Name: 細胞培養およびショウジョウバエメラノガスターにおける酸化亜鉛ナノ粒子の毒性研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 学ぶ酸化亜鉛ナノ粒子の毒性評価法。ヒト肺線維芽細胞MRC5とショウジョウバエメラノガスターを用いて、細胞死タイプの同定と活性酸素種の定量を行うナノ毒性学プロトコルを解説します。

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研究は、補助金番号R706-000-043-490によってサポートされました。このスタディは、補助金スポンサーのビューを表すものではありません。

1. 生細胞/固定細胞に関する蛍光活性化細胞選別(FACS)分析
<ol><li>15分間のサスペンションでZnOのニオネート。</li>
	<li>培養細胞の治療に1mg/mL ZnO NPストック溶液を用いて、様々な濃度(例えば、0、10、25、50,100および200 μg/mL)でZnO NPを調用する。</li>
	<li>種子MRC5ヒト肺線維芽細胞(1 x 105細胞/ウェル)を1日前に6ウェル培養プレート上に、その後、8時間、16時間、24時間のZnO NPの2mL(三重)で細胞を処理する。</li>
	<li>各時点で、5分間300 x gで遠心分離して細胞を収集する。</li>
	<li>リン酸緩衝生理食べ物(PBS)で細胞ペレットを2回洗浄します。</li>
	<li>0.1M HEPES/ナトリウム(NaOH)、1.4M塩化ナトリウム(NaCl)、および25mM塩化ナトリウム(CaCl2)で構成される1x結合バッファーで細胞を再中断し、100 μL当たり1x105細胞の濃度で再濁させる。</li>
	<li>フルオレセインイソチオシアネート(FITC)アネキシンV染色物5μL、ヨウ化プロピジウム(PI)DNA染色の5μLを加え、暗い暗闇の中で室温(RT;25°C)で15分間細胞をインキュベートします。</li>
	<li>フローサイトメトリーで細胞をソートする前に、1x結合バッファーの追加の400 μLでサンプルをトップアップします。サンプルごとに最低 10,000 個の細胞が分析されます。</li>
	<li>得られた中央値の強度を使用して棒グラフを集計します。</li>
</ol>2.ショウジョウバエへのZnO GPの暴露
<ol><li>バイアルに異なる濃度のナノ粒子の1 mLを追加し、続いて9 mLのフライフードを加え、0.1 mg/mL、0.25mg/mLまたは0.5mg/mL ZnO NPsの最終濃度を作ります。</li>
	<li>ピペットを使用してバイアルに完全に食品とナノ粒子を混合します。</li>
	<li>ZnO NPを含むフライフードを使用前に少なくとも2~3時間冷却してください。</li>
	<li>大人のオスとメスのハエを5日間バイアルに入れ、食べ物の表面に卵(白い斑点として現れる)を交尾させ、産卵できるようにします。</li>
	<li>親のハエを取り除き、卵が4つの異なる発達段階(胚、幼虫、子犬、大人の段階)で構成されるさらなる発達を受けることを可能にする。</li>
</ol>3. フライの解剖
<ol><li>分析のためにバイアルの壁から後期3rdのスター幼虫を収集します。新たに産卵した卵は、通常、RTで72-120 h後に遅い3rdの幼虫に発達する。</li>
	<li>解剖皿をきれいにし、解剖媒体/PBSで井戸を満たします。</li>
	<li>一対の鉗子を使用して、立体顕微鏡下で幼虫(後期3rd instar)を解剖する。</li>
	<li>鉗子の先端を使用して小さな穴を作り、幼虫のキューティクル層を開きます。慎重に腸を引き出し、シュナイダーのショウジョウバエ培地を含む1.5mLのマイクロ遠心分離管に入れ、4%パラホルムアルデヒド(PF)の1mLを使用して固定工程に入れます。</li>
	<li>3.5免疫染色などの後続の実験のために、RTで10分間PFの腸を固定します。</li>
</ol>4. ジヒドロエチジウム(DHE)染色を用いたROS検出
<ol><li>手順 2.1 で説明したように、ZnO NP のさまざまな濃度で幼虫を治療します。</li>
	<li>セクション3に記載されている第3の第3の星幼虫からの腸の解剖に続いて、組織染色が行われる前にRTでシュナイダーのショウジョウバエ培地で腸をインキュベートする。シュナイダーの培地の1mLにDHE色素の1μL(30mMのストック濃度から)を溶解し、10-30 μM DHE色素の最終作業濃度を作ります。</li>
	<li>暗闇の中でRTで5分間腸をインキュベートし、5分ごとにシュナイダーの培地を使用して3回洗浄します。</li>
	<li>4%PF(オプションステップ)で腸を固定し、4',6-diamidino-2-フェニリンドール(DAPI)を含むアンチフェードマウント媒体で、ガラススライドに腸を取り付けます。共焦点顕微鏡下で画像をキャプチャします。</li>
</ol>5. ImageJソフトウェアを用いて蛍光を測定する
<ol><li>蛍光顕微鏡または共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して取得した蛍光画像をImageJソフトウェアに読み込む。</li>
	<li>[分析]メニューをクリックし、[測定値を設定]を選択します。</li>
	<li>面積積分強度や平均グレー値などの出力メジャーを選択します。</li>
	<li>[測定]をクリックします。</li>
	<li>蛍光のない領域を選択して、背景を設定します。</li>
	<li>Excel スプレッドシートにデータをエクスポートし、次に示すように計算を使用して、補正された総細胞蛍光 (CTCF) を決定します。 CTCF = 統合密度 - (選択した細胞Xの平均蛍光部のバックグラウンド測定値の蛍光)</li>
	<li>棒グラフを作成し、統計分析を実行します。</li>
</ol>

