Name: 浮遊水耕システムにおけるアラビドプシス・タリアナ根の細菌の植民地化と維持のモニタリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-28T09:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 学ぶ 浮遊水耕システムを用いたArabidopsis thaliana根への細菌植民地化と維持の定量法。複数菌種の同時評価が可能で、植物と微生物の相互作用を可視化する実験手法です。

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この研究は、エネルギー生物環境研究省(DOE-BER 0000217519 to E.A.S.)、国立科学財団(INSPIRE IOS-1343020 to E.A.S.)が提供する研究資金によって支援されました。SLHはまた、国立科学財団大学院研究フェローシッププログラムによって支援されました。私たちは、細菌株と貴重な洞察力を提供するためにジェフリー・ダングル博士に感謝します。アンドリュー・クライン博士とマシュー・J・パワーズ博士に実験的な提案をいただいただいたことに感謝します。最後に、SLHは、特に創造的でアクセス可能な手段を通じて、科学を広めることが特権と責任であることを私たちに思い出させるためのソーシャルメディア上の接続に感謝したいと思います。

注: 実験セットアップはわかりやすく説明されており、このレポートに含まれる代表的な結果を生成するために使用されますが、条件は必要に応じて変更できます。使用される細菌のBSLステータスに従って、すべてのステップはPPEを使用し、安全のための機関および連邦の再調整に従って行われるべきである。
1. 細菌の特性
<ol><li>成長培地寒天プレート上の細菌の形態を決定します。およそOD600 = 0.5で細胞を再中断し、1 μLの体積を選択した寒天媒体にプレートする。特定の細菌群集の個々のメンバーをより良く区別するために、20 mg/mLの最終濃度に寒天プレートにX-galを追加します。コロニーが形成されるまで24 °Cまたは30 °Cで成長し、その後、コロニーの形態の写真やメモを撮ります。</li>
	<li>各細菌株の光学密度とmL16あたりのCFU(コロニー形成単位)数との相関関係を定義する。24ウェルプレートの1mLの水中の細菌を約OD600 =5に再定置し、2倍の連続希釈を行い、すべての希釈のOD600を監視し、各サンプルで複数の光学密度で生存可能なCFU/mLを決定するプレートを行います。</li>
	<li>各細菌株の最大超音波処理許容度を決定します。これを行うには、アリコート細胞を液体培地を含む24ウェルプレートに入れ、一部の細胞を無言制御試料として予約する。24先端のホーンアタッチメントを備えた超音波装置を使用して、2つのパルスで40アンペアで超音波処理の12の3ラウンドを適用します。 注:24ウェル超音波装置の使用は、処理プラントサンプルの下流多重化を容易にすることをお勧めしますが、利用できない場合は、マイクロチップを装着した超音波装置を使用し、各サンプル超音波処理を独立して実行します。常に少なくとも25 NRR保護に定格のイヤーマフを着用してください。</li>
	<li>超音波および非超音波サンプルの10倍の連続希釈を実行し、寒天プレートにスポット。超音波処理後に生存細胞の減少があるかどうかを確認します。もしそうなら、治療が最終的なCFU/mL17に影響を与えなくなるまで、減らされた総超音波処理時間または振幅を使用して、新鮮なサンプルを使用し、超音波処理ステップを繰り返します。</li>
</ol>2. プラスチックメッシュ上のアラビドプシスタリアナ苗の準備
<ol><li>標準の穴パンチャーを使用して、プラスチック メッシュのディスクを作成します。<ol>
