体外放射線生物学実験における線形加速器の利用
May 26th, 2019
臨床線形加速器は、癌細胞に対する幅広い線量率の生物学的効果を決定するために使用することができる。細胞系アッセイおよびがん幹様細胞の線形加速器を設定する方法について、懸濁液中の腫瘍球として増殖し、付着培養培養物として成長した細胞株について議論する。
放射線療法は、最も頻繁に線形加速器を使用して提供される。このプロトコルは、研究者が線形加速器を使用して細胞に放射線の生物学的影響を評価することを可能にする。この技術の利点は、線形加速器を使用することにより、研究者は臨床的に関連する用量および用量率の広い範囲を研究することができるということです。
さらに、このプロトコルは、すべてのタイプの癌細胞に使用することができる。この方法は、ここに示す同様の装置を使用して実行できます。たとえば、他のベンダーによって製造された線形加速器。
線形加速器を使用して線量計算を行う経験がない個人は、サンプルに所望の線量を提供するために必要なモニターユニットの正しい数を計算するのに苦労するかもしれません。彼らは経験医学物理学者やドジメトリストからのアドバイスを求めることによって利益を得るでしょう。線形加速器を使用して正確にサンプルに線量を提供するには、慎重な配置が必要です。
予定された照射の2日前に、培養フードで働き、無菌5ミリリットルピペットを使用して、培養プレートから15ミリリットル遠心分離管にグリオーマ幹細胞状細胞を採取する。細胞をカウンタートップ遠心分離機で3分間200回gで遠心分離する。上清を捨て、細胞ペレットを1ミリリットルのトリプシン-EDTAで再懸濁します。
ペレットを消化し、トリプシン-EDTAで単一の細胞懸濁液を作るために室温で5分間インキュベートします。消化中に2分ごとに、遠心分離管の底を軽く振って細胞が完全に消化されるようにします。その後、3ミリリットルの幹細胞培養培地を加えてトリプシンをクエンチし、カウンタートップ遠心分離機で200回gで静かに混合し、遠心分離機を3分間加えます。
上清を捨て、細胞ペレットを5ミリリットルの細胞培養培地で再懸濁し、ヘモサイトメーターで細胞を数える。500万個の細胞を10センチメートルのプレートに分け、10ミリリットルの細胞培養培地を含み、摂氏37度で48時間インキュベートする。予定された照射の直前に、前に行われたように細胞と遠心分離機を収集します。
上清を捨て、細胞ペレットを5ミリリットルの細胞培養培地で再懸濁する。細胞懸濁液を1ミリリットルを2ミリリットルの細胞培養培地を含む35ミリプレートに移し、培地が1センチメートルの高さに達することを確認する。メッキされた細胞を二次容器に移して汚染の危険を減らし、ユーティリティカートの容器内の細胞を照射施設に持ち込んで細胞を照射する。
照射の1日前に、細胞培養フードで働き、真空に接続されたパスツールピペットを使用して、取り付けられた細胞株に細胞培養板からDMEM培地を除去する。その後、残留培地を洗い流すために5ミリリットルの無菌PBSで細胞を洗います。培養皿にトリプシンEDTAを1ミリリットル加え、培養プレートを軽く傾けて皿全体が覆われていることを確認します。
室温で5分間インキュベートした後、3ミリリットルのDMEM培地でトリプシン-EDTA反応を焼き付けます。5ミリリットルピペットを使用して細胞を15ミリリットル遠心管、遠心分離機に集め、次に原稿に記載されているように細胞を培養する。LINACのコンソールソフトウェアを使用して以前に準備したセルを照射するには、アクセラレータガントリーとコリメータをゼロ度に設定し、xとyの顎を対称5×5平方センチメートルのフィールドサイズに開き、マルチリーフコリメーターを後退させます。
処理ソファに水に相当する材料を少なくとも5センチメートル加え、照射するセル皿をLINAC十字線の中心に置きます。1.5センチメートル前後の6メガボルトX線ビームに最大線量の深さで細胞を置き、皿の上にさらに1センチメートルの水に相当する材料を追加します。LINACの頭部にフロントポインタを貼り付け、構築材料の表面に触れるまで伸ばします。
ソースから構築サーフェスまでの距離が 100 センチメートルになるまで、テーブルの高さを調整します。治療保管庫を離れ、他のすべての個人が去っていることを確認します。部屋に他のセルがないことを確認し、ボルトのドアを閉じます。
フィールドサイズ、モニタユニット、モニタユニットをコンソールで1分あたりに確認し、放射線のセルに対してビームを有効にします。グリオーマ幹細胞の3つのサンプルをこのプロトコルを用いて調製し、照射後24時間回収した。そこに細胞周期プロファイルを計算し、細胞周期の異なる段階で細胞のパーセンテージで示した。
G2細胞周期停止は、非照射対照細胞と比較して、標準的な線量率または余分な高用量率でグリオーマ幹細胞を照射した後に観察された。適切な用量を提供するためには、培養皿中の培地の高さを測定して、1センチメートルに達することを確認することが最も重要です。この手順に従って、免疫染色、ウェスタンブロット、および細胞周期解析などの他の生物学的アッセイを行うことができる。
この手順は、研究者に臨床的に関連する線量および線量率の設定を提供するので、多くの細胞培養ベースのモデルに対する放射線効果を評価するために使用することができる。
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概要
この記事では、がん細胞に対する放射線の生物学的効果を評価するために臨床用直線加速器を使用する方法について説明します。腫瘍球および付着性細胞培養物におけるがん幹細胞様の細胞を含む細胞ベースアッセイの設定について概説します。
主要な研究構成要素
科学分野
- 放射線療法
- がん生物学
- 細胞ベースアッセイ
背景
- 直線加速器は放射線療法で一般的に使用されています。
- このプロトコルでは様々な放射線線量の評価が可能です。
- あらゆる種類のがん細胞に適用可能です。
- 異なるベンダー間で同様の機器を利用できます。
研究の目的
- がん細胞に対する放射線の生物学的効果を評価すること。
- 研究に直線加速器を使用するためのプロトコルを提供すること。
- がん幹細胞様の細胞に関する研究を促進すること。
使用された方法
- 細胞ベースアッセイのための直線加速器の設定。
- 懸濁培養で成長したがん幹細胞様の細胞のアッセイ。
- 付着性細胞培養のアッセイ。
- 臨床的に関連する線量と線量率の範囲の評価。
主要な結果
- がん研究における直線加速器の多様性を示しました。
- 様々な線量率を効果的に研究できることを示しました。
- 異なるがん細胞タイプに対する放射線の生物学的効果についての洞察を提供しました。
- 様々な製造元からの同様の機器の使用を検証しました。
結論
- 直線加速器はがん研究の効果的なツールです。
- このプロトコルはがん細胞に対する放射線効果の理解を深めることができます。
