Name: マウス気管からのブラシ細胞の単離と定量的評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 学ぶマウス気管ブラシ細胞の単離法。パパイン短時間処理とディスパーゼを用いて上皮を分離し、高生存率で細胞を回収。RNAシーケンスによる転写解析や気道上皮の機能研究に応用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ブリガムと女性の人間免疫学センターフローコアのアダム・チコインに感謝します。この研究は、国立衛生補助金研究所R01 HL120952(N.A.B.)、R01 AI134989(N.A.B)、U19 AI095219(N.A.B.、 L.G.B)、K08 AI132723(L.G.B)、および米国アレルギー・喘息・免疫学アカデミー(AAAAI)/アメリカ肺アレルギー呼吸器疾患賞(N.A.B.)、AAAAI財団教員育成賞(L.G.B.)、スティーブン・アンド・ジュディ・ケイ・ヤング・イノベーター賞(N.A.B.)、ジョイスリン・C・オースティン女性医師のキャリア開発基金(L.G.B.)、およびヴィニク家(L.G.B.)による寛大な寄付。

以下の実験を行う前に、すべての動物ケアの使用とプロトコルが機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認され、国家研究評議会の「ケアと使用に関するガイド」に従って実施されることを確認してください。実験動物」( 第8版、2011年)とARRIVEガイドライン。以下に説明するすべての手順は、ブリガム・アンド・ウィメンズ病院の施設動物ケア・使用委員会によって審査され、承認されています。
1. 試薬の調製
<ol><li>16 Μ/mLディスパーゼと20 μg/mL DNase I.を含むPBS溶液であるジスパーゼ消化液を調べ、37°Cの水浴で溶液を温める前に、ディスパーゼ粉末が完全に溶解していることを確認してください。</li>
	<li>5%熱不活性化胎児ウシ血清(FBS)をダルベッコ改変イーグルミディアム(DMEM)に加えて停止液を作ります。</li>
	<li>タイロードIバッファーを準備する:カルシウムなしでHEPES-Tyrodeのバッファーに26 U/mLパパイン(48 U/mgパパイン溶液の20 μL/mL)と10 μL/mL L-システインを追加します。</li>
	<li>タイロードIIバッファーを準備する:カルシウムを含むHEPES-Tyrodeのバッファーに2 μL/mLルペプチン(5mg/mL)を追加します。</li>
	<li>FACSバッファーを準備する:カルシウム、マグネシウム&フェノールレッドを含まないハンクスのバランス塩溶液(HBSS)を使用し、2mMエチレンディアミンテトラセチン酸(EDTA)を補充し、2%FBSを追加します。</li>
</ol>2. マウス気管の解剖
注:このプロトコルで使用されるマウスは、ChAT(BAC)-eGFP(B6)である。Cg-Tg(RP23- 268L19-EGFP)2Mik/J、男女ともに生後3~6ヶ月。eGFPの光漂白を減らすために直接光への組織の露出を最小にする。
<ol><li>100 mg/kg のペントバルビタール安楽死溶液を経内に注入するか、IACUC によって承認された標準プロトコルを使用してマウスを安楽死させます。</li>
	<li>上下の四肢を拡張した21G針で、外科用ボード上のマウスを固定します。70%のEtOHで毛皮をスプレーし、地域を消毒します。</li>
	<li>まっすぐな鉗子を使用して、腹部の皮膚と毛皮を持ち上げ、解剖はさみで中央に切開を行います(まっすぐなはさみ、3センチメートル)。はさみを使用して、皮下組織から腹部からマンディブラに皮膚を分離する。皮下組織を鉗子で持ち上げながら、腹壁の中央にはさみで小さな切開を行う。</li>
	<li>V字型切開で下膜を開きます。鉗子を使用して、小腸を横にそっと動かし、腹部大動脈と静脈カバを見つけ、解剖はさみで切開を行い、急速な排泄を可能にする。</li>
	<li>ダイヤフラムを見つけます。18Gの針を使用して、肺を脱脂するために胸骨のすぐ下の横隔膜に開口部を作る。鋭い尖ったまっすぐな解剖はさみを使用して肋骨のケージから慎重にダイヤフラムを分離し、リブの基部に沿って切断します。</li>
	<li>鉗子を使用して、胸骨の露出した端を持ち上げ、胸骨を肋骨ケージの基部から首まで縦方向に切ります。短いまっすぐなはさみ(2 cm)で中央頸部切開を行い、顎下腺の2つの葉を分離する。</li>
	<li>周囲の結合組織と胸腺を慎重に取り除き、高精度鉗子のペアでカリーナを覆います。</li>