<li>アルミ箔の緩いカバーを持つガラス容器にディスクを収集し、20分の乾燥サイクル13に設定されたオートクレーブを使用して殺菌する。</li>
		<li>炎殺菌ピンセットを使用して、植物成長培地寒天板の表面に約40枚の殺菌メッシュディスクを単層に分配します。0.5xムラシゲおよびスクーグ(MS)塩を使用し、500mg/LのMESバッファー[2-(N-モルフォリーノ)エタンサルホン酸]と1.5%のバクトー寒天を植物成長培地として含み、50μg/mLベノミルを苗の限界真菌汚染に添加する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>前述の17.としてA.タリアナのアックスシーズを調べます。<ol>
<li>約100~300個の種子をラック内の個々の遠心管に入れ、再密封可能なガラスまたは重いプラスチック容器(「瓶」)にヒュームフードに入れます。</li>
		<li>注意して、100mLのブリーチのビーカーを瓶に入れ、濃縮HClの3mLを漂白剤に加え、すぐに瓶を密封し、煙が少なくとも4時間の種子を殺菌できるようにします。</li>
		<li>瓶の下から殺菌した種子のチューブを慎重に取り除き、シールします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>各メッシュの中心に 2 つのシードを配置します。外科テープでプレートをシールし、種子をバーナライズするために暗闇の中で4°Cで2〜6日間インキュベートします。</li>
	<li>苗を発芽させ、成長させるには、短い日の設定の下で8〜10日間植物成長室にプレート寒天側を置きます:21°Cで光の9時間と18°Cで暗いの15 h(図1、ステップ2)。</li>
</ol>3. 液体細菌増殖培地における植物の植民地化
<ol><li>無菌24ウェルプレートの各ウェルに1mLの細菌増殖培地を加えます( メディアのみの制御ウェルを除く)。細菌増殖培地としてレノックスルリアブロス(トリプトン10g、酵母エキス5g、NaCl5g)を使用してください。</li>
	<li>メッシュに埋め込まれた発芽した苗を寒天板から液体に移します(図1、ステップ3a)。<ol>
<li>2本の発芽した苗を含むメッシュを、火殺菌鉗子を使用して寒天プレートの上下にゆっくりと剥がします。等しいサイズと損傷のない苗を持つメッシュを選択します。</li>
		<li>寒天からの除去が滑らかでない場合は、そのメッシュと植物を廃棄します。細菌増殖液の各ウェルに1つのフロートを転送し、根側を下にします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>浮遊苗を含む井戸に細菌を接種する。<ol>
<li>寒天プレート上で一晩増殖した細菌を、細菌増殖培地中液中の108 CFU/mLに相当するOD600に再停止する。各ウェルに10 μLの細菌懸濁液を加え、ウェル当たり106 CFU細菌の最終濃度を確認します。</li>
		<li>細菌の混合物を調製する場合は、それぞれ108 CFU/mLに相当するOD600に再中断し、等しい割合で混合し、液体のウェルあたりの最終ミックスの10 μLを追加する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>無菌成長のためにプレートを密封してください。粘着性の側に触れることなく、慎重にプレート全体にガス透過性フィルムを押します。各井戸がウェルによって作られたリングの周りに圧力をかけることによって、各井戸が個別に密封されていることを確認してください。プレートとガス透過性フィルムの上にプレートのプラスチック蓋をぴったりと交換してください(図1、ステップ3b)。</li>
	<li>植物成長室で18時間プレートをインキュベートし、苗が最初に発芽したのと同じ条件下で、220rpmに設定された軌道プレートシェーカーを除く。</li>
</ol>4. 細菌の植民地化の維持
