Name: 無細胞タンパク質式を使って急速に成長している細菌ビブリオ natriegens (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 学ぶ Vibrio natriegens を用いた無細胞タンパク質発現法。急速に成長する細菌の粗抽出液を使い、プラスミドDNAやmRNAからタンパク質を高速合成するプロトコルです。バイオプロダクションや合成生物学の研究に応用可能です。

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この作品は、一般医学国立研究所 1U01GM110714-01 とエネルギー ・ デ ・ FG02 02ER63445 部門によって賄われていた。著者は、この原稿のプロトコル セクションの構築に関する有益な助言を博士リチャード Kohman、タム ジェニーと博士エドガー Goluch を感謝したいです。

<ol><li>Kwon, Y. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5, 8663(2015).</li>
<li>Schoborg, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-free+platform+for+rapid+synthesis+and+testing+of+active+oligosaccharyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">A cell-free platform for rapid synthesis and testing of active oligosaccharyltransferases.</a> Biotechnology and Bioengineering. 115 (3), 739-750 (2018).</li>
<li>Caschera, F., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+2.3+mg%2Fml+of+protein+with+an+all+Escherichia+coli+cell-free+transcription-translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system.</a> Biochimie. 99, 162-168 (2014).</li>
<li>Henrich, E., Hein, C., Dötsch, V., Bernhard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+production+in+Escherichia+coli+cell-free+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Membrane protein production in Escherichia coli cell-free lysates.</a> FEBS Letters. 589 (15), 1713-1722 (2015).</li>
<li>Li, J., Wang, H., Kwon, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+high+yielding+streptomyces%E2%80%90based+cell%E2%80%90free+protein+synthesis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Establishing a high yielding streptomyces‐based cell‐free protein synthesis system.</a> Biotechnology and Bioengineering. 114 (6), 1343-1353 (2017).</li>
<li>Moore, S. J., Lai, H. E., Needham, H., Polizzi, K. M., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptomyces+venezuelae+TX-TL--a+next+generation+cell-free+synthetic+biology+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Streptomyces venezuelae TX-TL--a next generation cell-free synthetic biology tool.</a> Biotechnology Journal. 12 (4), 1600678(2017).</li>
<li>Wang, H., Li, J., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Pseudomonas+putida+cell-free+protein+synthesis+platform+for+rapid+screening+of+gene+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Development of a Pseudomonas putida cell-free protein synthesis platform for rapid screening of gene regulatory elements.</a> Synthetic Biology. 3 (1), ysy003(2018).</li>
<li>Kelwick, R., Webb, A. J., MacDonald, J. T., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Bacillus+subtilis+cell-free+transcription-translation+system+for+prototyping+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Development of a Bacillus subtilis cell-free transcription-translation system for prototyping regulatory elements.</a> Metabolic Engineering. 38, 370-381 (2016).</li>
<li>Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+Cell-Free+Vibrio+natriegens+Expression+System%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Establishing a Cell-Free Vibrio natriegens Expression System.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (10), 2475-2479 (2018).</li>
<li>Des Soye, B. J., Davidson, S. R., Weinstock, M. T., Gibson, D. G., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+High-Yielding+Cell-Free+Protein+Synthesis+Platform+Derived+from+Vibrio+natriegens%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Establishing a High-Yielding Cell-Free Protein Synthesis Platform Derived from Vibrio natriegens.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2245-2255 (2018).</li>
<li>Failmezger, J., Scholz, S., Blombach, B., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Free+Protein+Synthesis+From+Fast-Growing+Vibrio+natriegens%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cell-Free Protein Synthesis From Fast-Growing Vibrio natriegens.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1146(2018).</li>
<li>Moore, S. J., MacDonald, J. T., Wienecke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+acquisition+and+model-based+analysis+of+cell-free+transcription-translation+reactions+from+nonmodel+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid acquisition and model-based analysis of cell-free transcription-translation reactions from nonmodel bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), E4340-E4349 (2018).</li>
<li>Eagon, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+natriegens%2C+a+marine+bacterium+with+a+generation+time+of+less+than+10+minutes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas natriegens, a marine bacterium with a generation time of less than 10 minutes.</a> Journal of Bacteriology. 83, 736-737 (1962).</li>
<li>Weinstock, M. T., Hesek, E. D., Wilson, C. M., Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+natriegens+as+a+fast-growing+host+for+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecular biology.</a> Nature Methods. 13 (10), 849-851 (2016).</li>