	<li>気管を最初に喉頭蓋のレベルで分離し、次に気管の分岐のレベルで遠位端を解剖することによって、気管を自由に解剖する。</li>
	<li>喉頭蓋を見つけ、気管を喉頭蓋からカリーナまで縦方向に切る。</li>
</ol>3. 気管上皮消化
<ol><li>気管を予温めた750 μL(37°C)の消化液を含む1.5mLチューブに入れます。200rpmでシェーカーで40分間、室温でインキュベートします。直接光への露出を減らすためにアルミ箔でチューブをカバーします。</li>
	<li>反応を止めるために5%FBSで750 μLの冷たいDMEMを加えます。氷の上に置け</li>
	<li>気管をペトリ皿(100mm x 15mm)に移し、解剖顕微鏡の下に置きます。上皮側を上向きにして気管の向きをします。縦方向に解剖された気管は、軟骨リングによって維持される半円筒形を有する。上皮は凹面にある。</li>
	<li>ペトリ皿にまっすぐな鉗子と気管の喉頭蓋領域をテザーし、サイズ22使い捨てメスを使用して、気管から上皮を掻き取る。上皮層は半透明シートとして分離する。</li>
	<li>メスで上皮をミンチします。上皮層を2mLチューブに移します。</li>
	<li>750 μLのタイロデIバッファーでペトリ皿をすすいで、上皮層を含む2mLチューブに移します。</li>
	<li>タイロードIの気管上皮層を200rpmでシェーカーで37°Cで30分間緩衝する。直接光への露出を減らすためにアルミ箔でチューブをカバーします。</li>
	<li>コールドタイロデIIバッファの750 μLを追加します。消化された組織を20~30秒間激しく渦にし、18G針に10回取り付けた注射器で同質をトリビュートする。 21 Gゲージ針に切り替え、さらに10~20回トリビュートします。</li>
	<li>100 μm のストレーナーを通して 50 mL 円錐管にセルをろ過します。コールド FACS バッファーの 30:1 vol/vol を追加します。</li>
	<li>350 x gで4°Cで10分間スピンし、上清を廃棄します。冷たいFACSバッファーでペレットを再懸濁し、12 mm x 75 mm (5 mL) ポリスチレンチューブにサスペンションを移します。4°Cで10分間350 x gで再び回転し、上清を廃棄します。</li>
	<li>FACSバッファーの100 μLでペレットを再中断します。</li>
	<li>抗マウスCD16/32ブロッキング抗体を1μL添加して非特異的結合を遮断し、氷上で15分間インキュベートします。洗わなく。</li>
	<li>次の抗体とそれぞれのアイソタイプコントロールを追加: 太平洋青色の抗マウス CD45 またはラット IgG2a, k (0.25 μg/106細胞 100 μL 容積) とアロフィコシアニン (APC) 抗マウス EpCAM またはラット IgG2b, k (0.5 μg/106細胞 100 μL ボリューム)モノクローナル抗体。直接光から保護された氷の上で45分間インキュベートします。冷たいFACSバッファーの4.5 mLを追加し、4°Cで10分間350 x gで混合し、スピンします。FACSバッファを破棄し、低温FACSバッファの300 μLでペレットを再中断します。</li>
	<li>フローサイトメトリックソートの直前にヨウ化プロピジウム(PI)(5 μg/mL)を加えます。 注:ブラシセルは、フィルタへの付着性を高める可能性のあるいくつかのプロセスを持つ不規則な形状を持っています (図 3C)。私たちは、30ミリメートル70ミリメートルと100ミリメートルフィルタを比較し、より大きな細孔フィルタは、より良い収率を確保することを発見しました。また、パパイン消化後の細胞懸濁液の完全なトリチュレーションは、ブラシ細胞収率を有意に向上させる。初期トリチュレーションには18G針を使用し、その後、細胞の細かい解離のために小さなボア(21または23Gの針)を使用することをお勧めします。</li>
</ol>4. フローサイトメトリーゲーティング戦略
<ol><li>前方および側面散乱角度によって破片から細胞を識別します。前方散布の高さと幅、側面散布の高さと幅を使用して、二重線を除外します。doublet は、幅の高い値を持つセルです。</li>
	<li>単一のセル内で、PI 陰性の母集団として生細胞を識別します。</li>
	<li>生きている単一細胞内で、アイソタイプコントロールに基づいて低から負の細胞にCD45を同定する。</li>
	<li>CD45の低/負の細胞内で、eGFP陽性であるEpCAM陽性細胞を同定する(FITCチャネル内)。これはブラシセルの集団です(図2A)。</li>
</ol>