<ol><li>すべてのフロート(メッシュ上の植物)をすすいで、新しい24ウェルプレートの井戸に滅菌水の1 mLを追加します。ガス透過性フィルムを取り除く。滅菌鉗子を使用して、水で井戸に浮遊物を移す(図1、ステップ4a)。撹拌することなく室温(RT)で10分間休息して洗い出す。 注:時間の経過とともに植民地化を維持する能力ではなく、根の細菌の植民地化効率を決定するために、植物はステップ5.1に直接それらを取ることによって、このステップで犠牲にすることができます。</li>
	<li>植物成長培地の1 mLで新しい24ウェルプレートの井戸を埋めます。各ウェルに 1 つのメッシュを転送します。ガス透過性シールで覆い、植物成長室の220rpmで軌道プレートシェーカー上で72時間インキュベートします(図1、ステップ4b)。</li>
	<li>72時間のインキュベーション期間の後に浮動小数点でステップ4.1で行われたようにすすを繰り返します。</li>
</ol>5. 生存細胞数のための細菌の採取
注:苗根あたりの細菌数は、任意のインキュベーションタイムポイントで決定することができる。植民地化は0時間から18時間の間に監視することができ、維持は18時間以降に監視することができる。イメージングのために運命づけられた植物は、セクション6に直接進むことができる。
<ol><li>メッシュから苗を取り除きます(図1、ステップ5)。葉の下に火炎殺菌鉗子をそっと置き(しかし、メッシュの葉側に)、茎を軽くつまみます。苗を上下に動かして、根を壊さずに根を外します。ルートが壊れた場合は、メッシュの底部をそっとこすり、全長を収集します。</li>
	<li>植物の根から細菌を取り除きます。dh2 0の1 mLを含む24ウェルプレートのウェルに細菌を移す。ステップ1.3で説明されているようにサンプルを超音波処理します。 注:顕微鏡を使用して、超音波処理されたサンプルの根表面に残っている細菌を探します。細菌が残っている場合は、細菌が結合しないまで総超音波処理時間または強度を増加し、セクション1で決定される生存細胞数に影響を与えない最高レベルの超音波処理まで。</li>
	<li>根の細菌を定量化します。<ol>
<li>細菌増殖培地で10-6希釈まで超音波処理サンプルの連続10倍希釈を行う。個々の寒天プレートに各希釈の50 μLを追加し、滅菌ガラスビーズ(または細菌拡散機)で広げます。個々のコロニーがカウント可能になるまで、細菌に最適な温度でプレートをインキュベートします。</li>
		<li>一旦区別可能な場合は、各コロニー形態の数(セクション1で決定)をカウントし、苗ごとに各細菌種のCFUを計算する。植民地化またはメンテナンス中の汚染が細菌の存在に影響を与える可能性があるため、汚染を示すサンプルを廃棄してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 顕微鏡検査のための無傷の植物根のコレクション
<ol><li>鉗子を使用して、セクション 5 のようにメッシュから苗を取り除きます。</li>
	<li>各プラントを顕微鏡スライドに転送します。<ol>
<li>スライド上に根の先端を置き、先端から離れてドラッグして、スライドで撮影をフラッシュし、最適なイメージングのためのまっすぐなルートを確保します。サンプルに一滴の水または無菌植物成長培地を加え、カバースリップとスライドの間のインターフェースを水和します。</li>
		<li>根のリューズのすぐ上(図1の最上部のボックス領域)の上にガラスカバースリップを配置し、カバースリップの傾斜を避けるために撮影葉の下に(ルートクラウンイメージングを可能にするために)、穏やかに17を押します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>蛍光細菌を用いる場合、適切な励起/発光フィルターを用いて細菌を互いに区別する画像と植物根18。</li>
</ol>