<li>Lee, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+natriegens%2C+a+new+genomic+powerhouse%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Vibrio natriegens, a new genomic powerhouse.</a> bioRxiv. , 058487(2016).</li>
<li>Lee, H. H., Ostrov, N., Gold, M. A., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombineering+in+Vibrio+natriegens%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Recombineering in Vibrio natriegens.</a> bioRxiv. , 130088(2017).</li>
<li>Schleicher, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+natriegens+as+Host+for+Expression+of+Multisubunit+Membrane+Protein+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Vibrio natriegens as Host for Expression of Multisubunit Membrane Protein Complexes.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2537(2018).</li>
<li>Fernández-Llamosas, H., Castro, L., Blázquez, M. L., Díaz, E., Carmona, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speeding+up+bioproduction+of+selenium+nanoparticles+by+using+Vibrio+natriegens+as+microbial+factory%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Speeding up bioproduction of selenium nanoparticles by using Vibrio natriegens as microbial factory.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16046(2017).</li>
<li>Aiyar, S. E., Gaal, T., Gourse, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rRNA+promoter+activity+in+the+fast-growing+bacterium+Vibrio+natriegens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">rRNA promoter activity in the fast-growing bacterium Vibrio natriegens.</a> Journal of Bacteriology. 184 (5), 1349-1358 (2002).</li>
<li>Hoffart, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+substrate+uptake+rates+empower+Vibrio+natriegens+as+production+host+for+industrial+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">High substrate uptake rates empower Vibrio natriegens as production host for industrial biotechnology.</a> Applied and Environmental Microbiology. 83, e01614-e01617 (2017).</li>
<li>Long, C. P., Gonzalez, J. E., Cipolla, R. M., Antoniewicz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+the+fast-growing+bacterium+Vibrio+natriegens+elucidated+by+13C+metabolic+flux+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Metabolism of the fast-growing bacterium Vibrio natriegens elucidated by 13C metabolic flux analysis.</a> Metabolic Engineering. 44, 191-197 (2017).</li>
<li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+Coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of Biological Engineering. 4, 8(2010).</li>
<li>Sitaraman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cell-free+protein+synthesis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A novel cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).</li>
<li>Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+DNA+for+rapid+prototyping+of+synthetic+biological+circuits+in+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an Escherichia coli based TX-TL cell-free system.</a> ACS Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).</li>
<li>Seki, E., Matsuda, N., Yokoyama, S., Kigawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+system+from+Escherichia+coli+cells+cultured+at+decreased+temperatures+improves+productivity+by+decreasing+DNA+template+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis system from Escherichia coli cells cultured at decreased temperatures improves productivity by decreasing DNA template degradation.</a> Analytical Biochemistry. 377 (2), 156-161 (2008).</li>
<li>Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+from+non-growing%2C+stressed+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16524(2017).</li>
<li>Shirokov, V. A., Simonenko, P. N., Biryukov, S. V., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous-Flow+and+Continuous-Exchange+Cell-Free+Translation+Systems+and+Reactors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell-Free+Translation+Systems%22%5BJournal%5D)">Continuous-Flow and Continuous-Exchange Cell-Free Translation Systems and Reactors.</a> Cell-Free Translation Systems. , 91-107 (2002).</li>
<li>Michel-Reydellet, N., Woodrow, K., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+PCR+fragment+stability+and+protein+yields+in+a+cell-free+system+with+genetically+modified+Escherichia+coli+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Increasing PCR fragment stability and protein yields in a cell-free system with genetically modified Escherichia coli extracts.</a> Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 9 (1), 26-34 (2005).</li>
<li>Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+biological+applications+using+cell-free+metabolic+engineering%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview.</a> Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).</li>
</ol>

