マウス膵島細胞の亜集団におけるカルシウムダイナミクスのイメージング

このプロトコルは、ランゲルハンス島内の細胞の小さな亜集団の迅速な単離された機能を可能にする。この手法の利点は、取得したデータのリアルタイムの性質と高い統計的能力、したがって高い再現性が含まれます。イメージング用の小島を固定するには、逆顕微鏡用のイメージングチャンバーを組み立て、ガラスカバースリップをチャンバー内に配置します。

ガラス室のインターフェースが水密であることを確認し、カバースリップが顕微鏡の目的の手の届く範囲内であることを確認してください。次に、細かい粗いメッシュの20で20ミリメートルの正方形をカットし、細かいメッシュの部分に2つのスペーサーの壁を作成するために厚い粘着テープの45〜50マイクロメートルの部分を使用しています。粗いメッシュと重量をイメージング液の35ミリメートルのペトリ皿に浸し、細かいメッシュを解剖顕微鏡の下に置きます。

スペーサーの壁を逆さまにして、スペーサーを上向きにして細かいメッシュを回します。そして、2つのスペーサー間でいくつかの小島を転送するためにp20ピペットを使用してください。時計職人の鉗子を使用して、反転した顕微鏡のイメージングチャンバーの中にメッシュを逆さまに置き、スペーサーが下向きに向かってチャンバーカバースリップに直接座るようにし、スペーサーとメッシュの間の小島をカバースリップの真ん中に閉じ込めます。

サンプルの横運動を引き起こす過剰な量の溶液を含まずに、メッシュが十分に水分補給されるのに注意してください。次に、粗いメッシュと重量をチャンバー内の細かいメッシュの上に置き、イメージング液をチャンバに加えます。島が固定化されたら、反転顕微鏡で撮像モードと目的を選択し、マイクロスコープの温度制御段階に小島を入れます。

灌流を設定した後、インフローをチャンバー内の流出量よりも低く位置し、流出流束を流入フラックスよりも大きく設定する。流出液と溶液との接触が最小限に抑えられるので、連続した複数の小さな液滴で溶液を除去し、連続的な溶液除去の間隔が長くならないようにしてください。次に、3ミリモルグルコースを含むイメージング溶液で灌流を開始し、緑色のフルオロフォアをイメージングするための光路およびフィルタを選択する。

次に、ライブイメージングを実行してイメージングパラメータを設定し、ビューを調整して対象の島をキャプチャします。画像の信号対雑音比を最適化するには、励起光強度、露光時間、およびビニングを調整し、設定が最小の光強度と露出で島内の各セルを明確に視覚化できるようにします。次に、0.1~5ヘルツで島を画像化し、取得したデータの品質をキャプチャして確認します。

アルファ細胞活性が検出可能な場合は、取得ソフトウェア内のシグナルダイナミクスのオンラインチャートを可能な限り使用し、アドレナリンまたはグルタミン酸を浴液に2〜5分間追加します。カルシウムの急激なジャンプとそれに続くアルファ細胞振動の減速またはキャンセルが観察されます。次に、最近報告されているグレリンを加え、デルタ細胞を選択的に活性化すると報告された。

カルシウムの急速な可逆的な増加は、小さな亜集団の小さな小さな小集団で観察される。その後、10ミリモルのグルコースを追加します。ベータ細胞のサブ集団における協調振動応答が観察される。

また、アドレナリンまたはグルタミン酸およびグレリンによって以前に活性化された細胞の応答に注意してください。.画像を保存した後、適切なデータ分析ソフトウェアプログラムにデータをインポートし、生蛍光強度データを蛍光の初期値に正規化します。細胞間可変性蛍光強度データセットがまだ相当である場合は、制御溶液が適用された時間の範囲の制御領域を定義する。

制御領域に明確な非発振信号がある場合、制御溶液の各適用後に蛍光強度がベースラインに戻ったと仮定する。各セルの時間経過データを修正するには、データを制御解が追加されたポイントで区切られたセグメントに分割し、各セグメントに線形補正を適用します。制御範囲に明確な振動がある場合、または追加の因子が存在する場合は、スパイク検出アルゴリズムを使用します。

カルシウムスパイクの頻度とアゴニストとアンタゴニストの添加に対する応答を測定するには、記録を等しい時間間隔に分割し、間隔内のスパイクをカウントし、間隔期間に正規化して部分的な周波数の時間経過を計算します。または、しきい値を設定し、各間隔のプラトー分率を計算します。分数は、セルが励起状態で費やした間隔内の時間の割合を示します。

または、各間隔の曲線下の部分領域を計算します。膜の脂質組成が影響を受けていない限り、島は熱帯染料とかなりよく負荷されます。ヒトアデノウイルス型5型ベクターもまた、イレット細胞を標的にすることも成功した。

アルファ細胞のスパイクは低グルコースレベルで容易に検出でき、低グルコースでの活性とアドレナリンとグルタミン酸への応答との間には高い細胞ごとの相関関係があります。グレリンは低ブドウ糖でいくつかのアドレナリン応答性細胞を活性化しますが、低グルコースによって活性化される細胞のほとんどでカルシウムダイナミクスに影響を与えなくなります。部分的な頻度の観点から分析すると、アドレナリンまたはグレリン刺激細胞は、基底スパイクとアドレナリン効果の間の全体的な変化は微妙であるが、オールまたはナッシング状態で実質的な増加を表示します。

対照的に、曲線下の部分領域は、基底活性が高い場合でも、すべての細胞においてアドレナリンによって導入される変化に敏感である。すべてのメッシュがイメージングソリューションと接触していることを確認し、気泡を避けるために組織を合理的に密集して配置するように注意してください。この方法を展開して、細胞タイプを区別するための人工知能を含めることができます。

薬理マーカーは、パターン認識技術によって置き換えることができ、それによって記録時間を短縮する。