < 500 Da、ペプチドの混合物 (材料表参照) ターゲットの < 5,000 Da) スライド上の明確なスポットに。マトリックスと混合するリン赤は必要ありませんが、ペプチド混合物イオン化を支援するためにマトリックスとの 1:1 混合物が必要です。Calibrant 乾燥するを待ちます。</li>
	<li>X を描くスライドの各コーナーで永久的なマーカーを使用して、カメラまたはスキャナーを使用して、1,200 dpi の光学イメージを取る。</li>
</ol>5. イメージング質量分析データ集録
<ol><li>IMS データ解析ソフトウェアに新しいシーケンスを開く (材料の表を参照してください)。目的の空間解像度、少なくとも 50 μ m にラスターの幅を設定します。</li>
	<li>スライドの画像は、光を解析ソフトウェアにアップロードし、設定 3 の交差を使用してポイントを教える、X の各隅に描画します。</li>
	<li>集録ソフトウェアの投射のための関心領域を指定し、それに応じて名前を付けます。</li>
	<li>データ集録ソフトウェアを使用して計測器を校正 (材料表参照) 5 ppm の誤差範囲内で。</li>
	<li>最適化されたメソッドを保存し、実行を開始します。この実験は、次のパラメーターを最適化: 極性正、検出器を = = リフレクトロン、レーザーのサイズ = 2、レーザー出力 = 50%、反射モード検出器ゲイン = 3 x。</li>
</ol>6. 処理 IMS データ
<ol><li>統計ソフトウェアにインポート *.mis ファイル (材料の表を参照してください) 重要性の分析のため。</li>
</ol>

