Name: 共転写RNA処理イベントを解剖するための人工RNAポリメラーゼII伸長複合体 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 学ぶ RNAポリメラーゼII伸長複合体の組み立て法。合成DNA・RNAオリゴヌクレオチドと磁気ビーズを用いて、転写とRNAキャッピングの機能的結合を研究する簡便な実験系を構築する方法です。

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私たちは、哺乳類キャッピング酵素cDNAを提供してくれたS.シューマンに感謝します。この研究は、グレーター・カンザスシティ・コミュニティ財団のヘレン・ネルソン医学研究基金からのスタワーズ医学研究所への助成金によって一部支援されました。 この原稿の根底にある元のデータは、http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434のスタワーズオリジナルデータリポジトリからアクセスできます。

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<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+5-carboxycytosine+recognition+by+RNA+polymerase+II+elongation+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex.</a> Nature. 523 (7562), 621-625 (2015).</li>
<li>Martinez-Rucobo, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Basis+of+Transcription-Coupled+Pre-mRNA+Capping%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular Basis of Transcription-Coupled Pre-mRNA Capping.</a> Molecular Cell. 58 (6), 1079-1089 (2015).</li>
<li>Mandal, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interactions+of+RNA-capping+enzyme+with+factors+that+positively+and+negatively+regulate+promoter+escape+by+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Functional interactions of RNA-capping enzyme with factors that positively and negatively regulate promoter escape by RNA polymerase II.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101, 7572-7577 (2004).</li>
<li>Chiu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tat+stimulates+cotranscriptional+capping+of+HIV+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA.</a> Molecular Cell. 10 (3), 585-597 (2002).</li>
<li>Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+paused+transcription+complex+Pol+II-DSIF-NELF%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF.</a> Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).</li>
<li>Vos, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+activated+transcription+complex+Pol+II-DSIF-PAF-SPT6%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6.</a> Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).</li>
<li>Kujirai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+the+nucleosome+transition+during+RNA+polymerase+II+passage%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage.</a> Science. 362 (6414), 595-598 (2018).</li>
<li>Szychowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavable+biotin+probes+for+labeling+of+biomolecules+via+azide-alkyne+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

RNA処理や転写伸長自体の調節などのPol II伸長複合体に結合した事象を解剖しようとする研究は、高度に精製された酵素系を用いることによって大いに促進することができる。このような酵素システムの設定は困難な場合があります。Pol IIによるプロモーター依存転写には、少なくとも5つの一般的な転写因子が必要である。これらの要因の準備と備蓄には数ヶ月かかる場合があります。したがって、このプロセスにおけるレート制限ステップは、多くの場合、試験管内の基底転写を再構成するために必要な転写因子の幹部を単に準備する。
本稿では、精製されたPol IIと合成DNAとRNAオリゴヌクレオチドのみを用いて、人工転写伸長複合体2、3を生成するための以前に開発された方法の適応について説明する。得られた伸長複合体は転写活性であり、Pol II転写およびRNAキャッピング5の結合を調査する場合の使用に適している。転写とRNAキャッピングは、クロマチン...