<ol><li>Tizzano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal+chemosensory+cells+use+bitter+taste+signaling+to+detect+irritants+and+bacterial+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nasal chemosensory cells use bitter taste signaling to detect irritants and bacterial signals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 3210-3215 (2010).</li>
<li>Genovese, F., Tizzano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvillous+cells+in+the+olfactory+epithelium+express+elements+of+the+solitary+chemosensory+cell+transduction+signaling+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Microvillous cells in the olfactory epithelium express elements of the solitary chemosensory cell transduction signaling cascade.</a> PLoS One. 13 (9), 0202754(2018).</li>
<li>Bankova, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cysteinyl+leukotriene+3+receptor+regulates+expansion+of+IL-25-producing+airway+brush+cells+leading+to+type+2+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">The cysteinyl leukotriene 3 receptor regulates expansion of IL-25-producing airway brush cells leading to type 2 inflammation.</a> Science Immunology. 3 (28), (2018).</li>
<li>Krasteva, G., Canning, B. J., Papadakis, T., Kummer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+brush+cells+in+the+trachea+mediate+respiratory+responses+to+quorum+sensing+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cholinergic brush cells in the trachea mediate respiratory responses to quorum sensing molecules.</a> Life Sciences. 91 (21-22), 992-996 (2012).</li>
<li>Nadjsombati, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Succinate+by+Intestinal+Tuft+Cells+Triggers+a+Type+2+Innate+Immune+Circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Detection of Succinate by Intestinal Tuft Cells Triggers a Type 2 Innate Immune Circuit.</a> Immunity. 49 (1), 33-41 (2018).</li>
<li>von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuft-cell-derived+IL-25+regulates+an+intestinal+ILC2-epithelial+response+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit.</a> Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).</li>
<li>Deckmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bitter+triggers+acetylcholine+release+from+polymodal+urethral+chemosensory+cells+and+bladder+reflexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bitter triggers acetylcholine release from polymodal urethral chemosensory cells and bladder reflexes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8287-8292 (2014).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Members+of+Bitter+Taste+Receptor+Cluster+Tas2r143%2FTas2r135%2FTas2r126+Are+Expressed+in+the+Epithelium+of+Murine+Airways+and+Other+Non-gustatory+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Members of Bitter Taste Receptor Cluster Tas2r143/Tas2r135/Tas2r126 Are Expressed in the Epithelium of Murine Airways and Other Non-gustatory Tissues.</a> Frontiers in Physiology. 8, 849(2017).</li>
<li>Krasteva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+chemosensory+cells+in+the+auditory+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cholinergic chemosensory cells in the auditory tube.</a> Histochemistry and Cell Biology. 137 (4), 483-497 (2012).</li>
<li>Krasteva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+chemosensory+cells+in+the+trachea+regulate+breathing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cholinergic chemosensory cells in the trachea regulate breathing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9478-9483 (2011).</li>
<li>Montoro, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+airway+epithelial+hierarchy+includes+CFTR-expressing+ionocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes.</a> Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).</li>
<li>Plasschaert, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+atlas+of+the+airway+epithelium+reveals+the+CFTR-rich+pulmonary+ionocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte.</a> Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).</li>
<li>Dwyer, D. F., Barrett, N. A., Austen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+Genome+Project%2C+C.+Expression+profiling+of+constitutive+mast+cells+reveals+a+unique+identity+within+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunological Genome Project, C. Expression profiling of constitutive mast cells reveals a unique identity within the immune system.</a> Nature Immunology. 17 (7), 878-887 (2016).</li>
<li>Howitt, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuft+cells%2C+taste-chemosensory+cells%2C+orchestrate+parasite+type+2+immunity+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut.</a> Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).</li>
<li>Bankova, L. G., Dwyer, D. F., Liu, A. Y., Austen, K. F., Gurish, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+mast+cell+progenitors+to+mucosal+mast+cells+during+allergic+pulmonary+inflammation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Maturation of mast cell progenitors to mucosal mast cells during allergic pulmonary inflammation in mice.</a> Mucosal Immunology. 8 (3), 596-606 (2015).</li>