DJW、いいえ、GMC は、この作品に関連する特許を提出したと。

このプロトコルは、 natriegens 対野生型と V2 塩 (資材表) を添加した lb 膜から成る細菌の成長媒体のために最適化されています。Natriegens v.の他の系統は、無細胞反応; 原油細胞抽出液を生成する同様に培養することができます。ただし、その使用には、このプロトコルのさらなる最適化が必要です。さらに、この無細胞タンパク質発現システムは、一次エネルギー再生ソースとして 3-ホスホ グリセリン酸 (3-PGA) を使用して最適化されています。その他再生エネルギーを使用可能性があります。ただし、高収量タンパク質式10,11を入手しなければに試薬および校正の最適化でしょう。
このプロトコルのいくつかの重要なステップに固有の注意は高収量の最大抽出生産性を確保する無細胞タンパク質の生産。まず、成長の半ば指数段階で収穫された細胞培養natriegens 対からの原油の細胞抽出液を準備しなければなりません文化外径600に達するとき、蛋白質収量が最大 1.0 ± 0.2 を =。光学密度の範囲で採取した細胞から無細胞タンパク質生産が可能ですが、我々 は以前セル成長の急激な状態で収穫がかなり多くタンパク質9をもたらすことを発見しました。原油細胞抽出パフォーマンスの光学密度の観測効果、バッチ培養条件1で育った細胞から派生した他の無細胞システムの報告と一致。Natriegens V.急速な率で増加するので、文化の光学密度を密接に監視する重要です。一般に、それはnatriegens 対文化がこのプロトコルを使用して 1−1.5 h 以内 1.0 の外径600を再現性をもって到達することが期待します。ただし、個々 の成長条件の使用などはどの影響曝気や空気水孵化率と孵化の温度の安定性に影響を与えると成長時間を変更可能性があります非困惑のフラスコと困惑。さらに、 natriegens 対1 L 困惑してフラスコで簡単操作や転送のための収穫で大細胞ペレットを確保するための少なくとも 250 mL を培養することを一般的にお勧めします。ペレット由来抽出物の総容積の増加と同様、原油セル抽出準備の成功が大幅に向上します。小さい規模の準備機能を使用するとき培養条件および試薬適切に調整できます。さらに大規模な発酵、培養条件の最適化が必要になります。最後に、高蛋白質収量を確保するため、収穫後すぐにまたは-80 ° C で保存する 1−2 日以内に細胞ペレットを処理する重要なです。
パルス超音波照射によって細胞ペレットの適切な換散は無細胞タンパク質発現の成功に不可欠です、このプロトコルの新しいユーザーのための最も困難な側面は、しばしば。通常、分離よくペレットの残骸がない液体抽出物の膨大な量になります。抽出物は少し粘性が液体窒素で凍結する前に管のストレージに早かったとき簡単に戻されることができます。図 3は、ポスト溶解遠心分離のステップ後不十分な分離ペレット (図 3 b) と比較しても分離ペレット (図 3 a) の表現を示しています。完全セル換散の主要な徴候は原油細胞抽出総蛋白濃度 > 20 mg/mL 総蛋白質の試金 (ステップ 2.13) によって決定されます。過剰超音波または原油の細胞抽出液の過剰加熱無細胞反応を行わず確定できない細胞機械装置が破損します。したがって、下流蛋白質式アプリケーションに膨大な時間と労力を捧げる前にコントロール反応の抽出効率をテストするのには非常に有益です。その他の最適化は、別の超音波処理装置に必要なかもしれませんが、パルス超音波処理の手順は、私たちの手で再現性の高いされています。
PCR 増幅、制限の酵素のダイジェスト、または商業遺伝子合成から派生した線形 DNA のテンプレートの使用は大幅無細胞システム24で高スループットと急速な蛋白質の生産のための容量を増やすことができます。PCR 増幅された線形テンプレートからの蛋白質の生産を示されている、これらの反応の収率が約 13.5-fold 下に比べてプラスミドを用いた反応モル比9時の DNA のテンプレート。これは主に内因性核酸natriegens 対の原油の細胞抽出液の存在によって低下はほとんど線形 DNA のテンプレートの不安定性。ラムダファージ · タンパク質 GamS は線形 DNA テンプレート24,25を保護するために既に使用されている、時natriegens 対に対応する9を抽出それが見つかりました。さらに、線形 DNA テンプレートの濃度を増加させるタンパク質の収量が可能ことがあります、原油の細胞抽出液の高速パフォーマンスが低下は大きな問題とされます。
線形 DNA の生体外のトランスクリプションから生成された mRNA のテンプレートで無料の細胞反応を補足する線形 DNA テンプレートの劣化を克服するための解決策があります。その一方で、RNase 阻害剤の使用は、mRNA 転写分解に対して重要な保護を提供しています、10 μ L 反応の無細胞形式 (図 5 a, B) でかなりのタンパク質の収量を得ることができます。TA 結紮を円形のテンプレートへの線形 DNA のクローニング、テンプレートの劣化を回避するために TOPO のクローニング、ゴールデン ゲートのアセンブリ、または他の結合方法を使用可能性があります。さらにそれにもかかわらず、アプローチのヌクレアーゼ活性を阻害すると、線形 DNA のテンプレートを使用して効率的なタンパク質発現の必要があります。
日には、無細胞タンパク質発現9,10、11,26の粗野なエキスの準備のためいくつかの異なる方法が提案されています。このプロトコルを開発する上では、ユーザのアクセシビリティを最大限、全体的なコストの削減、時間のかかる手順を最小限にましょう。たとえば、高蛋白質収量は単純な 2 段階の超音波処理遠心分離プロセスを使用して実現され、セルのホモジナイザー、長い透析の手順や流出反応は必要ありません。簡単に時間の短い期間で実行、実験室の専門知識の高レベルを必要としません。したがって、並進の学術研究や産業プロセスの設計のための標準として無細胞発現を促進することに役立ちます。
このプロトコルは、調査およびnatriegens 対、ユニークな生物学的特性を非モデル生物のユーティリティに使用できるツールキットを拡張します。エネルギー回生システムのように、半または完全に-連続無細胞の反応を用いた高蛋白質収量を実現できますアミノ酸および廃棄物3,5,27の除去の間。さらに、野生型natriegens V. DNAse、RNAse 欠損株を生成するためのエンジニア リング、劇物と競合する代謝経路の除去および追加 Trna の表現が大幅に強化の蛋白質の生産このシステム28,29急速な成長の基礎となる生物学的解明、 natriegens 対無細胞システムの更なる発展が生物生産機能を加速、治療的なペプチド、低分子、合成の堅牢な式を有効にします。材料。

