Name: ショウジョウバエメラメラノガスターにおける内分泌破壊を試験する方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 学ぶ内分泌破壊化学物質の影響評価法。Drosophila melanogasterを用いて生殖能力、発育時間、寿命を測定し、生体内での毒性効果を簡便かつ迅速に解析する実験プロトコルを解説します。

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著者は、技術サポートのためのオルソリナペティロに感謝します。著者らは、書誌のサポートのためにマリアロサリア・アレッタ博士(CNR)に感謝しています。著者らは、EDCの世界にそれらを紹介してくれたグスタボ・ダミアーノ・ミタ博士に感謝しています。著者らはライカ・マイクロシステムズとパスクアレ・ロマーノの支援に感謝している。この研究は、プロジェクトPON03PE_00110_1によってサポートされました。「スヴィルッポ・ディ・ナノテクノロジー・オリエンテート・アッラ・リジェネラツィオーネ・エ・リコストルツィオーネ・ティスタレ、オドントニアトリア/オキュリスティカのインプラントロジアeセンシスティカ」アクロニモ「SORRISO」;コミットメント: PO FESR 2014-2020 カンパニア;プロジェクトPO FESRカンパニア2007-2013 「IL RILASCIOコントロールラートディモレコールバイオ熱性ナノテクノロジロジーあたりナノテクノロジー」。

著者は何も開示していない。

フルーツフライD.メラノガスターは、DBP28、BPA、4-NP、4-tert-OP29、MP30、EP31などの環境EDCの潜在的な影響を調査するインビボモデルシステムとして広く採用されています。32、DEHP33、および EE234.いくつかの理由は、研究のこの分野のモデルとしての使用をリードしています。モデルシステムとしての議論の余地のない利点とは別に、ショウジョウバエはヒトと高度な遺伝子保全を共有しており、ショウジョウバエEDCアッセイは人間の健康に対する潜在的な影響を予測または示唆するのに役立つ可能性があります。さらに、ショウジョウバエは、すべての生態系で広く表され、EDCの有害な影響に対するより大きな保護措置を必要とする無脊椎動物に属しています。無脊椎動物...