真核生物メッセンジャーRNA(mRNA)合成は、RNAポリメラーゼIIによる未処理前駆体RNAの合成および成熟したmRNAを得るための前駆体RNAの処理を含む精巧な生化学的プロセスである。キャッピング、スプライシング、およびポリアデニル化のRNA処理ステップは、主に共写的に行われる。Pol II伸長複合体は、RNA処理酵素の多くの活動を募集し、調整する足場として機能します。その結果、成熟した真核生物mRNAがどのように生成されるかについての我々の究極の理解は、伸長複合体への募集の基礎となる生化学的メカニズムの解剖を可能にする実験システムの開発に大きく依存し、共転写キャッピング、スプライシング、およびポリアデニル化を担当する酵素の調節。
当然のことながら、このような実験システムの開発は困難であった。主な障害は、単にインビトロでPol IIによって基底転写を再構成するだけで、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF、およびTFIIHの5つの一般的な転写開始因子の最小セットを必要とするPol II転写自体の顕著な複雑さでした。さらに、インビトロで規制されたPol II転写の任意の並べ替えを再構成するには、転写因子と共レギュレータのより大きなセットが必要です。したがって、主な目標は、Pol II転写およびRNA処理の機能結合の研究に適した活性Pol II伸長複合体の再構成を可能にする、より単純な実験システムを開発することである。
活性Pol II伸長複合体を再構成するためのそのようなより簡単な方法の1つは、細長いPol IIの構造および生化学的研究に有用であることが証明されており、さらに最近では、共転写RNA処理2、3を研究するために有用である。 、4、5.本稿では、精製されたPol IIと合成転写気泡から調製されたPol II伸長複合体を効果的に使用して、新生Pol II転写物の共転写キャッピングのメカニズムを調べることができる方法を示す。
キャッピングとは、5'-グアノシン「キャップ」を、生まれつきのPol II転写物の5'-三リン酸末端に共生添加することをいう。キャップは、mRNAの成熟、輸送、翻訳、およびその他のプロセス6、7の後続のステップで重要です。キャップは、キャッピング酵素と呼ばれる酵素によってPol II転写物に共写物を添加する。哺乳動物細胞において、キャッピング酵素のRNA 5'-三ホスファターゼおよびグアニリルトランスフェラーゼ活性を担う活性部位は、単一のポリペプチド8内に含まれる。キャッピング酵素は、そのヘプタペプチドのSer5上でリン酸化されたPol II体およびRpb1カルボキシ末端ドメイン(CTD)上の未定義の表面との相互作用を通じてPol II伸長複合体に募集される5。伸長複合体では、キャッピング酵素は、生まれつき転写物が少なくとも18ヌクレオチドの長さに達し、ポリメラーゼRNA出口チャネルから出現した後、5'-グアノシンキャップの添加を触媒する。キャッピング反応の最初のステップでは、三ホスファターゼはRNA 5'-三リン酸を加水分解し、5'--二リン酸を得る。第2工程では、GTPをグアニチルトランスフェラーゼによってGMPに加水分解し、GMPキャッピング酵素中間体を形成する。最後に、グアニュリルトランスフェラーゼは、GMPを生まれつき転写物の5'-二リン酸末端に移し、キャップを産生する。
キャッピング反応の顕著な特徴は、同写物キャッピング(すなわち、機能的Pol II伸長複合体に関連する転写物のキャッピング)が遊びRNA5,9のキャッピングよりもはるかに効率的である。したがって、この分野の大きな問題は、キャッピングのこの劇的な活性化がPol II伸長複合体とのキャッピング酵素の相互作用によってどのように達成されるのかである。このプロトコルでは、精製されたRNAポリメラーゼIIおよび人工転写気泡のみを用いた活性RNAポリメラーゼII伸長複合体の組み立てについて説明する。これらの方法は、定義された長さと配列の転写物を有するRNAポリメラーゼII伸長複合体の作成を可能にする。最近の研究では、これらの定義されたRNAポリメラーゼII伸長複合体をRNAキャッピング5のメカニズムの側面を調査するためのモデルとして使用した。特に、これらの伸長複合体に関連するRNAのキャッピングは、遊値RNAのキャッピングよりも100倍以上効率的であり、(ii)はPol II CTDのTFIIH依存性リン酸化によって刺激されたことを示した。ここで説明するアプローチは、原則として、Pol II伸長複合体にリンクされた他の共転写RNA処理反応を研究するための基板を生成するように適合させることができる。
このプロトコルのセクション1では、人工伸び複合体は、合成テンプレート鎖DNAオリゴヌクレオチドを、テンプレート鎖DNAの約9ヌクレオチドに対してその3'末端で相補的であるRNAオリゴヌクレオチドにアニールすることによって作成される。次に、Pol II が DNA:RNA 二重鎖にロードされます。伸長複合体は、その3'末端でビオチンで標識された部分的に相補的な非テンプレート鎖DNAオリゴヌクレオチドを添加することによって完了する(図1および図2A)。RNAオリゴヌクレオチドは、これらの伸長複合体におけるPol IIによって拡張され、放射性標識ヌクレオチドの適切な組み合わせの添加時に定義された長さと配列の放射標識転写物を作る。さらに、未組み込みのヌクレオチドを除去するワッシュの組み合わせを使用して、ヌクレオチドの異なる組み合わせをさらに添加し、1つは、DNAテンプレートに沿って異なる位置にPol IIを「歩く」と定義された長さのRNAを合成することができます。RNAは次いで精製され、尿素-PAGEゲルを脱ナーチジンで電気泳動を受ける。プロトコルのセクション2では、人工伸長複合体が共転写RNAキャッピングを分析するために使用される。提示された例は、共転写RNAキャッピングに対するPol II CTDのTFIIH依存リン酸化の効果を測定する。本実験では、キャッピング酵素濃度(反応当たり5、15、45ng)と時間(1、2、4分)の関数として、共写物キャッピングの程度を測定した。