- 将来の研究では、この方法論を基にさらなる応用を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma researchers to evaluate radiation-induced biological effects using clinically relevant doses and dose rates, supporting mechanistic de-risking in oncology target validation. By leveraging linear accelerator technology, teams can generate reproducible, quantitative data to inform go/no-go decisions in preclinical development pipelines. The approach enhances predictive confidence when assessing therapeutic candidates across diverse cancer cell models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of radiation response pathways to clarify mechanistic hypotheses in target validation.
- Operational Value: Supports functional target de-risking by quantifying cell cycle arrest and DNA damage endpoints.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides standardized irradiation conditions for reproducible compound screening in radio-sensitizer or radio-protector studies.
- Operational Value: Facilitates assay scalability across cell types using vendor-agnostic linear accelerator platforms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables dose-response modeling that aligns with clinical radiation regimens for improved translational relevance.
- Operational Value: Supports continuity from in vitro mechanistic studies to in vivo validation through standardized dosimetry.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows by providing quantitative radiation response data that informs target prioritization and lead optimization strategies.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of radiation-induced phenotypes to de-risk targets early in the discovery cascade.
- Screening: Delivers standardized, quantifiable outputs (e.g., cell cycle arrest) to support high-fidelity compound evaluation.
- Analytics: Generates dosimetry-linked readouts (dose, dose rate, monitor units) enabling cross-condition comparison and statistical rigor.
- Translational Research: Connects in vitro findings to clinical dosing parameters, supporting biomarker-aligned preclinical advancement.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable irradiation capability applicable across oncology projects and vendor platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in radiation biology studies through precise dose and dose rate control.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization via traceable dosimetry and vendor-flexible implementation.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early-stage radiation combination screening, reducing late-stage attrition risk.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of radiation-modulating agents based on quantitative preclinical profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in radiobiology and dosimetry for accurate monitor unit calculation and sample positioning.
- Depends on access to a linear accelerator and water-equivalent bolus materials for dose depth calibration.
- Necessitates cross-team standardization between cell culture and radiation physics teams for protocol adherence.
- Involves adaptation considerations for varying cell culture formats (e.g., dish size, media height) to ensure dose accuracy.
- Limited by the need for specialized safety training and vault access protocols at irradiation facilities.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:05
Cell Preparation for Suspension Cell Culture
2:53
Cell Preparation for Attached Cell Culture
3:40
Irradiation with a Linear Accelerator (LINAC)
4:52
Results: Cell Cycle Effect of Standard Dose Rate and Extra High Dose Rate Irradiation by a Linear Accelerator
5:23
Conclusion