<li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li>
<li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+stromal+populations+contribute+to+pulmonary+fibrosis+without+evidence+for+epithelial+to+mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 1475-1483 (2011).</li>
<li>Gerbe, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+tuft+cells+initiate+type+2+mucosal+immunity+to+helminth+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites.</a> Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).</li>
<li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+protein+16A+%28TMEM16A%29+is+a+Ca2%2B-regulated+Cl-+secretory+channel+in+mouse+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transmembrane protein 16A (TMEM16A) is a Ca2+-regulated Cl- secretory channel in mouse airways.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (22), 14875-14880 (2009).</li>
<li>Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin+cleaves+exclusively+C-terminal+to+arginine+and+lysine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).</li>
<li>Verma, S., Dixit, R., Pandey, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine+Proteases%3A+Modes+of+Activation+and+Future+Prospects+as+Pharmacological+Targets%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cysteine Proteases: Modes of Activation and Future Prospects as Pharmacological Targets.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 107(2016).</li>
<li>Huettner, J. E., Baughman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+identified+neurons+from+the+visual+cortex+of+postnatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats.</a> Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).</li>
<li>Kaiser, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociated+neurons+and+glial+cells+derived+from+rat+inferior+colliculi+after+digestion+with+papain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dissociated neurons and glial cells derived from rat inferior colliculi after digestion with papain.</a> PLoS One. 8 (12), 80490(2013).</li>
<li>Aoyagi, T., Takeuchi, T., Matsuzaki, A., Kawamura, K., Kondo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leupeptins%2C+new+protease+inhibitors+from+Actinomycetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antibiotics+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Leupeptins, new protease inhibitors from Actinomycetes.</a> Journal of Antibiotics (Tokyo). 22 (6), 283-286 (1969).</li>
<li>Kohanski, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solitary+chemosensory+cells+are+a+primary+epithelial+source+of+IL-25+in+patients+with+chronic+rhinosinusitis+with+nasal+polyps%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Solitary chemosensory cells are a primary epithelial source of IL-25 in patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (2), 460-469 (2018).</li>
<li>Patel, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solitary+chemosensory+cells+producing+interleukin-25+and+group-2+innate+lymphoid+cells+are+enriched+in+chronic+rhinosinusitis+with+nasal+polyps%5BTitle%5D)+AND+%22International+Forum+of+Allergy+%26+Rhinology%22%5BJournal%5D)">Solitary chemosensory cells producing interleukin-25 and group-2 innate lymphoid cells are enriched in chronic rhinosinusitis with nasal polyps.</a> International Forum of Allergy & Rhinology. , (2018).</li>
<li>Kouzaki, H., O'Grady, S. M., Lawrence, C. B., Kita, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteases+induce+production+of+thymic+stromal+lymphopoietin+by+airway+epithelial+cells+through+protease-activated+receptor-2%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Proteases induce production of thymic stromal lymphopoietin by airway epithelial cells through protease-activated receptor-2.</a> The Journal of Immunology. 183 (2), 1427-1434 (2009).</li>
<li>Cambier, J. C., Vitetta, E. S., Kettman, J. R., Wetzel, G. M., Uhr, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+tolerance.+III.+Effect+of+papain-mediated+cleavage+of+cell+surface+IgD+on+tolerance+susceptibility+of+murine+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">B-cell tolerance. III. Effect of papain-mediated cleavage of cell surface IgD on tolerance susceptibility of murine B cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 146 (1), 107-117 (1977).</li>
<li>Nishikado, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine+protease+antigens+cleave+CD123%2C+the+alpha+subunit+of+murine+IL-3+receptor%2C+on+basophils+and+suppress+IL-3-mediated+basophil+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Cysteine protease antigens cleave CD123, the alpha subunit of murine IL-3 receptor, on basophils and suppress IL-3-mediated basophil expansion.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (2), 261-266 (2015).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