<ol><li>Paine, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Reproductive+System+Non-Negative+Matrix+Factorization+Mass+Spectrometry+Imaging+of+an+Early-Stage+Ovarian+Cancer+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Whole Reproductive System Non-Negative Matrix Factorization Mass Spectrometry Imaging of an Early-Stage Ovarian Cancer Mouse Model.</a> PLoS One. 11 (5), e0154837(2016).</li>
<li>Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+Metabolic+Exchange+with+Imaging+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Translating Metabolic Exchange with Imaging Mass Spectrometry.</a> Nature Chemical Biology. 5 (12), 885-887 (2009).</li>
<li>Li, H., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Mass+Spectrometry+of+Three-Dimensional+Cell+Culture+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Imaging Mass Spectrometry of Three-Dimensional Cell Culture Systems.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8794-8801 (2011).</li>
<li>Yang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+on+Agar-Based+Microbial+Imaging+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Primer on Agar-Based Microbial Imaging Mass Spectrometry.</a> Journal of Bacteriology. 194 (22), 6023-6028 (2012).</li>
<li>Coscia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Proteomic+Profiling+of+Ovarian+Cancer+Cell+Lines+Reveals+Precursor+Cell+Associated+Proteins+and+Functional+Status%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Integrative Proteomic Profiling of Ovarian Cancer Cell Lines Reveals Precursor Cell Associated Proteins and Functional Status.</a> Nature Communications. 7, 12645(2016).</li>
<li>Labidi-Galy, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Grade+Serous+Ovarian+Carcinomas+Originate+in+the+Fallopian+Tube%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High Grade Serous Ovarian Carcinomas Originate in the Fallopian Tube.</a> Nature Communications. 8 (1), (2018).</li>
<li>Klinkebiel, D., Zhang, W., Akers, S. N., Odunsi, K., Karpf, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Methylome+Analyses+Implicate+Fallopian+Tube+Epithelia+as+the+Origin+for+High-Grade+Serous+Ovarian+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">DNA Methylome Analyses Implicate Fallopian Tube Epithelia as the Origin for High-Grade Serous Ovarian Cancer.</a> Molecular Cancer Research. 14 (9), 787-794 (2016).</li>
<li>Falconer, H., Yin, L., Gronberg, H., Altman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+Cancer+Risk+After+Salpingectomy%3A+A+Nationwide+Population-Based+Study%5BTitle%5D)+AND+%22JNCI+Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Ovarian Cancer Risk After Salpingectomy: A Nationwide Population-Based Study.</a> JNCI Journal of the National Cancer Institute. 107 (2), dju410(2015).</li>
<li>Dean, M., Davis, D. A., Burdette, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin+A+Stimulates+Migration+of+the+Fallopian+Tube+Epithelium%2C+an+Origin+of+High-Grade+Serous+Ovarian+Cancer%2C+through+Non-Canonical+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Activin A Stimulates Migration of the Fallopian Tube Epithelium, an Origin of High-Grade Serous Ovarian Cancer, through Non-Canonical Signaling.</a> Cancer Letters. 391, 114-124 (2017).</li>
<li>King, S. M., Burdette, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+Progenitor+Cells+of+Ovarian+Cancer%3A+Analysis+of+Current+Animal+Models%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Reports%22%5BJournal%5D)">Evaluating the Progenitor Cells of Ovarian Cancer: Analysis of Current Animal Models.</a> BMB Reports. 44 (7), 435(2011).</li>
<li>Reznik, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+Metabolic+Variation+across+Tumor+Types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Landscape of Metabolic Variation across Tumor Types.</a> Cell Systems. 6 (3), 301-313 (2018).</li>
<li>Watkins, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Impact+of+Selective+and+Nonselective+Beta-Blockers+on+Survival+in+Patients+with+Ovarian+Cancer%3A+Beta-Blockers+and+Ovarian+Cancer+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Clinical Impact of Selective and Nonselective Beta-Blockers on Survival in Patients with Ovarian Cancer: Beta-Blockers and Ovarian Cancer Survival.</a> Cancer. 121 (19), 3444-3451 (2015).</li>
<li>Lutgendorf, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress-Related+Mediators+Stimulate+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Secretion+by+Two+Ovarian+Cancer+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Stress-Related Mediators Stimulate Vascular Endothelial Growth Factor Secretion by Two Ovarian Cancer Cell Lines.</a> Clinical Cancer Research. 9 (12), 4514-4521 (2003).</li>
<li>Sood, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+Hormone-Mediated+Invasion+of+Ovarian+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Stress Hormone-Mediated Invasion of Ovarian Cancer Cells.</a> Clinical Cancer Research. 12 (2), 369-375 (2006).</li>
<li>Hoffmann, T., Dorrestein, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+Matrix+Deposition+on+Dried+Agar+for+MALDI+Imaging+Mass+Spectrometry+of+Microbial+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+The+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Homogeneous Matrix Deposition on Dried Agar for MALDI Imaging Mass Spectrometry of Microbial Cultures.</a> Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1959-1962 (2015).</li>
<li>Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Mass+Spectrometry+Reveals+Crosstalk+between+the+Fallopian+Tube+and+the+Ovary+That+Drives+Primary+Metastasis+of+Ovarian+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">Imaging Mass Spectrometry Reveals Crosstalk between the Fallopian Tube and the Ovary That Drives Primary Metastasis of Ovarian Cancer.</a> ACS Central Science. 4 (10), 1360-1370 (2018).</li>
<li>Armaiz-Pena, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Src+Activation+by+%CE%B2-Adrenoreceptors+Is+a+Key+Switch+for+Tumour+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Src Activation by β-Adrenoreceptors Is a Key Switch for Tumour Metastasis.</a> Nature Communications. 4, 1403(2013).</li>
<li>Choi, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTERT+Mediates+Norepinephrine-Induced+Slug+Expression+and+Ovarian+Cancer+Aggressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">HTERT Mediates Norepinephrine-Induced Slug Expression and Ovarian Cancer Aggressiveness.</a> Oncogene. 34 (26), 3402(2015).</li>
</ol>

著者がある何も開示するには

HGSOC12,17,18, ノルエピネフリンの役割を関係づける証拠の成長するボディがあるし、この手法は、多くの情報を貢献しています。同じスライド上に存在、少なくとも 8 生物学的条件、メソッドの実行する単一の IMS のメディア コントロールと同様、遺伝子および細胞の特異性など生物学的コントロールのアカウントことができます。メソッドの最適化を評価する HGSOC、任意のセルの主要な転移のモデルで小さな分子を交換やさまざまな生物学的質問と病気の状態を分析する agarose で配置することができます組織型を置き換えることができます。
プロトコルの最も重要な手順の 1 つはティッシュまたは細胞のタイプが互いに近くには、アガロース プラグの中心に存在を確保することです。もう一つの重要な考慮事項は、スライド全体の乾燥時間の最適化です。このメソッドは、簡単に乾燥する、スモール サイズが少し乾燥合併症の結果...