人間の活動は、生物と自然生態系の深刻な問題を表す大量の化学物質を環境に放出しています1.これらの汚染物質のうち、約1,000種類の化学物質が内分泌系の正常なバランスを変える可能性があると推定されています。この特性によると、それらは内分泌破壊化学物質(EDC)として分類される。具体的には、内分泌学会による最近の定義に基づいて、EDCは「外因性化学物質、または化学物質の混合物であり、ホルモン作用のあらゆる側面を妨害する可能性がある」2.過去30年間にわたり、EDCが動物や植物の生殖と発達に影響を与える可能性があるという科学的証拠が増えてきた3、4、5、6、7、 8.また、EDC曝露は、癌、肥満、糖尿病、甲状腺疾患、および行動障害9、10、11を含む一部のヒト疾患の有病率の増加に関連している。
EDCの一般的なメカニズム
その分子特性のために、EDCはホルモンまたはホルモン前駆体3、4、5、6、7、8、9のように振る舞う10、11、12.この意味で, 彼らはホルモンの受容体に結合し、ホルモン活性を模倣することによって、または内因性ホルモンの結合をブロックすることによって内分泌系を破壊することができます。.最初のケースで, 受容体に結合した後, 彼らは、その自然なホルモンが行うようにそれを活性化することができます。.他のケースでは、受容体へのEDCの結合は、その天然ホルモンの結合を防ぐので、受容体はブロックされ、もはやその天然ホルモン3の存在下でも活性化されなくなる。その結果、EDCは、恒常性、生殖、発達、および/または行動の維持を担う内因性ホルモンの合成、分泌、輸送、代謝、または末梢作用などのいくつかのプロセスに影響を与える可能性があります。生物。受容体結合は、EDCのためにこれまでに説明した唯一の作用方法ではありません。酵素経路でコアクティベーターやコアプレッサを募集したり、遺伝子発現10、11、12、13を調節するエピジェネティックマーカーを改変したりすることで、彼らも行動できることが明らかになりました。 、14は、現在の世代のためだけでなく、8来る世代の健康のためにも影響を与えます。
ショウジョウバエホルモン
選択されたEDCの潜在的な効果は、野生生物種と内分泌機構が合理的によく知られているいくつかのモデルシステムの両方で広く研究されている。無脊椎動物の場合、成長、発達、生殖に影響を与える内分泌系は、生物学的研究の分野での広範な使用、その経済的重要性、およびいくつかの理由から昆虫に広く特徴付けられてきた。最後に、害虫のホルモン系に特異的に干渉することができる殺虫剤の開発。
特に、昆虫の中で、フルーツフライD.メラノガスターは、EDCの潜在的な内分泌効果を評価する非常に強力なモデルシステムであることが証明されています。D. メラノガスターでは、脊椎動物と同様に、ホルモンはライフサイクル全体を通じて重要な役割を果たします。この生物には、ステロイドホルモン20-ヒドロキシエキシダイソン(20E)15、16、セシテルペノイド若年ホルモン(JH)17、および神経ペプチドおよびペプチド/タンパク質を含む3つの主要なホルモン系があります。ホルモン18.この3番目のグループは、より最近発見されたいくつかのペプチドから成りますが、長寿、恒常性、代謝、生殖、記憶、およびロコモータ制御などの生理学的および行動過程の膨大な多様性に明らかに関与しています。20Eは、エストラジオールなどのコレステロール由来のステロイドホルモンと相同であり、JHはレチノイン酸といくつかの類似点を共有している。それらの両方は、ショウジョウバエ19、20のよく知られているホルモンです。そのバランスは、モルティングと変態を調整するだけでなく、再生、寿命、行動21などのいくつかの発達後プロセスを制御する上で重要であり、内分泌をテストするための異なる可能性を提供します。ショウジョウバエの破壊。また、エジステロイドホルモンおよびJHは、いわゆる第三世代殺虫剤の主な標的であり、昆虫における発達および生殖内分泌媒介プロセスを妨害するために開発される。これらの化学物質のアゴニストまたはアンタゴニストモードはよく知られており、したがって、昆虫の成長、生殖、および発達に及ぼす潜在的なEDCの影響を評価するための基準として役立つことができる22。例えば、蚊や他の水生昆虫23、24の制御に広く使用されているメトプレンは、JHアゴニストとして働き、20E誘発遺伝子転写および変態を抑制する。
ホルモンに加えて, ショウジョウバエの核受容体 (NR) スーパーファミリーもよく知られています。;それは、ホルモン依存性発達経路の制御に関与する18の進化的に保存された転写因子、ならびに生殖および生理学25から成っている。これらのホルモンNRは、神経伝達26に関与するもの、レチノイン酸NR用の2つ、および脊椎動物においてEDC27の主要な標的の1つを表すステロイドNR用のサブタイプを含む、6つのNRスーパーファミリーサブタイプすべてに属する。
EDCを研究するためのモデルシステムとしてのショウジョウバエ
現在、分子特性に基づいて、世界中のいくつかの環境機関は、異なる人工化学物質に内分泌系を妨害する可能性に起因しています。EDCが環境と生物にとって世界的かつユビキタスな問題であることを考えると、この分野の研究の全体的な目標は、病気の負担を軽減し、生物をその悪影響から保護することです。化学物質の潜在的な内分泌効果についての理解を深めるためには、生体内でそれをテストする必要があります。この目的のために、D.メラノガスターは有効なモデルシステムを表す。今日まで、フルーツフライは、いくつかの環境EDCの効果を評価するために、生体内モデルとして広く使用されてきました。ジブチルフタル酸エステル(DBP)28、ビスフェノールA(BPA)、4-ノニルフェノール(4-NP)、4-テルオクチルフェノール(4-テルト-OP)29、メチルパラベン(MP)30、エチルパラベン(EP)31などのいくつかのEDCへの暴露が報告されています。32、ビス-(2-エチルヘキシル)フタル酸エステル(DEHP)33、および17−α-エチニルエストラジオール(EE2)34は、脊椎動物モデルのように代謝および内分泌機能に影響を与える。いくつかの理由は、研究のこの分野でモデルとしての使用につながっています.内分泌系に関する優れた知識を超えて、その短いライフサイクル、低コスト、簡単に実行可能なゲノム、研究の長い歴史、およびいくつかの技術的な可能性が含まれます(FlyBaseのウェブサイト、http://flybase.org/参照)。D. メラノガスターはまた、環境要因8に対する世代間の影響と集団応答を容易に研究するための強力なモデルを提供し、高等動物の生体内研究に関連する倫理的な問題を回避する。さらに、フルーツフライは、ヒトと高度な遺伝子保全を共有しており、ショウジョウバエEDCアッセイがヒトの健康に対するこれらの化学物質の潜在的な影響を予測または示唆するのに役立つ可能性があります。ショウジョウバエは、人間の健康への影響に関する理解を深めるだけでなく、生物多様性の喪失や環境の劣化など、環境へのEDC曝露のリスクを評価するのに役立ちます。最後に、フルーツフライは、その開発、生殖、寿命に影響を与える可能性のある要因が、試験される物質に任意のバリエーションを帰属させるために制御下に保つことができる実験室で使用されるという付加的な利点を提供します。
この念頭に置いて、我々は、例えば、性欲/生殖能力、発達のタイミング、成人の寿命など、いくつかのショウジョウバエホルモン特性に対するEDC効果を決定するためのシンプルで堅牢なフィットネスアッセイを最適化しました。これらのアッセイは、一部のEDC23、24、25、26、27に広く使用されています。特に、合成エストロゲンEE234への曝露の影響を評価し、BPAおよびビスフェノールAF(BPA F)(未発表データ)への影響を評価するために、以下のプロトコルを使用した。これらのプロトコルは、一度に所定のEDCの効果、ならびにD.メラノガスターにおける複数のEDCの組み合わせ効果を調べるために容易に変更することができる。