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</ol>

著者は何も開示していない。

すべての環境の植物は、異なる細菌や真菌の数百万に数千人と相互作用5,7.これらの相互作用は、作物の収量と食糧生産に潜在的な影響を及ぼす植物の健康にマイナスと肯定的な影響を与えることができます。最近の研究はまた、PGPUによる作物の可変植民地化が、フィールドトライアル22における予測不可能な植物サイズと作物収量を占める可能性があることを示唆している。これらの相互作用の背後にあるメカニズムを理解することは、ストレス24の下でも、植物関連の微生物群相を直接操作して、健康な植物の開発を支援することを可能にするかもしれません。
根の細菌の植民地化と根間の維持は植物微生物の相互作用9にとって重要であるため、これらの細菌行動を再現的に可視化し、定量化するシステムを構築したいと考えました。この水耕栽培、浮遊苗成長システムは、A.タリ...

細菌や真菌性疾患による作物の破壊は、食糧生産の低下を引き起こし、世界的な安定性を著しく破壊する可能性があります1.抑制土壌中の微生物が植物の健康を増大させる原因であるという発見に基づいて、科学者は、植物の微生物叢が特定の存在と豊富さを修正することによって植物の成長をサポートするために利用することができるかどうか尋ねました。細菌種3.植物の成長または発達を助けるために見出された細菌は、総称して植物成長促進細菌(PGPB)と呼ばれています。最近では、潜在的なPGPBを特定するだけの研究から、土壌、根の周り、根間(根表面を含む直接周囲および根表面を含む領域)における王国間相互作用がPGPBにどのように影響しているかを理解することにシフトしています。アクティビティ4.
PGPBによる根圏の植民地化は、未植民地化された植物に対する多様なストレスに応じて宿主植物の健康または発達を増加させることができる5.しかし、結果は、多くの場合、密接に制御された温室および実験室の設定6で観察されるものと比較して、ネイティブ土壌条件でより可変である。この違いの1つの仮説は、PGPBの増殖または挙動が、フィールド7、8における天然土壌細菌または真菌によって阻害されうるということです。根間細菌による有益な効果は、一般に、1)根に向かって移動する細菌の能力に依存し、2)バイオフィルム形成を通じて根を植民地化し、3)小分子の産生を介して宿主植物または病原体と相互作用する。代謝産物7,9.これらの植民地化行動のいずれも、隣接する微生物10の存在および活性の影響を受ける可能性がある。
我々は、根圏のこれらの異なる細菌の植民地化段階を定量化し、視覚化するシステムを設計した(図1)。このアプローチは、接種前の苗の植え付け中など、植物を新しい環境に移した後に、長期的なPGPB維持が観察されない理由を調査する研究を容易にする。アラビドプシスタリアナは、実験室研究における広範な使用だけでなく、その微生物相互作用に関する利用可能な十分なデータ11のために植物モデルとして選ばれました。システムには3つの段階があります:1)A.タリアナ増殖、2)細菌の植民地化、および3)細菌の維持(図1参照)。A.タリアナは陸上植物であるため、水耕系12において過度の水ストレスに苦しんでいないことを確認することが重要であった。Haney et al.13によって使用される方法に触発され、苗は液体成長媒体から芽を分離するためにプラスチックメッシュ上で成長する。このシステムは、植物宿主の健康と発達を損なっているようには見えず、液体11におけるA.タリアナの成長を改善する。植物の芽が表面の上に浮かぶと、根は液体細菌増殖培地に接種された細菌によって植民地化に完全にさらされる。これにより、成長に最も役立つ栄養素の植民地化を調べ、その後、植物がその成長をサポートするように設計された栄養培地で成長し続けられるように条件をシフトすることができます。両方の段階は、根13の無酸素症を防ぐために安定した揺れを含む。細菌は、コロニー化媒体または維持培地のいずれかからの転移後に植物根から可視化または定量することができる。この水耕栽培システムは非常に柔軟であり、研究者の興味に応じて実験条件や適用応力を容易に変更することができます。
この説明された方法は、植物微生物の相互作用に関するより大きな文献の文脈において重要である。異なる細菌。植物生物学研究室は、多くの場合、固体寒天に植物微生物の植民地化実験を行い、細菌の平面移動(もしそうなら)のみを可能にする一方で、その後の移植中に植物の潜在的に破壊的な操作を必要とします。対照的に、微生物学研究室は、頻繁に彼らの実験内の細菌の健康を優先し、植物14、15の不利益に。植物および微生物に焦点を当てたラボのこれらの異なる優先順位は、これらのグループ間の結果を比較することが歴史的に困難になってきた, それぞれが通常、関心のある彼らの生物を最適化するために実験条件を最適化するので15.ここで説明するフローティングメッシュ植物成長システムは、これまでの微生物学指向の研究に顕著な利点である完全な植物の浸漬を防ぎ、同時に、コロニー化を容易にするために細菌の成長と生存を一時的に最適化する。したがって、ここで提示するアッセイは、微生物学者の基準を満たしながら、植物生物学者(植物の過剰水和と触覚操作に関する)の両方の懸念に対処する可能性があります(異なる細菌の増殖条件と複数を可能にする)。種の相互作用)7.このプロトコルは、様々な細菌、植物、および環境条件での使用に適応できるように設計されています。