3 つの広く使われているアプリケーションの分子機能の空間分布を特徴付けるために最適化されているイメージング質量分析 (IMS): 組織スライス、回転楕円体、および微生物コロニー1,2,3。切片は、ホスト、ターゲットまたは関連性の低い特定の質量範囲内で生物学的条件のコンテキストにおける代謝物の局在の評価に使用できます。ただし、分子の機能の違いは最も重要かつ明らかな病的状態、たとえば、腫瘍に比較すると健康な組織。この IMS アプローチは特に疾患バイオ マーカーの検出、ただしの開始のために重要なことができる信号の識別ができなくなります (腫瘍グレード) などの病気の進行の各ステージで組織サンプルを取得、病気。空間を介して情報の交換は多くの生物学的システム、ユビキタス機能と組織スライスは、このダイナミックな化学リレーをキャプチャできません。化学交換と拡散を可視化することができる 1 つの方法は寒天プレート上に成長した微生物のコロニーの IMS小さな分子は寒天とを通じて拡散することができる、マトリックス支援レーザー脱離イオン化 (MALDI TOF) 質量分析法4経由で取り込むことができます。この成長のセットアップは、離散生物学的実体 (植民地) 間で交換される分子を識別するために使用することができ、代謝産物生産の方向性を決定することも。微生物コロニー成長用に設計されたプラットフォームは哺乳類セルの成長組織移植片の一次代謝を探索に適応され、IMS は in vitro 哺乳類システムの動的の化学交換の評価に使用されました。
ハイグレード漿液性卵巣癌 (HGSOC) が卵管上皮 (FTE) に由来する多くの場合、早期疾患開発5,6,中に卵巣に転移し明らかになった過去数年間で7,8. FTE の幹細胞、最終的に大きな腫瘍を形成、さらに転移、卵巣への普及であることの理由は不明です。前の研究は主に転移、卵巣卵巣の役割に焦点を当ててください。しかし、それが健康から発癌性の組織への移行が細胞代謝の大規模な破壊の結果し、変更する小分子9,10,11の生産実証最近されています。したがって、我々 の仮説、FTE と卵巣の間で交換される低分子化合物 HGSOC の主な転移に部分的に責任があります。
私たちの新しく開発された IMS プロシージャを使用して、幹の FTE と健康な卵巣組織の培養が卵巣からノルエピネフリンの生産を誘導することを決定しました。ただし、他の細胞の種類や細胞の FTE はないこの効果を引き出します。この方法の特別な利点、分子の生産および実際の分子を表す信号の交換を視覚化できる、共に、シグナルの原因を特定することが可能です。これは空間のすべての情報が失われる均質化試料の分析上の優位性です。モデル体制で明らかに卵巣にノルエピネフリンの生産を割り当てることができました。ノルエピネフリンは転移と卵巣癌の抗癌剤にリンクされており、IMS 方式が生体関連分子12,13,を発見することがこの分子の検出機能の検証が14. この検証は、私たち IMS のこの新しいアプリケーションは特に細胞形質転換に影響を及ぼす早期のイベントを理解して培養環境で小さい分子を識別するためにしようとしているグループの研究に役に立つことを提案することができます・転移。このメソッドの全体的な目標は組織や臓器、3 D 細胞培養体外または前のヴィヴォ組織によって表される間の交換の間に小さな分子の空間分布とアイデンティティを明らかにします。