我々は、40分間の高用量ジスパーゼ治療の組み合わせと短いパパイン治療(30分)が気管消化およびブラシ細胞分離に最適なプロトコルを提供することを見出した。この組み合わせは、広範な消化を回避し、代替プロトコルと比較して、ブラシ細胞の最高収率を生成します。
血行細胞を抽出する肺消化は、古典的にコラゲナーゼIV15のような軽度の消化酵素に依存しているが、上皮細胞の単離には、より複雑なプロトコルが必要である。上皮細胞の単一細胞懸濁液は、互いに結合する接合部と地下膜、および細胞自体の脆弱さのために達成することがより困難です。上皮細胞消化のためのほとんどのプロトコルは、2つのステップを伴う - 最初のステップは、地下膜から上皮を分離し、その後のステップは、上皮細胞を互いに付着させるタイトなジャンクションとデスモソームを妨害する後のステップです。16歳,17.
いくつかのグループ...

ブラシ細胞は、苦味受容体および味覚芽細胞に見られる味覚受容体伝達機構の発現を特徴とする化学感覚上皮細胞のクラスに属する。味覚芽細胞とは異なり、化学感覚上皮細胞は上皮表面に散乱し、鼻上皮1、2、気管内のブラシ細胞中の孤独な化学感覚細胞(SCC)および微小絨毛細胞と呼ばれる。腸内の3、4、およびタフト細胞5、6.苦味受容体および苦味伝達機構を発現する上皮細胞は、尿道7、8および聴覚管9にも見出される。気道ブラシ細胞は、神経原性および免疫気道応答にユニークな機能を有する。彼らは、苦い化合物とクォーラム感知物質のような細菌代謝物で活性化時に保護呼吸反射を呼び起こすアセチルコリン産生化学感覚細胞です 10.気道ブラシ細胞はまた、気道3のエアロアレルゲン引き出された2型炎症を調節するIL-25の支配的な気道上皮源である。
下部気道ブラシ細胞の完全な転写物の特徴付けおよび環境刺激への応答は、気管上皮の低い数および大きな気管支10を超える非常に限られた数によって制限されている。腸上皮からの化学感覚細胞の単離に使用される技術は、おそらく神経終末10または他の気管ブラシ細胞の親密な接触のために、気管から比例して高い数を得ていない付着物およびタイトジャンクションタンパク質の組成のような呼吸粘膜における組織特異的因子。単一細胞RNAシーケンシング分析のためのより高い数で気管ブラシ細胞の分離に成功した最近の報告は、パパインとの2時間インキュベーションまたはプロナス11、12との18時間インキュベーションのいずれかを採用した。消化酵素を用いたより長いインキュベーションは細胞の生存率を低下させ、消化された組織13からの細胞の転写プロファイルを変化させることができるので、これは他の化学感覚上皮集団との比較分析に偏りを与える可能性がある。
ここでは、RNAシーケンシング3に対する気管ブラシ細胞の単離方法を報告する。高用量ジスパーゼによる気管の治療は、上皮を粘膜下から分離する。パパインとの上皮シートのその後の消化は、この構造細胞の優れた回復を可能にする。

<table><tbody><tr><td>抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗GFP(ポリクローナルヤギIg)</td><td>アブカム</td><td>キャット#ab5450</td><td></td></tr><tr><td>APC抗マウスCD326(EpCAM)&nbsp;(G8.8)</td><td>バイオレジェンド</td><td>ネコ#118214</td><td></td></tr><tr><td>APC ラット IgG2a, k アイソタイプコントロール</td><td>バイオレジェンド</td><td>ネコ#400511</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>バイオレジェンド</td><td>ネコ#422801</td><td></td></tr><tr><td>ロバ抗ヤギ IgG (H+L) 高交差吸着二次抗体 Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies/Molecular Probes</td><td>ネコ#A-11055</td><td></td></tr><tr><td>正常ヤギ IgG</td><td>R&D Systems</td><td>cat#AB-108-C</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Blue anti-mouse CD45 (30F-11)</td><td>Biolegend</td><td>cat#103126</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Blue Rat IgG2b, k isotype control</td><td>Biolegend</td><td>cat#400627</td><td></td></tr><tr><td>TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody</td><td>Biolegend</td><td>cat#101320</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>の猫#17105041&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>cat# 10104159001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES-Tyrode'カルシウムを含まないバッファー(10 mM HEPES、135 mM NaCl、2.8 mM KCl、1 mM MgCl2、12 mM NaHCO3、0.4 mM NaH2PO4、0.25% BSA、5.5 mM グルコース。18.2メガオームの水で調製し、0.22&microでろ過します。mフィルター</td><td>ボストンバイオプロダクツ</td><td>cat# PY-912</td><td></td></tr><tr><td>Tyrode's溶液(HEPES緩衝)140 mM NaCl、5 mM KCl、25 mM HEPES、2 mM CaCl2、2 mM MgCl2および10 mMグルコース。18.2メガオームの水で調製し、0.22&microでろ過します。mフィルター。)</td><td>Boston BioProducts</td><td>cat# BSS-355</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma</td><td>cat# C7352</td><td></td></tr><tr><td>ロイペプチン トリフルオロ酢酸塩</td><td>Sigma</td><td>cat# L2023</td><td></td></tr><tr><td>パパイン産 ラテックス</td><td>Sigma</td><td>cat# P3125</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>cat# P4170</td><td></td></tr><tr><td>実験モデル: 生物/菌株</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChATBAC-eGFP (B6.CG-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J)</td><td>ジャクソン研究所</td><td>7902</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 800 with Airyscan confocal system&nbsp;&nbsp;ツァイス アクシオ オブザーバー Z1 倒立顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa</td><td>BD</td><td>647465</td><td></td></tr><tr><td><ストロング>ディスポーザブル 機器</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 滅菌チューブ</td><td>トーマス サイエンティフィック</td><td>1157C86</td><td></td></tr><tr><td>5 mL ポイステレン丸底チューブ、12 mm x 75 mm スタイル</td><td>ファルコン</td><td>14-959-1A</td><td></td></tr><tr><td>50 mLポリプロピレン円錐管、30 mm x 115 mmスタイル</td><td>ファルコン</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>フェザー使い捨てメス no.12</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC9999403</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿、100 mm x 15 mmスタイル</td><td>ファルコン</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>滅菌細胞ストレーナー、100 &mu;m</td><td>フィッシャーブランド</td><td>キャット#22363549</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス気管からのブラシ細胞の単離と定量的評価