<ol><li>Kim, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+100+nm+zinc+oxide+nanoparticles%3A+a+report+of+90-day+repeated+oral+administration+in+Sprague+Dawley+rats%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats.</a> International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).</li>
<li>Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibacterial+activity+and+mechanism+of+action+of+zinc+oxide+nanoparticles+against+Campylobacter+jejuni%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Antibacterial activity and mechanism of action of zinc oxide nanoparticles against Campylobacter jejuni.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77, 2325-2331 (2011).</li>
<li>Colvin, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+environmental+impact+of+engineered+nanomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The potential environmental impact of engineered nanomaterials.</a> Nature Biotechnology. 21, 1166-1170 (2003).</li>
<li>De Angelis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+ZnO+and+TiO%282%29+nanoparticles%3A+physicochemical+characterisation+and+toxicological+effects+on+human+colon+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Comparative study of ZnO and TiO(2) nanoparticles: physicochemical characterisation and toxicological effects on human colon carcinoma cells.</a> Nanotoxicology. 7, 1361-1372 (2013).</li>
<li>Johnson, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+exposure+to+ZnO+nanoparticles+induces+autophagic+immune+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Acute exposure to ZnO nanoparticles induces autophagic immune cell death.</a> Nanotoxicology. 9, 737-748 (2015).</li>
<li>Singh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoGenotoxicology%3A+the+DNA+damaging+potential+of+engineered+nanomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">NanoGenotoxicology: the DNA damaging potential of engineered nanomaterials.</a> Biomaterials. 30, 3891-3914 (2009).</li>
<li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+dissolved+zinc+ion+and+reactive+oxygen+species+in+cytotoxicity+of+ZnO+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles.</a> Toxicology Letters. 199, 389-397 (2010).</li>
<li>Wahab, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZnO+nanoparticles+induced+oxidative+stress+and+apoptosis+in+HepG2+and+MCF-7+cancer+cells+and+their+antibacterial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">ZnO nanoparticles induced oxidative stress and apoptosis in HepG2 and MCF-7 cancer cells and their antibacterial activity.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 117, 267-276 (2014).</li>
<li>Namvar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+effects+of+biosynthesized+zinc+oxide+nanoparticles+on+murine+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Evidence-Based+Complementary+and+Alternative%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic effects of biosynthesized zinc oxide nanoparticles on murine cell lines.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. 2015, (2015).</li>
<li>Wong, S. W., Leung, P. T., Djurisic, A. B., Leung, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicities+of+nano+zinc+oxide+to+five+marine+organisms%3A+influences+of+aggregate+size+and+ion+solubility%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Toxicities of nano zinc oxide to five marine organisms: influences of aggregate size and ion solubility.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396, 609-618 (2010).</li>
<li>Hua, J., Vijver, M. G., Richardson, M. K., Ahmad, F., Peijnenburg, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle-specific+toxic+effects+of+differently+shaped+zinc+oxide+nanoparticles+to+zebrafish+embryos+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Particle-specific toxic effects of differently shaped zinc oxide nanoparticles to zebrafish embryos (Danio rerio).</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 33, 2859-2868 (2014).</li>
<li>Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+ZnO+nanoparticles+exposure+induces+developmental+toxicity%2C+oxidative+stress+and+DNA+damage+in+embryo-larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).</li>
<li>Alaraby, M., Annangi, B., Hernandez, A., Creus, A., Marcos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+study+of+the+harmful+effects+of+ZnO+nanoparticles+using+Drosophila+melanogaster+as+an+in+vivo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hazardous+Materials%22%5BJournal%5D)">A comprehensive study of the harmful effects of ZnO nanoparticles using Drosophila melanogaster as an in vivo model.</a> Journal of Hazardous Materials. 296, 166-174 (2015).</li>
<li>Rand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophotoxicology%3A+the+growing+potential+for+Drosophila+in+neurotoxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology+and+Teratology%22%5BJournal%5D)">Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology.</a> Neurotoxicology and Teratology. 32, 74-83 (2010).</li>
<li>Ong, C., Yung, L. Y., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+as+a+model+organism+to+study+nanotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity.</a> Nanotoxicology. 9, 396-403 (2015).</li>