<table><tbody><tr><td>[&alpha;-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCi</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG007H001MC</td><td>RNAの放射性標識用</td></tr><tr><td>2x RNAローディング色素</td><td>New England Biolabs</td><td>B0363S</td><td>強くお勧めします。ゲルローディング中にRNAを調製するため</td></tr><tr><td>40% Bis:アクリルアミド溶液</td><td>Biorad</td><td>1610144</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (20 mg/mL)</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>Cdk7/Cyclin H/MAT1 (CAK complex) Protein, active, 10 &micro;g</td><td>ミリポア シグマ</td><td>14-476</td><td>Pol II CTD DNAのリン酸化に使用</td></tr><tr>オリ<td>ゴヌクレオチド</td><td>IDT</td><td></td><td>純度の仕様については表8を参照</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne ストレプトアビジン C1</td><td>Life Technologies Invitrogen</td><td>65001</td><td>我々はまた、Dynabeads M-280ストレプタビジンを問題なく使用しましたが、MyOne Streptavidinビーズは沈殿が遅いため、MyOneストレプトアビジンビーズを好みます</td></tr><tr><td>GlycoBlue共沈殿剤(15&thinsp;mg / mL)</td><td>Life Technologies Invitrogen</td><td>AM9516</td><td>を強くお勧めします。1</td></tr><tr><td>mmスペーサーと15ウェルコームHoefer SE600標準デュアル冷却垂直電気泳動システム、1mmスペーサーと15ウェルコームを備えた</td><td></td><td></td>反応をはるかに簡単にする染料核酸ペレットブルーQiagen 129046 強くお勧めします。<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>水性相と有機相の間に安定したバリアを形成する高密度ゲルが含まれています。抽出中のRNA収量を改善します</td></tr><tr><td>プロテイナーゼK溶液(20&thinsp;mg / mL)</td><td>Life Technologies Invitrogen</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>RNAオリゴヌクレオチド</td><td>Trilink</td><td></td><td>詳細については表8を参照してください</td></tr><tr><td>酵母無機ピロホスファターゼ(100ユニット/ mL)</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>NEBM2403S</td><td>キャッピング反応中にのみ必要です</td></tr></tbody></table>

共転写rna処理イベントを解剖するための人工rnaポリメラーゼii伸長複合体

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

真核生物mRNA合成は、成熟したmRNAを形成する前駆体RNAの多サブユニット酵素RNAポリメラーゼIIおよび共写物キャッピングおよびスプライシングにより前駆体RNAへのDNAテンプレートの転写を必要とする複雑な生化学的プロセスである。mRNA合成中、RNAポリメラーゼII伸長複合体は、その触媒活性を制御する転写因子の大規模なコレクション、ならびに成熟したmRNAを作成するキャッピング、スプライシング、および3'処理酵素による調節の標的である。mRNA合成の本質的な複雑さのために、その様々な共転写段階の単離および調査を可能にするより単純な実験システムは大きな有用性を持っている。
本稿では,同写物RNAキャッピングの研究に適したそのような単純な実験システムについて述べた.このシステムは、精製されたポリメラーゼおよび人工転写気から組み立てられた定義されたRNAポリメラーゼII伸長複合体に依存する。ビオチン化DNAを介して固定化すると、これらのRNAポリメラーゼII伸長複合体は、同転写RNAキャッピングと、伸び複合体がカッピング酵素を募集し、調節するメカニズムを解剖するための容易に可動化可能なツールを提供します。共写RNAキャッピング。このシステムは、RNAポリメラーゼII伸長複合体に結合されたmRNA成熟の他の段階における役割を有するタンパク質またはタンパク質複合体の募集および/または組み立てを研究するために適応できると期待される。