<table><tbody><tr><td> 必要な材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL エッペンドルフチューブ</td><td>任意の</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>24 ウェルプレート</td><td>BD Falcon</td><td>1801343</td><td></td></tr><tr><td>Aeraseal</td><td>Excel Scientific</td><td>BE255A2</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>any</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bacteria of Interest</td><td></td> any <td>N/A</td><td>Stored at -80?40%グリセロール中のC</td></tr>は<tr><td>、BactoAgar</td><td>BD</td><td>2306428を優先します。参照214010</td><td></td></tr><tr><td>漂白剤</td><td>任意の</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>コンビロン</td><td>任意の</td><td>N / A</td><td>短日ライトダークサイクル:460-600 &モル/m&sup2;/s 9/15 hours 18/21 に明るさ/暗さを設定しますか?C、内部電源コンセント付き</td></tr><tr><td>デシケータージャー:ガラスまたは重いプラスチック</td><td>任意の</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>エタノール 任意の</td><td></td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>炎</td><td>任意の</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>任意の</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td> 任意の<td></td><td>N / A</td><td>特定の細菌の成長に最適な温度で</td></tr><tr><td>塩酸</td><td>任意の</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>レノックスLBブロス</td><td>RPI</td><td>L24066-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心分離</td>機<td>任意の</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペッター</td><td>任意の</td><td>N / A</td><td>ボリューム5 &micro;Lから1000&micro;L</td></tr><tr><td>顕微鏡(できれば蛍光)</td><td>任意の</td><td>N / A</td><td>は、最良の定義が重要でない場合、軽い可能性があります</td></tr><tr><td>MSソルト+ MES</td><td>RPI</td><td>M70300-50.0</td><td></td></tr>オー<tr><td>ビタルプレートシェーカー任意の</td><td></td><td>N / A</td>少なくとも<td>96時間220rpmで動作することができます</td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>任意の</td><td>N / A50mL</td><td>の総容量</td></tr><tr><td>リザーバー任意の</td><td></td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>任意の</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>標準穴パンチ</td><td>任意の</td><td>N/A</td><td>約7mmのパンチ直径</td></tr><tr><td>滅菌水</td><td>任意の</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>サージカルテープ</td><td>3M</td><td>MMM1538-1</td><td></td></tr><tr><td>テフロンメッシュ</td><td>McMaster-Carr</td><td>1100t41</td><td></td></tr><tr><td>超音波装置</td><td></td><td>任意の N/A</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>任意の</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>GoldBio</td><td>x4281c</td><td>他のベンダー 利用可能</td></tr><tr><td> 推奨 材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 プロング 超音波装置 アタッチメント</td><td>任意の</td><td>N/A</td><td>一度に複数のサンプルを超音波処理するため。個別に行うことができます</td></tr><tr><td>Alumaseal II</td><td>Excel Scientific</td><td>FE124F</td><td></td></tr><tr><td>ガラスビーズ</td><td>任意の</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>マルチペッター/レペッター</td><td>任意の</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>滅菌96ウェルプレート</td><td>任意の</td><td>N/A</td><td>連続希釈用。エッペンドルフチューブ</td></tr><tr><td>Biological 材料 使用</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arabidopsis thaliana 種子</td><td></td><td>任意の N/A</td><td>種子ストック</td></tr><tr><td>Arthrobacter nicotinovorans</td><td></td><td></td><td>Levy, et al. 2018</td></tr><tr><td>Curtobacteriumoceanosedimentum</td><td></td><td></td><td>Levy, et al. 2018</td></tr><tr><td>Microbacterium oleivorans</td><td></td><td></td><td>Levy, et al. 2018</td></tr><tr><td>Pseudomonas simiae WCS417r</td><td></td><td></td><td>Haney, et al. 2015年に同様のシステムで公開されました。Cole, et al. 2017</emで開発された使用株></td></tr></tbody></table>