<li>Hoffmann, J. A., Reichhart, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+innate+immunity%3A+an+evolutionary+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Drosophila innate immunity: an evolutionary perspective.</a> Nature Immunology. 3, 121-126 (2002).</li>
<li>Hughes, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+genetic+model+for+studying+pathogenic+human+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses.</a> Virology. 423, 1-5 (2012).</li>
<li>Jennings, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+-+a+versatile+model+in+biology+%26+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today%22%5BJournal%5D)">Drosophila - a versatile model in biology & medicine.</a> Materials Today. 14, 190-195 (2011).</li>
<li>Adams, M. D., Sekelsky, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+sequence+to+phenotype%3A+reverse+genetics+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">From sequence to phenotype: reverse genetics in Drosophila melanogaster.</a> Nature Reviews Genetics. 3, 189-198 (2002).</li>
<li>Adams, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of Drosophila melanogaster.</a> Science. 287, 2185-2195 (2000).</li>
<li>Ong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+nanoparticles+disrupt+germline+stem+cell+maintenance+in+the+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Silver nanoparticles disrupt germline stem cell maintenance in the Drosophila testis.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li>
<li>Alaraby, M., Demir, E., Hernandez, A., Marcos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+potential+harmful+effects+of+CdSe+quantum+dots+by+using+Drosophila+melanogaster+as+in+vivo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Assessing potential harmful effects of CdSe quantum dots by using Drosophila melanogaster as in vivo model.</a> Science of the Total Environment. 530-531, 66-75 (2015).</li>
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<li>Jovanovic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+a+human+food+additive%2C+titanium+dioxide+nanoparticles+E171%2C+on+Drosophila+melanogaster+-+a+20+generation+dietary+exposure+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The effects of a human food additive, titanium dioxide nanoparticles E171, on Drosophila melanogaster - a 20 generation dietary exposure experiment.</a> Scientific Reports. 8, (2018).</li>
<li>Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Toxicity+of+Nanoparticles+to+Human+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">The Toxicity of Nanoparticles to Human Endothelial Cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1048, 59-69 (2018).</li>
<li>Akhtar, M. J., Ahamed, M., Alhadlaq, H. A., Alshamsan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+ROS+scavenging+and+antioxidant+signalling+by+redox+metallic+and+fullerene+nanomaterials%3A+Potential+implications+in+ROS+associated+degenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta-General+Subjects%22%5BJournal%5D)">Mechanism of ROS scavenging and antioxidant signalling by redox metallic and fullerene nanomaterials: Potential implications in ROS associated degenerative disorders.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1861, 802-813 (2017).</li>
<li>Akter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+review+on+silver+nanoparticles-induced+cytotoxicity%3A+Physicochemical+properties+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Advanced+Research%22%5BJournal%5D)">A systematic review on silver nanoparticles-induced cytotoxicity: Physicochemical properties and perspectives.</a> Journal of Advanced Research. 9, 1-16 (2018).</li>
<li>Vecchio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fruit+fly+in+the+nanoworld%3A+once+again+Drosophila+contributes+to+environment+and+human+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">A fruit fly in the nanoworld: once again Drosophila contributes to environment and human health.</a> Nanotoxicology. 9, 135-137 (2015).</li>
<li>Marino, G., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+apoptotic+phosphatidylserine+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure.</a> Cell Research. 23, 1247-1248 (2013).</li>
<li>Stoddart, M. J. Cell Viability Assays: Introduction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStoddart%2C+MJ+%22Mammalian+Cell+Viability%3A+Methods+and+Protocols%22">Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols</a>. , Chapter 1 (2011).</li>
<li>Yazdani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concerns+in+the+application+of+fluorescent+probes+DCDHF-DA%2C+DHR+123+and+DHE+to+measure+reactive+oxygen+species+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">Concerns in the application of fluorescent probes DCDHF-DA, DHR 123 and DHE to measure reactive oxygen species in vitro.</a> Toxicology in Vitro. 30, 578-582 (2015).</li>
<li>Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+kinetics+of+dihydroethidium+fluorescence+with+superoxide+using+xanthine+oxidase+and+hypoxanthine+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Analysis of kinetics of dihydroethidium fluorescence with superoxide using xanthine oxidase and hypoxanthine assay.</a> Annals of Biomedical Engineering. 41, 327-337 (2013).</li>
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</ol>