Isolation and Quantitative Evaluation of Brush Cells from Mouse Tracheas

気管ブラシ細胞は、気道内腔から免疫系および神経系に信号を伝達する準備ができているコリン作動性化学感覚上皮細胞である。それらは、腸粘膜のタフト細胞、気管のブラシ細胞、鼻粘膜の孤独な化学感覚および微小絨毛細胞を含む化学感覚上皮細胞のファミリーの一部である。異なる上皮区画の化学感覚細胞は、主要な細胞内マーカーとコア転写部特質を共有するが、局所組織環境を反映する可能性が高い重要な転写不均一性も示す。単一細胞懸濁液からの気管ブラシ細胞の単離は、これらのまれな上皮細胞の機能を詳細に定義する必要があるが、それらの分離は、気管ブラシ細胞と神経終末との間の密接な相互作用のために、潜在的に困難である。またはタイトで接着接点の気道固有の組成物に起因する。ここでは、マウス気管上皮からブラシ細胞を単離する手順について説明する。この方法は、管下上皮の初期分離に基づいており、パパインを用いて上皮シートのその後の短いインキュベーションを可能にする。この手順は、生存可能な気管ブラシ細胞のフローサイトメトリックソートおよび機能解析のための迅速かつ便利なソリューションを提供します。

この手順は、RNA シーケンシング3の気管ブラシ 細胞を分離するために正常に実装されています。2段階プロトコル(図1)で気管を単離し、組織を消化した後、細胞を収集し、PIで死んだ細胞を排除した後に蛍光標識CD45およびEpCAMで染色した。前方および側面散乱特性に基づいて二重化を行った後、ブラシセルをCD45の場合は低/負、EpCAMでは正、eGFPでは陽性(図2A)と定義した。ブラシ細胞は、流量細胞メトリーによりCD45低/ネグ細胞の約0.16〜0.42%を表し、気管当たり250〜600細胞を占めた(図2B)。これらのカウントを、ChAT(BAC)-eGFPマウスからの気管マウント全体におけるChAT-eGFP陽性細胞数の推定値と比較し、我々が公表した気管ブラシ細胞3の広範な免疫組織学的評価<sup ...

ブラシ細胞は、ナイーブマウス気管に見られる稀なコリン作動性化学感覚上皮細胞である。その限られた数のために、気道免疫および改造におけるその機能的役割のex vivo評価は困難である。フローサイトメトリーによる気管ブラシ細胞の単離方法について述べた。

Tracheal brush cells are cholinergic chemosensory epithelial cells poised to transmit signals from the airway lumen to the immune and nervous systems. ...