無細胞タンパク質合成は、貴重なタンパク質またはペプチド1,2,3,4の式の汎用性とコスト効果の高い方法です。大腸菌発現システムを用いた無細胞タンパク質合成が実行された歴史的に、しかし、ずっとある最近のサージ無細胞5,6,7,8,9のシャーシとして新規プロパティで代替、非モデル生物を使っての,10,11,12.大腸菌無細胞システムに代わるものとして総理候補をユニークな代謝プロファイルを持つ生物。たとえば、海洋細菌のビブリオ natriegensはすべて知られている生物観察の急成長は、10 分13未満の時間を倍増します。これは研究とバイオ テクノロジー14,15,16,17,18新たな微生物ホストとしてnatriegens (動)注目を集めています。Natriegens 対の急速な成長率がタンパク質合成と代謝効率19,20,21, 無料のセルのための細胞機械装置を活用率が高いにリンクされて合成には、急速な蛋白質の生産と高速スクリーニングのためのツールキットが拡大します。
最近、無細胞発現系natriegens 対は T7 プロモーター93 h > 260 μ g/mL の濃度でスーパー フォルダー GFP (sfGFP) を作り出すことができるである実証されています。このメソッドの開発の全体的な目的は、短時間で一般的な実験装置を用いて調製できる高アクセス、コスト効率の高い、再現、および収無細胞タンパク質発現システムをユーザーに提供するためでした。このプロトコルは、シェイク フラスコ 1l 文化、パルス超音波処理と並列化とスループットをスクリーニングを最大限に 96 または 384 ウェル フォーマットで小規模なバッチ反応セル換散を利用しています。長い、持続的なタンパク質発現可能です 3-ホスホ グリセリン酸 (3-PGA) の補給によってエネルギー ソース8,22,23として。このプロトコルを正常に完了するには、ユーザーは目的の蛋白質を表現する機能を持っているまたはnatriegens 対粗セルを用いたセルなしの形式で蛋白質のセットを抽出します。
グリセロール ストックから始まって、 natriegens 対原油細胞抽出液は 600 の光学濃度で採取した細胞から調製した 1.0 nm (外径600)。1 L 文化原油細胞エキス 25% 以上 800 無細胞反応にとっては十分なエキスの約 2−3 mL が得られます。プラスミド DNA、線形 DNA や mRNA テンプレートを使用して蛋白質を表現できます。しかし、内因性核酸による線形 DNA テンプレート劣化携帯無料natriegens 対野生型システム9を使用する場合大きな欠点のままです。文化natriegens の v.から始まって、タンパク質の下流のアプリケーションの使用可能な可能である単一のユーザー 1−2 日以内。