図2および図3は、異なる供給源から拡張またはPol IIを拡張することによって異なる長さの転写物を含む人工伸長複合体を生成するために使用される代表的な結果反応を示す。図4は、これらの伸長複合体を共写性CTDリン酸化依存性RNAキャッピングのアッセイにどのように使用できるかを示す。
図2Aは、人工伸長複合体におけるDNAおよびRNA分子の図である。図2Bは、プロトコル1に記載されているとおりに行われた反応で生成された異なる長さの転写物を示し、開始人工伸長複合体を20ntの合成RNAオリゴを用いて調製した(図2Aの濃い青色);RNA_20mer,<str...

ここでは、短い合成DNAとRNAオリゴヌクレオチドと精製されたPol IIのみを必要とするRNAポリメラーゼII(Pol II)伸長複合体の組み立てについて説明する。これらの複合体は、Pol II伸長複合体に関連する転写物の共転写処理の基礎となるメカニズムを研究するのに有用である。

共転写RNA処理イベントを解剖するための人工RNAポリメラーゼII伸長複合体

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

ここでは、Pol II転写とRNAキャッピングの機能的結合の調査に適したアクティブなPol II伸長複合体の再構成を可能にする簡単な実験システムを確立しました。この方法を使用すると、機能伸び複合体は、わずか数個のコンポーネントで簡単に組み立てることができます。伸びの複合体は磁気ビーズに固定化されるので、反応条件を変えやすい。磁気ビーズにビオチンを含むDNAオリゴを固定化するには、まず200マイクロリットルの磁気ビーズを低タンパク質結合1.5ミリリットルチューブに加え、次に2分間磁気ラックにチューブを置きます。チューブが磁気ラックにある間、ピペットを使用してビーズを邪魔することなくチューブから液体を取り除きます。ビーズを洗浄するには、ラックからチューブを取り出し、トリス塩酸塩、EDTA、塩化ナトリウムを含む洗浄バッファーを1ミリリットル加えます。チューブをラックに戻します。2分後、洗浄液を取り出し、同じバッファーの200マイクロリットルを使用してさらに2回洗浄を繰り返します。磁気ビーズを400マイクロリットルの2Xバッファーに再懸濁します。次に、380マイクロリットルの水と10マイクロモル非鋳型ビオチン化DNAオリゴの20マイクロリットルを加え、混合します。チューブをヌテーターに置き、室温で30分間インキュベートします。その後、200マイクロリットルのバッファーを使用して固定化された非鋳型DNAオリゴでビーズを3回洗浄し、200マイクロリットルの貯蔵および希釈バッファーで3回洗浄します。BSAでビーズをブロックし終えるために一晩摂氏4度でチューブを保管してください。翌日、溶液を廃棄し、200マイクロリットルの貯蔵および希釈バッファーでビーズを再懸濁し、5マイクロモルの近似DNA濃度に達し、次にビーズと共に溶液を新しいチューブに移す。DNA-RNA二重を得るために、書かれたプロトコルに記載されているように、2対1のRNA-DNAモル比を有するPCRチューブに10マイクロリットルのアニーリングミックスを調製する。チューブをサーマルサイクラーに入れます。プログラムを摂氏45度に設定し、次にそれぞれ2分間の12サイクルを摂氏43度から始め、1サイクルあたり2度の温度を下げます。最後に、摂氏4度でアイドル状態に保ちます。精製されたRNAポリメラーゼIIをDNA-RNAハイブリッドにロードするには、DNA-RNAデュプレックスの1マイクロリットルを、13マイクロリットルの新しく調製したポリメラーゼIIバッファーをチューブに混合します。精製されたRNAポリメラーゼIIの1マイクロリットルを加え、気泡を導入することなく、上下に軽くピペットをピペット化し、ピペットチップで攪拌して混ぜます。チューブを摂氏30度で10分間インキュベートします。伸長複合体を完成させるために、固定化さ

artificial-rna-polymerase-ii-elongation-complexes-for-dissecting-co

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