我々は、コリンアセチルトランスバシラーゼ蛍光レポーターマウスからの稀な特殊化学感覚上皮細胞、気管ブラシ細胞の単離のための手順を開発した。この方法は、粘膜下膜からの気管上皮の初期分離に基づいており、その後のパパインによる上皮シートの短いインキュベーションを可能にする。これは気管ブラシ細胞の強い回復を可能にし、RNAシーケンシングによるブラシ細胞の分離および転写分析に成功して使用された。消化酵素による長いインキュベーションは、細胞の生存率を低下させ、組織から分離された細胞の転写プロファイルを変化させる可能性があります。ここでは、気管上皮をディスパスで分離し、その後、実行可能なブラシ細胞の高収率を生成する短時間パパインとそれをインキュベートします。我々の方法は、上気道上皮の研究に貢献することができます。同じプロトコルは、鼻組織などの他の粘膜部位からブラシ細胞を単離するために適用することができる。私たちの非常に再現性の高い技術のデモンストレーションは、ピアサイエンティストが気管ブラシ細胞を分離し、さらに調査することを可能にします。この手順を開始するには、ディスパーゼとDNase IをPBSに加え、ここで示す最終濃度で、ディスパーゼ消化溶液を調製します。37°Cの水浴で溶液を温める前に、ディスパーゼパウダーが完全に溶解していることを確認してください。次に、DMEMに5%熱不活化FBSを加えて、停止溶液を準備します。タイローデIバッファを準備するには、カルシウムなしでHEPESタイロードのバッファにパパインとLシステインを追加します。タイローデIIバッファーを調製するには、1ミリリットル当たり2マイクロリットルの濃度でカルシウムなしでHEPESタイローデのバッファーにロイペプチンを追加します。FACSバッファーを調製するには、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドを2ミリモルEDTAと2%FBSで補うことなく、ハンクのバランス塩溶液を使用してください。マウスを安楽死させた後、21ゲージの針を使用して、上肢と下肢を拡張したスーピン位置の外科用ボードに固定します。毛皮に70%エタノールを吹き付けて、その地域を消毒します。ストレート鉗子を使用して、腹部の皮膚と毛皮を持ち上げ、中央に切開を行うためにはさみを解剖を使用します。はさみを使用して、皮膚を皮下組織から腹部からマンディブラに分離する。皮下組織を鉗子で持ち上げながら、腹壁の中央にはさみで小さな切開をする。その後、V字型の切開で腹膜を開きます。鉗子を使用して、小腸をそっと横に動かします。腹部大動脈と大静脈を見つけ、急速な興奮を可能にするために解剖ハサミで切開を行います。ダイヤフラムを見つけます。18ゲージ針を使用して、胸骨のすぐ下の横隔膜に開口部を作り、肺を収縮させる。鋭利な尖ったまっすぐな解剖ハサミを使用して、肋骨のベースに沿って切り取り、ダイヤフラムを胸部から慎重に分離します。鉗子を使用して胸骨の露出端を持ち上げ、胸骨を胸部の基部から首まで縦方向に切断します。短いストレートハサミを使用して、中央の子宮頸部切開を行い、顎下腺の2つのローブを分離します。この後、細かい点の高精度鉗子のペアを使用して、周囲の結合組織とカリナの上に位置する胸腺を慎重に取り除きます。最初に喉頭蓋のレベルで近位端を分離し、気管の分岐のレベルで遠位端を解剖することによって気管を自由に解剖する。喉頭蓋を見つけ、喉頭蓋からカリーナまで縦方向に気管を切ります。まず、気管を摂氏37度に予め温めた750マイクロリットルのディスパーゼ消化液を含む1.5ミリリットルのチューブに入れる。チューブをアルミホイルで覆い、直接光への露出を減らし、200 RPMのシェーカーと室温で40分間インキュベートします。その後、反応を停止し、氷の上にチューブを置くために5%FBSでDMEMの750マイクロリットルを追加します。気管をペトリ皿に移します。上皮側を上を向いて気管を向け。縦方向に解剖された気管は、軟骨環によって維持される半円筒形を有する。上皮は凹面にある。ストレート鉗子を使用して、気管の喉頭蓋領域をペトリ皿にテザーし、サイズ22の処分メスを使用して気管から上皮を削り取ります。上皮層は半透明のシートとして分離する。メスを使用して上皮をミンチし、上皮層を2ミリリットルチューブに移します。750マイクロリットルのタイロードIバッファーでペトリ皿をすすいで、上皮層を含むチューブに移します。チューブをアルミホイルで覆い、直接光への露出を減らし、200 RPMのシェーカーで37°Cで30分間インキュベートします。その後、750マイクロリットルの冷たいタイローデIIバッファーを加えます。消化した組織を20〜30秒間激しく渦化させる。18ゲージ針に取り付けられた注射器を使用して、ホモジネートを10回トリチュレートする。この後、21ゲージの針に切り替え、さらに10〜20回トリチュレートします。100マイクロメートルのストレーナーを通して50ミリリットルの円錐管に細胞をフィルターします。冷たい FACS バッファを 30 対 1 の体積比で追加します。350倍gで遠心分離機、摂氏4度で10分間。上清を捨て、冷たいFACSバッファー内のペレットを再中断します。この懸濁液を12~75ミリのポリスチレンチューブに移します。350倍gで再び遠心分離機、摂氏4度で10分間。上清を捨て、100マイクロリットルのFACSバッファーにペレットを再懸濁します。次に、非特異的結合をブロックし、氷上で15分間インキュベートするために、抗マウスCD1632ブロッキング抗体を1マイクロリットル加えます。次に、テキストプロトコルで概説されているように、それぞれのアイソタイプコントロールに抗体を追加します。直接光から保護しながら、氷の上で45分間インキュベートします。この後、4.5 ミリリットルのコールド FACS バッファーを追加し、ミックスします。350倍gと摂氏4度で遠心分離機。上清を捨て、冷たいFACSバッファーの300マイクロリットルにペレットを再懸濁します。フローサイトメトリックソートの直前にヨウ化プロピジウムを添加します。本研究では、ChAT eGFPアセチルコリン蛍光レポーターマウスの気管ブラシ細胞がRNAシーケンシングのために正常に単離されている。細胞は前方および側面の散乱角度によって破片から識別される。ダブルは前方散乱の高さ、幅、横のスキャッタの高さと幅を使用して除外されます。倍精度浮動小数点数は、幅の値が高いセルです。単一細胞内では、生細胞はヨウ化プロピジウム陰性の集団として同定される。生きた単一細胞内では、低から負の細胞のCD45は、アイソタイプコントロールに基づいて同定される。CD45低負細胞内では、FITCチャネルでeGFP陽性でもあるEpCAM陽性細胞がブラシ細胞の集団である。ブラシ細胞数は、微生物代謝物および原生動物への暴露によって変化し、したがって、機関微生物叢の変動を反映する。そこで、蛍光顕微鏡によるブラシ細胞数を推定し、フローサイトメトリックソートによって予想される単離されたブラシ細胞の数を測定することを提案する。気管の上皮層が分離したブラシ細胞の収量を決定する場合は、適切に分離してください。単離された気管ブラシ細胞は、RNAシーケンシング、細胞培養および機能解析などの幅広いアッセイに使用できます。

isolation-quantitative-evaluation-brush-cells-from-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