著者らは、彼らが競合する金銭的利益を持っていないと宣言します。

ZnO NPがMRC5線維芽細胞にアポトーシスを誘導できるかどうかを評価するために、我々は細胞を壊死またはアポトーシス細胞死から区別するためにフローサイトメトリーを使用する。正常な生細胞では、ホスファチジルセリン(PS)は細胞膜に局在する。アポトーシスが発生した場合、PSは血漿膜の細胞外リーフレットに転移し、Fluoresin(FITCアネキシンV)29で標識されたアネキシンVの結合を可能にする。一方、赤蛍光プロピジウムヨウ化物(PI)は、核酸結合色素であり、生細胞およびアポトーシス細胞に対して不浸透性であるが、死細胞30を染色する。これにより、アルゴンイオンレーザーの488nmラインを持つフローサイトメーターを用いて、死細胞(赤と緑)、アポトーシス細胞(緑色蛍光)および生細胞(蛍光がほとんどない)を同定することができます。
ショウジョウバエ腸のDHE染色の場合、長時間保存すると染料が暗い/紫色に変わる色素の自動酸化につながる可能性があるため、実験を開始する直前にDMS...

ナノテクノロジーとは、医学、材料科学、生化学など、あらゆる科学分野で使用されるナノサイズの材料の応用を指します。例えば、紫外線散乱、化学センシング、抗微生物性、高い電気伝導性で知られるZnO NPは、食品包装、化粧品など様々な消費財の製造に活用されています。繊維、ゴム、電池、自動車テールガス処理用触媒、および生物医学関連アプリケーション1、2、3.
しかし、ZnO NPベースの製品の急増は、ZnO NPへの人間の暴露の増加につながる、人間の健康に対する潜在的な悪影響に関する懸念を提起している。インビトロ細胞研究の数は、ZnO NPが酸化ストレス、オートファジー関連細胞毒性、炎症、および無毒性4、5、6、7、8を誘発できることを実証しました.特に、ZnO NPの毒性は、Zn2+イオンを自由に溶解し、ZnOの表面反応性によって引き起こされると仮定され、その結果、細胞イオン性および代謝不均衡が生じ、イオン性恒常性障害およびイオン輸送の阻害4,7,9,10.重要なことに、研究は、活性酸素種(ROS)の生成がZnO NPs関連毒性の基礎となる主要なメカニズムの一つであることを示しています。ROS侮辱後の不十分な抗酸化活性は、細胞毒性およびDNA損傷9を引き起こす原因であることが示されている。ZnO NPの毒性効果は、げっ歯類1、ゼブラフィッシュ11、12、ならびに無脊椎動物のショウジョウバエ13を含む動物モデルでも報告されている。
ショウジョウバエは、化学物質およびナノ材料(NM)14、15の毒性スクリーニングのための確立された代替動物モデルとして機能する。重要なのは、ヒトとショウジョウバエの間には高いレベルの遺伝的類似性があり、NMなどの環境汚染物質に対する生物学的応答を評価するための生体内モデルとしてのショウジョウバエの使用を正当化する。16.さらに、その小さなサイズ、短い寿命、遺伝的なアメニティ、および容易で、費用効果が大きい維持のためにショウジョウバエを使用することの多くの利点がある。さらに、ショウジョウバエは遺伝学、分子、発生生物学の研究に広く採用されており、2000年に完全なゲノムが完全に配列され、様々なハイスループットスクリーニングに適しています。そして、未解決の生物学的問題に取り組むために17,18,19,20,21.近年、ショウジョウバエにおける異なるタイプのNPを用いた免疫毒性に関する多くの研究が15、22、23、24で報告されている。ショウジョウバエを用いた研究から得られたこの基本的な新しい知識は、ナノトキシトロジーの理解に関するより多くの洞察を提供するのに役立ちました。
ROSは、特に、金属ベースのNP25によって引き起こされる細胞毒性および無毒性の既知の原因である。ROSは、分子酸素よりも高い活性特性を有する酸素含有化学種である。スーパーオキシドラジカル(O2-)などのフリーラジカルは、過酸化水素(H2O2)などの非ラジカル分子がROSとして作用しうる。正常な生理学的状態の下では、それらは細胞恒常性26を維持する必要があるが、抗酸化防御システムの過剰産生または不自由による過剰なROSは酸化ストレスを引き起こし、タンパク質への損傷を引き起こす可能性があり、脂質およびデオキシリボ核酸(DNA)27.例えば、ROSレベルが増加し、グルタチオン(GSH)レベルが伴って減少するにつれて、アデノシン三リン酸(ATP)合成の中断が起こり、乳酸脱水素酵素(LDH)レベルが培地中で増加し、細胞死27で終わる。