<table><tbody><tr><td>15 mL チューブ</td><td>Corning</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>2 mL チューブ</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td></td></tr><tr><td>384-well Black Assay Plates</td><td>Corning</td><td>3544</td><td></td></tr><tr><td>384-well PCR Plates</td><td>Eppendorf</td><td>951020702</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubes</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>96-well PCR Plates</td><td>Eppendorf</td><td>30129300</td><td></td></tr><tr><td>アデノシン 3',5'-環状一リン酸ナトリウム塩 一水和物</td><td>シグマ</td><td>A6885</td><td></td></tr><tr><td>アデノシン 5'-三リン酸 - 100 mM</td><td>NEB</td><td>N0450L</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems Veriti 384-well Thermocycler</td><td>ThermoFisher</td><td>4388444</td><td></td></tr><tr><td>Assay Plate Adhesives</td><td>BioRad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>&β;-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド水和物(NAD)</td><td>シグマ/ロシュ</td><td>10127965001</td><td></td></tr><tr><td>コエンザイムA水和物</td>シ<td>グマ</td><td>C4283</td><td></td></tr><tr><td>シチジン5'-三リン酸-100mM</td><td>NEB</td><td>N0450L</td><td></td></tr><tr><td>D-(-)-3-ホスホグリセリン酸二ナトリウム塩(3-PGA)</td><td>シグマ</td><td>P8877デュ</td><td></td></tr><tr><td>ワーフラスコ-4L</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>10-194-100C</td><td></td></tr><tr><td>DL-ジチオスレイトール溶液 - 1 M</td><td>Sigma</td><td>42816</td><td></td></tr><tr><td>フォリン酸カルシウム塩水和物</td><td>Sigma</td><td>47612</td><td></td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>グアノシン 5'-三リン酸 - 100 mM</td><td>NEB</td><td>N0450L</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン酸 ヘミマグネシウム塩四水和物</td><td>Sigma</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン酸カリウム塩一水和物</td><td>Σ</td><td>G1149</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth (Miller)</td><td>Σ</td><td>L3522</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム (MgCl2)</td><td>Σ</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>プラスミド pJL1-sfGFP</td><td>Addgene</td><td>69496</td><td></td></tr><tr><td>プラスミド プラス Maxi kit</td><td>Qiagen</td><td>12963</td><td></td></tr><tr><td>ポリ(エチレングリコール)(PEG)-8000</td><td>Sigma</td><td>89510</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム(KCl)</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>水酸化カリウムペレット</td><td>Sigma/Roche</td><td>1050121000</td><td></td></tr><tr><td>Q125 Sonicator and CL-18 プローブ ?インチチップ付き</td><td>Qsonica</td><td>4422</td><td></td></tr><tr><td>RNA クリーン&コンセントレータキット</td><td>Zymo</td><td>R1013</td><td></td></tr><tr><td>RNase阻害剤、マウス</td><td>NEB</td><td>M0314</td><td></td></tr><tr><td>RTSアミノ酸サンプラーBiotechrabbit</td><td></td><td>BR1401801</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>スペルミジン</td><td>Sigma</td><td>S0266</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNAポリメラーゼ</td><td>NEB</td><td>M0251</td><td></td></tr><tr><td>トリス溶液(pH 8.0) - 1 M</td><td>Invitrogen</td><td>AM9856</td><td></td></tr><tr><td>大腸菌由来tRNA MRE 600</td><td>Sigma/Roche</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>Uridine 5'-triphosphate - 100 mM</td><td>NEB</td><td>N0450L</td><td></td></tr><tr><td>Vibrio natriegens (野生型) 凍結乾燥ストック</td><td>ATCC</td><td>14048</td><td></td></tr></tbody></table>