浮遊水耕システムにおけるアラビドプシス・タリアナ根の細菌の植民地化と維持のモニタリング

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

細菌は、微生物、より大きな生物、および生物学的環境との相互作用によって形成された複雑な根茎圏微生物叢を形成する。実験室条件下では、植物成長促進細菌(PGPB)による根圏コロニー化は、未植民地化された植物に対する宿主植物の健康または発達を増加させることができる。しかし、フィールド設定では、PGPBによる細菌治療は、多くの場合、作物に実質的な利益を提供しません。1つの説明は、これは植物の寿命にわたって内因性土壌微生物との相互作用中にPGPBの損失に起因する可能性があることです。ほとんどの研究は、根茎群科内のPGPBの維持よりも初期の植民地化に焦点を当てているので、この可能性を確認することは困難でした。ここでは、細菌群集の組み立て、共存、維持は根圏微小環境の決定的特徴によって形成され、これらの相互作用がネイティブ環境におけるPGPB生存に影響を与える可能性があると仮定されている。これらの行動を研究するために、水耕植物成長アッセイは、植物の根の初期植民地化中および異なる成長への転移後の細菌の空間分布を定量化し、視覚化するためにアラビドプシスタリアナを使用して最適化されています。環境。このシステムの再現性と有用性は、よく研究されたPGPBシュードモナス・シミアで検証されます。複数の細菌種の存在が植物根の植民地化と維持のダイナミクスにどのように影響するかを調べるために、3つの細菌株(Arthrobacter、Curtobacterium、およびマイクロバクテリウム)からのモデルコミュニティ種)はもともとA.タリアナ根圏から単離され構築される。これらの多様な細菌種の存在は、シーケンシングベースの細菌コミュニティ研究に代わるものとなるこの水耕植物主化アッセイを用いて測定できることが示されている。このシステムを用いた今後の研究は、多種植物微生物叢の細菌行動の理解を時間の経過と共に、環境条件の変化に改善する可能性がある。

よく特徴付けられたPGPB P.シミアエWCS417rは、水耕栽培におけるA.タリアナの根を植民地化することが知られている。この自然蛍光菌は、植民地化後の苗根の顕微鏡検査を用いて容易に可視化できる(図2)。これらのA.タリアナ苗の全長(4-6ミリメートルの長さ)の根を画像化することは可能ですが、多くの植物のためにそうすることは非常に多くの時間がかかります。時間ポイントと細菌の種間のほとんどの変動は、根14のクラウン、中央、先端をイメージングすることによって捕捉することができるので(図1の赤いボックスで示す)、これらの領域は、完全な根をイメージングするのではなく、イメージングのために優先順位が付けられました。長さ。P.シミアエ-植民地化A.タリアナ根(図2)の明...

ここでは、種の存在を定量化し、植物の根の初期植民地化時および異なる成長環境への移動後の細菌の空間分布を可視化するための水耕植物成長アッセイについて説明する。

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, ...