ここでは、培養哺乳動物細胞とショウジョウバエを用いて細胞解析や遺伝子解析を行い、ZnO NPの潜在的な悪影響を判定するプロトコルを提供する。ZnO NPの毒性試験に用いられる方法の概要を図1に示す。

<table><tbody><tr><td>15% メチル 4-ヒドロキシ安息香酸</td><td>シグマ Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% パラホルムアルデヒド</td><td>シグマ Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>バクト寒天</td><td>BD biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cncCK6/TM3、Sb</td><td></td><td></td><td>a 博士からの贈り物 Kerppola T</td></tr><tr><td>コーンミール、グルコース、酵母醸造機</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CyAn ADPSummit Software</td><td>DAKO</td><td></td><td>https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf</td></tr><tr><td>ジヒドロエチジウム(ヒドロエチジン)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>D11347</td><td></td></tr><tr><td>FITC アネキシンV アポトーシス検出キット I</td><td>BD biosciences</td><td>556547</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グルコリン</td><td>スーパーマーケット</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJソフトウェア</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MRC5 ヒト肺線維芽細胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>Schneider's ショウジョウバエ medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 退色防止封入剤 with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Wild-type Canton-S;Sod2N308/CyO</td><td>NIG-FLY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酸化亜鉛ナノ粒子</td><td>Σ Aldrich</td><td>721077</td><td>シート2参照</td></tr></tbody></table>

細胞培養およびショウジョウバエメラノガスターにおける酸化亜鉛ナノ粒子の毒性研究

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

酸化亜鉛ナノ粒子(ZnO NP)は幅広い用途を持っていますが、ZnO NP関連毒性に関する報告の数は近年急速に増加しています。しかし、ZnO NP誘発毒性の根本的なメカニズムを解明する研究はスキャン可能である。インビトロとインビボ実験モデルの両方を用いてZnO NPの毒性プロファイルを決定した。ZnO NP曝露MRC5肺線維芽細胞では細胞生存率の有意な減少が認され、ZnO NPが細胞傷害作用を発揮することを示した。同様に、興味深いことに、ZnO NPに曝露された腸は、フルーツフライショウジョウバエにおける活性酸素種レベル(ROS)の劇的な増加を示した。消費者によるZnO NPの使用率の増加に対するリスク評価を確立するためには、より詳細な研究が必要である。