無細胞タンパク質式を使って急速に成長している細菌ビブリオ natriegens

Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens

海洋細菌ビブリオ natriegensは、バイオ テクノロジーの急速な成長率のための新たな微生物ホストとして注目を集めています。一般的なプロトコルは、一般的な検査機器を使用して粗セルnatriegens (動)抽出物の準備のため説明します。この高降伏プロトコルが具体的にされているユーザのアクセシビリティのために最適化された、コストを削減します。無細胞タンパク質合成 (当たり) 96 または 384 ウェル フォーマット小規模 10 μ L バッチ反応で行うことが再現性をもって 3 h 内 > 260 μ g/mL スーパー フォルダー GFP (sfGFP) の濃度を全体的に利回り、原油細胞抽出準備と当たり単一のユーザーによって 1−2 日間で実現できます。この議定書は、生物生産と合成生物学の応用の進歩を促進するための既存の蛋白質合成パイプラインに簡単に統合できます。

無細胞発現系は、ハイスループット合成と重要なタンパク質のスクリーニングのための強力かつコスト効率の高いツールです。ここで、mRNA のテンプレート、線形 DNA プラスミド DNA を使用して急速な蛋白質の生産のビブリオ natriegensを用いた無細胞タンパク質発現系の作製について述べる。

The marine bacterium Vibrio natriegens has garnered considerable attention as an emerging microbial host for biotechnology due to its fast growth rate. A ...