<table><tbody><tr><td>15 mL ファルコンチューブ</td><td>デンビル</td><td>C1017-O</td><td>細胞を収集するには</td></tr><tr><td>8 ウェルチャンバー (Millipore EZ-slide chamber)</td><td>Millipore</td><td>PEZGS0816</td><td>Millipore から再利用 Millicell EZ-スライドチャンバースライド</td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34998-4L</td><td>スプレーマトリックス用溶媒</td></tr><tr><td>Alpha Minimum Essential Medium (&alpha;MEM)</td><td>Fisher</td><td>10-022-CV</td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>Autoflex speed MALDI-TOF LRF</td><td>Bruker</td><td></td><td>IMSデータ分析用</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td>細胞を採取し、上清を除去する</td></tr><tr><td>CHCAマトリックス</td><td>Bruker ダルトニック</td><td>8201344</td><td>マトリックス 乾燥スライドにスプレー</td></tr><tr><td>DHB Matrix</td><td>Bruker Daltonic 8201346</td><td></td><td>マトリックス スプレー乾燥スライドに</td></tr><tr><td>使い捨てメス</td><td>フィッシャー</td><td>22-079-707</td><td>卵巣の除去用</td></tr><tr><td>解剖ハサミ</td><td>フィッシャー</td><td>13-804-6</td><td>卵巣の除去用</td></tr><tr><td>DMEM メディア</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>アガロース</td></tr><tr><td>表皮成長因子</td>と混合されたメディア <td>Peprotech Inc.</td><td>100-15</td><td>細胞培養培地サプリメント</td></tr><tr><td>エッペンドルフチューブ</td><td>ジェネシーサイエンティフィック</td><td>22-282</td><td>アガロースアリコート用</td></tr><tr><td>エストラジオール-17&β;</td><td>Simga-Aldrich</td><td>E2758</td><td>細胞培養培地サプリメント</td></tr><tr><td>胎児ウシ血清</td><td>デンビル</td><td>fb5001</td><td>細胞培養培地サプリメント</td></tr><tr><td>FlexControl 3.4</td><td>ブルカーダルトニック</td><td></td><td>IMSデータ収集ソフトウェア</td></tr><tr><td>FlexImaging 4.1</td><td>ブルカーダルトニック</td><td></td><td>IMSデータ分析ソフトウェア</td></tr><tr><td>鉗子(罰金)</td><td>Fsiher</td><td>22-327379</td><td>の除去用卵巣</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>セルグロ</td><td>30-005-CR</td><td>細胞培養培地サプリメント</td></tr><tr><td>インスリン、トランスフェリン、セレン(ITS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11074547001</td><td>細胞培養培地サプリメント</td></tr><tr><td>ITOコーティングスライド</td><td>ブルカー</td><td>8237001</td><td>共培養インキュベーション用プラットフォーム</td></tr><tr><td>LeibovitzのL-15培地</td><td>Gibco</td><td>11415064</td><td>組織中に使用される培地解剖</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>細胞培養培地サプリメント</td></tr><tr><td>低融点アガロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414-10G</td><td>めっき用培地と混合</td></tr><tr><td>培地洗面器</td><td>Corning</td><td>4870</td><td>分割チャンバー用のプラスチック仕切りを切断するために使用</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>細胞培養培地サプリメント</td></tr><tr><td>ペプチド校正標準</td><td>Bruker Daltonic</td><td>8206195</td><td>中質量範囲用キャリブラント</td></tr><tr><td>Phophorus red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>343-242-5G</td><td>低質量範囲用キャリブラント</td></tr><tr><td>SCiLS Lab 2015</td><td>Bruker Daltonic</td><td></td><td>IMS データ統計分析</td></tr><tr><td>外科用鉗子 (鈍い)</td> <td>Fisher</td><td>08-875-8B</td><td>卵巣の除去用</td></tr><tr><td>TFA</td><td>Fisher技術</td><td>A116-50</td><td>マトリックスソリューションに追加</td></tr><tr><td>TM噴霧器</td><td>HTXテクノロジー</td><td></td><td>マトリックス適用用</td></tr></tbody></table>