NP露光細胞を細胞染色試薬キットで処理し、続いてフローサイトメトリーを用いて細胞選別を行った。ZnO NP処理細胞(下、右パネル)は、対照細胞(R5、下部、左パネル)よりも早期(R3)/後期アポトーシス細胞(R6)の割合が高い。壊死細胞死はR4(上、右パネル)で示される(図2)。ZnO NP処理MRC-5線維芽細胞に関するFITC/アネキシンVアッセイの結果を図2に示す。
ショウジョウバエ実験では、様々な濃度で超音波処理されたZnO NPを10mLチューブで飛ばすために添加し、ピペットコントローラを用いてよく混合した(図3)。バイアルから採取した後期の3番目のインスター幼虫を立体顕微鏡下で解剖した。幼虫は、残りの食物の残骸を取り除くために最初に洗浄された(<...

特に酸化亜鉛ナノ粒子(ZnO NPs)の毒性プロファイルを評価するための詳細なプロトコルについて説明し、ヒトMRC5肺線維芽細胞における細胞死の種類および果実フライドロソフィラにおけるROS形成について説明する。

Zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) have a wide range of applications, but the number of reports on ZnO NP-associated toxicity has grown rapidly in recent ...

我々の方法は、細胞死の種類を調べ、活性酸素種の産生を調べるなど、ナノ毒性を研究するための簡単で繰り返しの方法を概説する。蛍光活性化細胞の並べ替えは、細胞のサブ人口と成長する異なる種類の細胞死を研究することを可能にする厳格な形式です。DHEプローブの研究方法により、活性酸素種を検出して定量化し、続いてフローサイトメトリー、微視的高含有イメージング、および結合ベースの蛍光分析を行うことができます。まず、酸化亜鉛ナノ粒子を含むエペンドルフチューブを酸化亜鉛ナノ粒子ストック溶液に15分間ソニケーターに入れます。1ミリリットル当たり1ミリグラムの酸化亜鉛ナノ粒子ストックを用いて、様々な濃度で酸化亜鉛ナノ粒子を調製する。次いで、バイオセーフティキャビネットにおいて、ヒト肺線維芽細胞を3つの6ウェル培養プレートに播種し、1回10〜5番目の細胞を1回の濃度で及ぶ。37°Cで細胞をインキュベートします。1日後、2ミリリットルの酸化亜鉛ナノ粒子で細胞を8時間、16時間、または24時間処理します。各時点で、細胞を15ミリリットルの遠心管に集め、遠心分離機を300回gで5分間回収する。リン酸緩衝生理食塩水で細胞ペレットを2回洗浄し、1X結合バッファーで細胞を再中断します。次に、5マイクロリットルのFITCアネキシンV染色を5マイクロリットルのヨウ化プロピジウムDNA染色に加える。暗い温度で15分間、染色した細胞をインキュベートします。フローサイトメトリーで細胞を選別する前に、サンプルを追加の400マイクロリットルの1X結合バッファーで上に上げてください。取得した中央値強度を使用して、棒グラフを集計します。ピペットを使用してバイアルに異なる濃度で1ミリリットルのナノ粒子を追加し、続いて9ミリリットルのフライフードを使用して、1ミリリットル当たり0.1ミリグラム、ミリリットル当たり0.25ミリグラム、または1ミリリットルの酸化亜鉛ナノ粒子あたり0.5ミリグラムの最終濃度を作ります。ピペットを上下にして完全に混ぜます。酸化亜鉛ナノ粒子を含むフライ食品を、使用前に少なくとも2〜3時間冷却することを許可する。その後、二酸化炭素を含むバイアルで成体の雄と雌のハエを麻酔し、5日間、5匹のオスハエと5匹の雌のハエを各バイアルに導入します。彼らが交尾し、食べ物の表面に卵を産むことを許可します。麻酔後、親のハエを取り除き、卵が4つの異なる発達段階で構成される室温でさらなる発達を受けることを可能にする。胚性、幼虫、子犬、および成人期。72〜120時間後、産きたての卵は3番目後半のインスター幼虫に発達する。鉗子を使用して、分析のためにバイアルの壁から幼虫を収集します。解剖媒体またはPBSを含む解剖皿の井戸に、幼虫を溶液に入れる。実体顕微鏡では、鉗子の先端を使って小さな穴を開け、幼虫のキューティクル層を開き