肺上皮細胞は、マウスの気道から分離し、差別化された呼吸上皮のモデルとしての気液界面で培養することができます。プロトコルは、分離培養し、この環境毒素への分子応答を研究するために、たばこの主流煙にこれらの細胞を露出させるための記述されています。...

エアー液界面におけるマウスの呼吸器上皮細胞と実験たばこの煙への暴露の分離

マウス肺樹状細胞の高度に精製された調製物が記載されている。特定の重点は、従来の樹状細胞サブセットの分離に与えられます。...

マウス肺樹状細胞の分離

トランスジェニックマウスは、遺伝子に生理的機能をascribingで非常に有用であった。一般的にこのような、研究、気道の機能的研究として、具体的には、マウスモデルに向かって顕著シフトを受けています。ここでのプロトコルを提供する...

マウスを用いた気管狭窄のin vitroでの測定で

ここでは、マウスの気管から基礎および粘膜下腺管細胞を単離するための我々のプロトコルを示しています。また、作成するために背マウス脂肪パッドに幹細胞を注入する方法を実証...

マウス気管から基底細胞および粘膜下腺管細胞の単離

我々は、フローサイトメトリーのネガティブ選択による一次マウスII型肺胞上皮細胞（AECII）の迅速な単離を記述している。これらAECIIは高い生存率と純度を示し、そのような自己免疫疾患や感染症などの呼吸器疾患におけるそれらの役割に関する機能と分子生物学的研究の広い範囲のために適しています。...

機能と分子生物学的研究のためのプライマリマウスII型肺胞上皮細胞のフローサイトメトリ分離

気道繊毛運動と繊毛生成されたフローをマウス気管を使用して可視化し、定量化するための簡単​​で信頼性の高い技術が記載されている。この技術は様々な要因が薬理学的薬剤、遺伝的要因、環境曝露、及び/又は粘液負荷などの機械的要因を含む、繊毛運動性にどのように影響するかを決定するために変更することができる。...

齧歯気道上皮における繊毛の運動性の高分解能イメージングのためのex vivo法

病原体感染に対する宿主の免疫応答が厳密に調節されたプロセスである。マウスにおけるリポ多糖肺露光モデルを利用し、それは疾患の病因に関連付けられている複雑な機構の高解像度の評価を実施することができる。...

マウスにおける宿主の免疫応答を評価する口腔咽頭気管内PAMP管理および気管支肺胞の活用

喉頭気管狭窄は、気管気道を重大に狭くし、効果的な医療療法を欠く病理学的瘢痕沈着から生じる。PLLA-PCL(70%ポリL-ラクチドおよび30%ポリカプロラクトン)ステントを局所薬物送達システムとして用いて、気管内の瘢痕増殖を減少させることを目的とした潜在的な治療法を検討することができる。...

喉頭気管狭窄を伴うマウスにおける生体適合性薬物溶出気管ステントの設計

ここでは、マウス気道上皮細胞を単離および分化するための in vitro...

タバコ煙抽出物で刺激したマウス気道上皮細胞上のマルチオミクスの分化と変化を研究するためのin vitroモデル

ここでは、非侵襲的でリアルタイムの全身プレチスモグラフィー(WBP)システムを使用した咳の測定と、マウスの組織サンプルを採取するための標準的な手順について説明し、気道の炎症を評価するためのいくつかの方法を紹介します。...

マウスにおける咳嗽および気道炎症の検出方法

このプロトコルは、三ヨウ化物ベースの化学発光アッセイを用いて頂端分泌中の亜酸塩を測定することで、気道上皮培養中の一酸化窒素(NO)産生を定量化する方法を説明しています。...

マウス気管上皮細胞培養中の一酸化窒素生成の測定 空気と液体界面で分化

学ぶマウス気管ブラシ細胞の単離法。パパイン短時間処理とディスパーゼを用いて上皮を分離し、高生存率で細胞を回収。RNAシーケンスによる転写解析や気道上皮の機能研究に応用可能です。

マウス気管からのブラシ細胞の単離と定量的評価

さらに動画を探す