組織や細胞イメージング質量分析を使用しての間の小分子通信をキャプチャ

Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry

イメージング質量分析 (IMS) が 3 種類の試料に日常的に適用されています: 微生物コロニー、回転楕円体、ティッシュ セクション。これらのサンプルのタイプは興味の生物的サンプルの蛋白質、脂質、および代謝物質の分布を可視化するマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析 (MALDI-TOF MS) を使って解析しました。エコイノベーション アプローチでアガロースに哺乳類の細胞培養を播くことによって、がんの化学交信を識別するために対処するため 3 つの以前のアプリケーションの長所を組み合わせて、新規サンプル調製法を開発しました。サンプルの乾燥が続く健康な組織培養します。哺乳類の組織や細胞は、組織と細胞の拡散を介して化学通信を許可する近接遊走が。特定の時点でアガロース ベースのサンプル、微生物コロニー IMS 分析の準備と同じ方法で乾燥させます。それは転移中に操作すると、卵巣に卵管から派生したハイグレード漿液性卵巣癌間の通信をモデル化する手法が開発されました。サンプル調製の最適化は、卵巣の微小環境の主要成分としてノルエピネフリンの特定につながった。新たに開発したこのメソッドは、隣接する細胞や組織間の化学コミュニケーションの理解を必要とする他の生物学的システムに適用できます。

フラット乾燥サンプルで最適な乾燥の伊藤スライドになりますアガロースとスライド (図 3) の空間的な分離を維持する agarose 部分の表面にしわを最小限に抑えています。図 3 aは、図 3 bは、避けるべきであるしわを示しています一方、最適な乾燥を示しています。この最適化は、相対湿度に基づく監視オーブンでスライドの正確な時間は異なることができます注意してください必要があります。しわ少し高さに影響を与えるが、IMS の質量精度の信号のため、わずかなしわは、データの品質を影響しません。したがって、最終的にはわずかなしわを持つアガロース MALDI-TOF MS 経由で分析できます。スライドを完全に乾燥する必要があります。 またはこれは MALDI-TOF 質量分析計の高真空中での試料の爆発を引き起こす可能性があります。
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試料調製法は、イメージング質量分析法による低分子交換を検出する細胞・組織の培養を対応するために開発されました。

Imaging mass spectrometry (IMS) has routinely been applied to three types of samples: tissue sections, spheroids, and microbial colonies. These sample ...