ほとんどの実験は、植民地化に焦点を当てて植物微生物の相互作用を研究しますが、私たちのプロトコルは、根の細菌のコロニー形成と維持の両方を見るように設計されています。実験は異なる細菌や植物に合わせて変更することができ、各24ウェルプレートで複数の細菌をテストすることさえできます。まず、標準のパンチングを使用してプラスチックメッシュのディスクを作成します。ガラス容器にディスクを集め、ゆるく覆います。20分間のドライサイクルにセットしたオートクレーブを使用して滅菌します。炎滅菌されたピンセットを使用して、以前に調製した植物成長培地寒天プレートの表面全体に、1層に約40個の滅菌メッシュディスクを分配します。2つの以前に殺菌された種子を各メッシュの中心に置きます。外科用テープでプレートを密封し、暗闇の中で摂氏4度で2〜6日間インキュベートして種子を春にします。その後、プレート寒天側を植物成長室に8〜10日間置き、摂氏21度で9時間の光と18°Cの暗さの15時間を使用して苗を発芽させ、成長させます。滅菌24ウェルプレートの各ウェルに細菌増殖培地を1ミリリットル加えます。メッシュに埋め込まれた発芽した苗を転送するには、炎滅菌鉗子を使用して、2つの発芽した、等しいサイズ、損傷していない苗を含むメッシュを寒天プレートの上下に静かに剥がします。苗と一緒に1つのフロートを細菌増殖液の各ウェルに移し、根側を下にします。次に、液体細菌増殖培地中の寒天プレート上で一晩増殖した細菌を再懸濁させる。各井戸に10マイクロリットルの細菌懸濁液を加え、メディア専用の制御井戸を除き、井戸あたり100万個のコロニー形成細菌ユニットの最終濃度を得る。滅菌成長のためにプレートを密封するには、粘着面に触れることなく、慎重にプレート全体に気体透過性フィルムを押してください。各ウェルが個別に密封されていることを確認するために、ウェルによって作られたリングの周りに圧力を適用します。次に、プラスチック製の蓋をガス透過性フィルムの上にぴったりと閉じます。220rpmに設定された軌道プレートシェーカー上の植物成長室にプレートを置き、苗を発芽させたのと同じ条件で18時間インキュベートします。すべてのフロートを植物ですすいするには、新しい24ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルの無菌水を加えます。植物でプレートからガス透過性フィルムを取り除き、滅菌鉗子を使用して水でウェルにフロートを移し、攪拌することなく室温で10分間インキュベートします。次に、新しい24ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルの植物成長培地を充填します。各ウェルに1つのメッシュを転送し、ガス透過シールで覆います。植物成長チャンバーで220rpmで軌道プレートシェーカーで72時間インキュベート。インキュベーション後、前に行ったように植物をすすいでください。すすぐ後、メッシュの葉の下に炎で殺菌した鉗子をそっと置くことによって、メッシュから苗を取り除きます。茎を軽くつまみ、苗をメッシュから上下に動かし、根を壊さずに外します。植物の根から細菌を除去するには、各メッシュから苗を1ミリリットルの二重蒸留水を含む24ウェル超音波処理プレートの個々の井戸に移します。原稿に記載されているように多面的なソニケーターを使用して、一度にプレート内のすべてのサンプルを超音波処理します。細菌を定量化するには、細菌増殖培地中の超音波処理されたサンプルの連続10倍希釈を行う。滅菌ガラスビーズを使用して広がり、個々のコロニーが数えられるまで細菌の最適な温度でインキュベートする。無傷の植物の根を収集するには、フォースを使用してメッシュから苗を取り除きます。次に、各植物を顕微鏡スライドに移し、先端から引きずり出してスライドと一緒に撮影を下ろし、最良のイメージングのためにまっすぐな根を確保します。各サンプルに水または無菌植物成長培地を一滴加え、カバーリップとスライド間のインターフェースを水和します。カバースリップの傾斜を避けるために、ガラスカバースリップを根冠のすぐ上とシュートリーフの下に置き、穏やかに押し下げます。次に、適切な励起/放出フィルタを使用して細菌を画像化し、細菌同士と植物根とを区別します。シュードモナス・シミアエは、天然蛍光細菌、シロイヌナズナタリアナ根をコロニー化し、植物成長培地への移入後根上に維持した。根冠、中長、および先端はシュードモナスシミエのコロニー形成による蛍光を示す。無細菌陰性対照はコロニー形成を示さなかった。シロイナナナのシミアエを18時間の植民地化または72時間の維持後に定量化した場合、いずれの時点でも苗あたりのコロニー形成ユニットの総数は、異なる日に行われた生物学的複製全体にわたって良好な再現性を示した。維持培地中で72時間後に苗1当たりのコロニー形成単位の数が増加したところ、コロニー形成後18時間の時点で観察された数と比較して、植物根上のコロニー形成菌の活性成長が維持段階で起こったことを示す。実験室の条件下で自然土壌で成長したシロイヌナズナから分離された細菌の3種を使用して、植物の根に複数の種の関連を監視した。彼らはコロニーの形態と色の違いのためにX-galを含むメディア上で明確に区別され、多種の共同培養でも、抗生物質を選択せずに各種の苗ごとにコロニー形成単位を数えることを可能にした。これらの3種の細菌はすべてコロニー形成され、単独であれ細菌の共同培養であれ、根上で維持された。各種は、異なる生物学的および技術的複製にわたって類似した傾向を示し、このプロトコルは、各種の根元当たりの相対的または総コロニー形成ユニットの両方を測定するために使用できることを示した。単独で増殖した場合、個々の種は維持段階で豊富な量の大幅な増加を示さなかったが、結合されたコミュニティの根元当たりの全体的なコロニー形成単位は、共培養において増加し、これらの細菌が他の株のコロニー形成を禁止していないことを示している。最も困難なステップは、メッシュディスクから無傷の植物を除去する必要があるステップです。忍耐強く、穏やかであることは、これを可能にします。細菌細胞が蛍光性である場合、サンプルをフローサイトメトリーで選別して、細胞の相対数を決定することができます。