無細胞タンパク質発現のための私達のプロトコルは、簡単で時間効率の2段階の超音波処理遠心プロセスを使用して調製される急速に成長している細菌ビブリオナトリーゲンからの非常に活性な粗抽出物を利用する。粗細胞抽出物調製および無細胞タンパク質合成は、この技術をバイオプロダクションまたは合成生物学の用途のパイプラインに容易に統合することを可能にする単一のユーザーによって1〜2日で達成することができる。一晩ビブリオナトリゲン培養物の1ミリリットルをベンチトップ遠心分離機で10,600回gで1分間洗浄し始める。ペレットを乱さずに上清を吸引し、新鮮なLB-V2培地の1ミリリットルで再懸濁する。洗浄された一晩培養物の1ミリリットルを、無菌カバー付きのオートクレーブ4リットルバッフルエルレンマイヤーフラスコに1リットルの新鮮なLB-V2成長培地に接種し、1~1,000の希釈配給を達成する。225 RPMに振りながら摂氏30度で培養を成長させます。分光光度計を使用して、培養OD 600を監視する。そして、それが1.0プラスマイナス0.2に達すると、3で2つの500ミリリットルチューブで遠心し、摂氏4度で20分間500回gを収穫し、氷の上に置きます。上清を吸引し、すぐにペレットを処理します。細胞のリシス手順を開始する前に、冷却して調製したS30のライシスバッファーpH 7.7〜約4°Cまで、この冷たいS30ライシスバッファーの10ミリリットルを使用して、同じ1リットル培養から生じるすべてのペレットを再懸濁します。そして、50ミリリットルのチューブにサスペンションを移します。この懸濁液を3、500倍のgで摂氏4度で10分間遠心し、ペレットを乱さずに上清を吸引し、氷の上に置く。冷たい部屋で働くことは氷の上に置かれる50ミリリットルの管の小さい部分に500マイクロリットルの冷たいS30のリシスの緩衝液を加える。広いボアピペットチップを使用してペレットを再懸濁し、氷上でも慎重に2ミリリットルチューブに移します。非常に活性な粗抽出物を生成するためには、細胞がS30バッファーで希釈されていないが、効率的な超音波処理のための十分な液体を持っていることを確認する必要があります。600ミリリットルのビーカーに氷を入れ、氷の上に2ミリリットルのチューブホルダーを置きます。細胞を均質化するためにチューブを短時間渦に入る。フリックしてキャップの底面にあるセルを取り除き、キャップを開けたチューブホルダーに入れします。液体表面のすぐ下にあるように、チューブ内の細胞懸濁液に低い超音波処理器の先端。1/8インチの先端径を持つ超音波処理器とプローブを使用して超音波処理のセットアップを準備します。20キロヘルツ周波数と50%振幅に超音波処理器を設定します。パルスオン時間は10秒、パルスオフ時間は60秒。3サイクルのパルス超音波処理プロトコルを実行します。そして、遠心分離機粗細胞抽出物は、リセートが細胞の破片を含まないまで、摂氏4度で30〜45分間16,000倍gで抽出する。超音波処理が行われるように細胞のリシスを視覚的に検査することは、超音波処理が期待どおりに機能していることを確認するために重要です。冷たい部屋で働くことは、ペレットを乱さないように確認する新しい2ミリリットルのチューブに得られた上清の50マイクロリットルをアリコート。これらの粗細胞抽出物をフラッシュフリーズするには、チューブを浸漬ストリングを取り付けたチューブホルダーに入れ、液体窒素を含むデュワーに沈水し、凍結しているかどうかを確認します。DNAテンプレートを使用して無細胞タンパク質発現を行うために、10Xエネルギー溶液マスターミックスを解凍し、4Xアミノ酸マスターはアリコートを混合し、DNAテンプレートを室温で混合した。その後、T7 RNAポリメラーゼとRNAse阻害剤ストックをマイナス20°Cの冷凍庫から取り除き、氷の上に置きます。DNAテンプレート、10Xエネルギー溶液マスターミックス、および4Xアミノ酸マスターミックスが解凍されると、氷の上に置かれます。氷上の2ミリリットルのチューブに正確な順序で各成分を追加することにより、無細胞反応マスターミックスを準備し、マスターミックスに追加するたびにチューブを静かにフリックします。マイナス80度の冷凍庫からビブリオ・ナトリーゲンの粗細胞ライセートを取り出し、解凍するまで10〜20分間氷の上に置きます。解凍した粗細胞抽出物の適切な量を無細胞反応マスターミックスに加え、ピペットを使用して穏やかに混ぜます。熱サイクラーを用いたエンドポイント無細胞タンパク質発現を行うために、まず96ウェルPCRプレートの底部のウェルごとに10マイクロリットルの無細胞反応マスターミックスを加え、各転移の間にチューブをそっとフリックしてマスターミックスを混合します。プレートを1,000回gで10秒間遠心し、井戸の側面に貼り付けられていた可能性のあるマスターミックスをプールします。そして、蒸発を防ぐためにプレート接着剤で井戸を密封します。熱い蓋を摂氏105度に設定して、摂氏26度に設定したサーモサイクラーにプレートを置きます。PCRプレート内の反応を最低3時間インキュベートした後、発現したタンパク質を精製、定量、下流工程に使用することができます。無細胞タンパク質発現キネティクスを、透明なガラス底を有する黒い384ウェルアッセイプレートの底に混ぜた無細胞反応マスターのウェルあたり10マイクロリットルのプレートリーダーピペットを使用して、キネティクスを監視する。そして、蒸発を防ぐために透明なプレート接着剤で井戸を密封します。アッセイプレートを摂氏26度に設定したプレートリーダーに入れ、発現タンパク質に対応する適切な蛍光励起/発光波長を監視しながら3〜6時間インキュベートします。このプロトコルに記載された無細胞発現系は、エンドポイントおよび運動アッセイで示されるのと同じ量の線形DNAよりも有意に高い量のタンパク質を得るプラスミドDNAテンプレートで最良の結果を達成する。インビトロ転写反応によって生成されたmRNAも使用できるが、より多くの量のmRNAが必要である。タンパク質産生の収率は、マグネシウムおよびカリウムイオンの濃度によって有意に影響を受けた。最適な条件下で最適なマグネシウムイオン濃度は3.5ミリモル、カリウムイオン用80ミリモルであることが判明した。したがって、これらの最適なイオン濃度からの偏差は、タンパク質の有意な収率を生成するために、この発現系のための容量の低下をもたらす可能性があります。氷の上にすべての試薬を保管するか、可能な限り冷たい部屋で作業することが重要です。さらに、適切かつ完全な超音波処理は、このプロトコルの成功に不可欠です。このプロトコルに従って、ユーザーは、多くの異なるタンパク質の活性を浄化し、スクリーニングするために使用することができるハイスループット形式でタンパク質を発現する能力を有する。この技術は、無細胞表現のためのユニークな特性を持つ新しい生物の使用を実証する。ビブリオ・ナトリゲンは、確立されたモデル生物で未踏のタンパク質または小分子の発現に特有の条件を提供する可能性のあるハロミリックな急速に成長する細菌である。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

出典: ワトソン、DC、 et.al。大腸菌と他の細菌からの細胞外小胞のスケーラブルな単離と精製 J. Vis. 経験。 (2021年)このビデオは、遺伝子組み換え細菌の外膜に由来する細胞外小胞(EV)の単離と濃縮を示しています。このプロセスには、細菌を培養して EV...