我々のプロトコルは、細胞と組織の間の低分子化学通信をマッピングすることができ、我々は特に卵巣癌メタセシスの小分子を探求するためにこれを適用しました。この技術の主な利点は、細胞と組織の空間的完全性を2Dで維持しながら、ラベルフリーの方法で小分子を測定できることです。この技術により、卵巣癌転移における小分子の寄与を、標的のない方法で問い込むことができた。これは、以前に見落とされていた新しい治療目標と経路を明らかにすることができます。この方法論は、アガロースで増殖できる他の癌や、結果として生じる細胞表現型にとって空間的成分が重要である可能性のある他の疾患に容易に拡張することができる。すべての細胞とコンポーネントが手に入り、乾燥プロセスに対する忍耐力を確保することは、このプロトコルにとって不可欠です。急いで乾燥ステップを行うと、質の悪い質量分析データが得られることが多い。この方法の視覚的なデモンストレーションは、寒天上の組織または微生物を使用する典型的なイメージング質量分析実験から大きく逸脱するため、サンプル調製および乾燥ステップを理解するのに役立ちます。まず、ホットプレートでアガロースを摂氏70度で液化します。ITO処理スライドの上に8ウェルディバイダーを置きます。標準的なトリプシン処理を介して、MOE細胞を15ミリリットル円錐形チューブ、遠心分離機に集め、DMEM培地を1回加えて再懸濁し、150マイクロリットル当たり50,000細胞の濃度を得る。分割されていない共同培養の場合は、鉗子を使用して4つの井戸の中心に卵巣外植を加えます。めっきの直前に、200マイクロリットルの細胞懸濁液と200マイクロリットルのリ定量アガロースを個々の2ミリリットルチューブに組み合わせます。ピペットの際に気泡を避けてください。すぐに、各ウェルに細胞アガロース混合物の300マイクロリットルを追加し、井戸間の漏れや混合を確実にするために、仕切りに連続的な穏やかな下向き圧力を適用します。気泡がなく、卵巣が井戸の中央に残っていることを確認してください。ピペット状のアガロースが卵巣を乱した場合は、ピペットチップをそっと使用してアガロースが冷める前に中央に配置します。次に、加湿インキュベーターで37°C、炭酸ガス5%でスライドをインキュベートします。分割された共同培養物の場合は、薄くて滑らかなプラスチックから仕切り分げをカットします。滅菌、使い捨て媒体の洗面器の側面が使用される。井戸の斜辺にぴったりと収まるほど広く切ります。ITO処理スライドの上に8ウェルディバイダーを置き、プラスチック製の仕切り機を斜めに井戸に挿入します。先に行われたように細胞培養を調製し、2ミリリットルチューブに100マイクロリットルの細胞懸濁液と100マイクロリットルのリケ化アガロースを組み合わせます。直ちに、150マイクロリットルのセルアガロース混合物を仕切りの片側にプレートし、仕切り上げに下降圧力を保つ。アガロースを約1分間冷却して固め、仕切りを取り除きます。鉗子を使用して、井戸の空の半分の中央に卵巣外植を配置します。卵巣の上に150マイクロリットルの細胞アガロース混合物を加える。加湿インキュベーターで37°C、炭酸ガス5%でスライドをインキュベートします。4日後、アガロースプラグからチャンバーディバイダーを取り外します。平らなへらで、アガロースの側面をチャンバーから取り外し、チャンバーを優しく上に引っ張ります。アガロースプラグが動かされた場合は、互いに触れていないようにそっと位置を変更します。スライドを約4時間摂氏37度のオーブンに入れ、1時間ごとに90度回転させて、サンプル全体に熱を分配します。スライドは完全に乾燥する必要があります。それ以外の場合は、MALDI-TOF質量分析計の高真空環境でサンプルの爆発につながる可能性があります。スライドを乾燥し、進行状況を監視することは、高い空間分解能と品質の質量スペクトルを達成するための最も重要なステップです。剥離や過度のしわが発生した場合は、質量分析データを収集することはお勧めしません。マトリックス噴霧器にパラメータを設定して、マトリックス溶液をスライドに適用します。リンレッドをキャリブラントとして使用するには、スライド上の明確な場所に1マイクロリットルのリンレッドを追加します。ペプチド混合物をキャリブラントとして使用するには、1対1の比率でパラフィルム上のマトリックスと混合してイオン化を助け、0.5~1マイクロリットルをスライドにスポットします。質量分析データ取得をイメージングする前に、キャリブレーションが乾燥するのを待ちます。スライドの各隅に固定マーカーを使用してXを描き、1200 dpiのカメラまたはスキャナを使用して光学画像を撮影します。この実験では、オーブン内のスライドを注意深く監視することが不可欠であり、最適な乾燥ITOスライドを確保するために、アガロースの表面全体にシワを最小限に抑えた平らな乾燥したサンプルを生じる。この図は、避けるべきしわを示しています。シワは高さにわずかに影響を与える可能性があり、したがって、イメージング質量分析信号の質量精度。わずかなしわはデータの品質に影響しません。最適に配置された組織は、可能な限り中心に近いはずです。使用される組織は、それが分割されていない場合はウェルの中心に、またはIMSデータの取得がエッジ効果で汚染されないように分割されている場合は半分の三角形の中心にあるべきです。不地に位置した組織は、画像化されると、エッジ効果から偽の質量信号を生じる可能性があります。乾燥したスライド画像は、どの領域を画像にするかをMALDI-TOF質量分析計に教えるために使用されます。卵巣組織の周りの小さな領域は、50マイクロメートルでIMSのために選択された。m-over z信号の代表的な画像は、分割されていない共培養だけでなく、分割されたチャンバーのセットアップのために示されています。最も重要なことは、結果のデータはサンプル調製と同じだけであるということです。乾燥プロセスに特に注意してください。最もエキサイティングな側面は、侵略アッセイやコロニー形成アッセイなどの他の実験を用いて、この方法で発見された小分子を検証して、有効な濃度を知らせ、ヒト生物学に翻訳することです。これは、卵巣癌の原発性転移の過程をよりよく理解することによって、卵巣癌の潜在的な治療標的の新しい経路を発見する扉を開くことを期待する。

capturing-small-molecule-communication-between-tissues-cells-using

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

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組織や細胞イメージング質量分析を使用しての間の小分子通信をキャプチャ

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