monitoring-bacterial-colonization-maintenance-on-arabidopsis-thaliana

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

出典: Nathoo、N.、 et al.植物/微生物の分子相互作用とシグナル伝達の同時かつ体系的な解析のための水耕共栽培システム J. Vis. 経験。 (2017)。このビデオは、無菌条件下での植物と細菌の相互作用を研究するための水耕栽培共栽培システムを示しています。植物の苗木は、...

植物宿主と相互作用する細菌の分子応答を研究するための共培養システム

出典: Harris, S. L. ほか浮遊式水耕栽培システムにおける シロイナズプシス・タリアナ 根の細菌定着と維持管理のモニタリング。 J. Vis. Exp. (2019年)この動画は、土壌のない土壌で育つ シロイヌナ...

土壌のないシステムにおける シロイナドプシス・タリアナ 根の細菌定着の監視

病原体の成長の定量化は、様々なシロイヌナズナ(以下:シロイヌナズナ)の免疫応答を特徴づける強力なツールです。ここで説明する方法は、Pseudomonas syringae...

使用した植物防御応答のファインキャラクタリゼーションのための細菌の葉浸潤アッセイ<em&gt;シロイヌナズナシュードモナスシリン</em&gt; Pathosystem

記載された水耕共培養システムは、金属メッシュスクリーンを有する完全な植物を支持し、それらを細菌と共培養する。植物組織、細菌、および分泌された分子は、下流の分析のために別々に採取することができ、同時に植物宿主および相互作用する微生物または微生物の両方の分子応答を調べることができる。...

植物/微生物の分子相互作用およびシグナル伝達の同時および系統的分析のための水耕栽培共生システム

この資料は、主根と 1 つの光学的平面に根毛を閉じ込めた 2...

二層流体プラットフォームシロイヌナズナ実生の根毛の形態のイメージング

単純な汎用性、および低コストの in vitro水耕システムが正常に最適化されて、無菌条件下で大規模な実験を有効にします。このシステム...

無菌状態で小さな分子に対する植物の反応を評価するための柔軟な低コスト化の養液栽培システム

簡単な実験ツールを使用して、シロイヌナズナとメディカゴの根系アーキテクチャ(RSA)を調べます。小植物はメッシュ上で水耕栽培され、アートブラシを使用して広げられ、RSAが明らかになります。画像はスキャンまたは高解像度カメラを使用して撮影され、ImageJで分析されて形質をマッピングします。...

植物の根系アーキテクチャ特性をマッピングするための簡単なプロトコル

微生物の有無にかかわらず、系統発生的に異なるさまざまな植物の成長をサポートするガラスベースの半水耕栽培実験システムのプロトコルを提示します。このシステムは、さまざまな増殖培地と互換性があり、下流分析のための非破壊的な根滲出液サンプリングを可能にします。...

半水耕栽培の根滲出液プロファイリングのための汎用性の高いガラスジャーシステム

根圏における植物成長促進根圏細菌(PGPR)のコロニー形成は、その成長促進効果に不可欠です。細菌の根圏コロニー形成の検出方法を標準化する必要があります。ここでは、根の表面での細菌のコロニー形成を定量化するための再現性のある方法について説明します。...

水耕栽培状態における シロイヌナズ ナの根の細菌コロニー形成の測定

のための免疫担当マウスにおける漿液性卵巣癌の同所性モデル in vivoで</em腫瘍免疫応答の>腫瘍イメージングとモニタリング

学ぶ 浮遊水耕システムを用いたArabidopsis thaliana根への細菌植民地化と維持の定量法。複数菌種の同時評価が可能で、植物と微生物の相互作用を可視化する実験手法です。

浮遊水耕システムにおけるアラビドプシス・タリアナ根の細菌の植民地化と維持のモニタリング

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