細菌からの外膜由来細胞外小胞の単離と濃縮

出典:Wiegand, D. J., Lee, et al., Cell-free Protein Expression Using the Rapidly Growing Bacterium Vibrio natriegens.J. Vis. Exp. (2019)このビデオでは、増殖の早い細菌である...

急速に成長する細菌ビブリオナトリゲンの培養

出典: Wiegand、DJ、 et al。急増細菌 Vibrio natriegensを用いた無細胞タンパク質の発現 J . Vis. Exp.(2019)。このビデオでは、タンパク質合成速度が高いことで知られる急速に増殖する細菌であるビ...

ビブリオナトリゲンからの粗細胞抽出物の調製

出典: Wiegand、DJ、 et al。 急速に増殖する細菌ビ ブリオナトリゲンを用いた無細胞タンパク質の発現。 J. Vis. Exp. (2019)。このビデオでは、 Vibrio natriegens 粗ライセートに基づく細菌の無細胞タンパク質発現システムを使用して、in...

細菌粗細胞抽出物を用いた無細胞タンパク質発現

エレクトロポレーションは、変換と呼ばれるプロセスで、細菌にDNAを導入するために一般的に用いられている方法である。エレクトロコンピテント細胞の調製のための伝統的なプロトコルは、時間がかかり、労働集約的である。この記事では、現在、いくつかの研究室で採用エレクトロコンピテント細胞を調製するための代替、迅速かつ効率的な方法を説明します。...

エレクトロ作成のための迅速なプロトコル<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt;と<em&gt;コレラ菌</em

フランスのプレスを用いた大腸菌の異種発現と細胞の分解によって産生される膜小胞製剤におけるプロトン駆動膜トランスポーターの特性評価方法について説明する。...

大腸菌における異種発現による膜トランスポーターの特性評価と膜小胞の産生

このプロトコルは、 エシェリヒア大腸菌...

細菌無細胞リザートの迅速、手頃な価格、および単純な生産

この研究は、 大腸菌(E.coli )からの細胞抽出物の調製とそれに続く無細胞タンパク質合成(CFPS)反応を24時間未満で記載する。無細胞自己誘導(CFAI)プロトコルの説明は、研究者の監督を減らし、得られる細胞抽出物の量を増やすために行われた改善を詳述する。...

無細胞自己誘導ワークフローを使用した24時間以内に細胞から無細胞タンパク質合成へ

細菌は、生理活性のある生体分子を運ぶナノメートルサイズの細胞外小胞(EV)を分泌します。EVの研究は、それらの生合成、微生物-微生物および宿主-微生物の相互作用および疾患における役割、ならびにそれらの潜在的な治療用途を理解することに焦点を当てています。EV研究の標準化を促進するために、さまざまな細菌からEVをスケーラブルに分離するためのワークフローが提示されます。...

大腸菌およびその他の細菌からの細胞外小胞のスケーラブルな単離および精製(英語)

本プロトコルは、細胞外膜結合小胞内にパッケージされた、典型的に不溶性またはジスルフィド結合含有タンパク質を含む組換えタンパク質の細菌産生のための詳細な方法を記載する。これは、応用バイオテクノロジーや医学など、科学研究の多様な分野に適用できる可能性があります。...

大腸菌からの組換えタンパク質充填小胞の最適生産と分析

この記事では、C41(DE3)発現系で毒性ヌクレアーゼである組換えNsp15を過剰発現し、その後、アフィニティーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを使用してタグ付きタンパク質を精製する方法論について説明します。これらのプロトコルは、他の困難な有毒タンパク質にも適応できます。...

大腸菌からの有毒ヌクレアーゼの過剰発現と精製

学ぶ Vibrio natriegens を用いた無細胞タンパク質発現法。急速に成長する細菌の粗抽出液を使い、プラスミドDNAやmRNAからタンパク質を高速合成するプロトコルです。バイオプロダクションや合成生物学の研究に応用可能です。

無細胞タンパク質式を使って急速に成長している細菌ビブリオ natriegens

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