toxicity-study-zinc-oxide-nanoparticles-cell-culture-drosophila

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

この記事では、ゼブラフィッシュの胚を化学的毒性スクリーニングに使用しています。化学的毒性は、表現型の読み出しと相関しています。サンプルプロトコルは、化学的毒性スクリーニングを実施するための方法論的アプローチを示しています。...

胚ベースの化学毒性スクリーニング:ゼブラフィッシュ胚の発生に対する影響の評価

蚊の発生、繁殖力、生存率に対するエピジェネティックな薬DZNepの効果を調べるためのプロトコルが開発されました。...

マラリア蚊の開発、産卵および生存者にエピジェネティック薬の試験に及ぼす影響のために毒物学的アッセイ

複数の世代の発達段階別に表現型の出力の範囲で露出の影響を勉強の目的と汚染物質にショウジョウバエ属の種を公開するため本稿では、詳細なプロトコルを提供します。...

無脊椎動物モデル システムとしてショウジョウバエを使用して毒性を実験室でテストするための実験プロトコル

定量法は識別し、線虫の表現型プロファイリングを自動的に分析することによって化学物質の急性毒性を予測しました。このプロトコルでは、384 ウェル...

線虫の表現型プロファイリングを自動化によって化学的毒性予測のための高スループット試金

内分泌破壊物質(EDC)は、生物および自然環境にとって深刻な問題を表します。ショウジョウバエメラノガスターは、生体内のEDC効果を研究するための理想的なモデルを表します。ここでは、ショウジョウバエにおける内分泌破壊を調査する方法を紹介し、胎児、生殖能力、発達時期、ハエの寿命に対するEDCの影響に対処する。...

ショウジョウバエメラメラノガスターにおける内分泌破壊を試験する方法

このプロトコルは、96ウェルプレートのゼブラフィッシュ胚(ZEM2S)および肝臓(ZFL)細胞株の細胞毒性の評価に適した、一般的に使用される細胞毒性アッセイ(Alamar Blue...

ゼブラフィッシュ細胞株を用いた細胞毒性アッセイ

このプロトコルは、液体培地を使用して、成虫ショ ウジョウバエメラノガスターの生存率に対する化学毒物の影響を評価する効率的で安価な方法を説明しています。...

成体ショウジョウバエメラノガスターにおける化学毒性の評価

以下の研究では、リアルタイムのハイスループットスクリーニング技術である電気セル基板インピーダンスセンシング(ECIS)を利用して、選択された金属有機フレームワークの毒物学的プロファイルを評価します。...

有機金属骨格の毒性プロファイルのリアルタイム評価のための電気セル-基板センシング

このプロトコルは、従来の哺乳類モデルに代わるものとして、自発運動機能障害の定量化を通じてショウジョウバエの神経毒性を評価するためのハイスループットで費用対効果の高い方法を提供します。これは、高感度で再現性があり、倫理的に有利なモデルを使用して、医薬品化合物、環境剤、または遺伝子組み換えの神経毒性効果を評価することを目的としています。...

神経毒性のリードアウトとしての Drosophila melanogaster の自発運動機能障害の行動解析

我々はレトロウイルス導入を用いて抗原特異的マウスT細胞を生成するためにプロトコルを提示...

マウスT細胞におけるT細胞受容体のレトロウイルス導入

学ぶ酸化亜鉛ナノ粒子の毒性評価法。ヒト肺線維芽細胞MRC5とショウジョウバエメラノガスターを用いて、細胞死タイプの同定と活性酸素種の定量を行うナノ毒性学プロトコルを解説します。

細胞培養およびショウジョウバエメラノガスターにおける酸化亜鉛ナノ粒子の毒性研究

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