<table><tbody><tr><td>17&alpha;-エチニルエストラジオール</td><td>シグマ</td><td>E4876-1G</td><td></td></tr><tr><td>寒天ショウジョウバエ培地</td><td>バイオシグマ</td><td>789148</td><td></td></tr><tr><td>ビスフェノールA</td><td>シグマ</td><td>239658-50G</td><td></td></tr><tr><td>ビスフェノールAF</td><td>シグマ</td><td>90477-100MG</td><td></td></tr><tr><td>コーンミール</td><td>CA'ビアンカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ジエチルエーテル</td><td>シグマ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ショウジョウバエバイアル</td><td>BIOSIGMA</td><td>789008</td><td>25 mm x 95 mm</td></tr><tr><td>ショウジョウバエバイアル</td><td>BIOSIGMA</td><td>789009</td><td>29 mm x 95 mm</td></tr><tr><td>ショウジョウバエバイアル</td><td>Kaltek</td><td>187</td><td>22 mm x 63 mm</td></tr><tr><td>胚収集ケージ</td><td>クラフト</td><td></td>プレ<td>キシガラスシリンダー(12.5 mm x 7 cm)は、開放端ともう一方の端が長方形のベースで閉じられており、スロットが挿入を可能にします。</td></tr><tr><td>エタノール</td>FLUKA2860<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>エーサライザー</td><td></td><td></td>クラフトコットン<td>プラグ付き円筒形ガラス容器</td></tr>ガラス<tr><td>ボトル</td><td></td><td></td><td>250mLボトルガラス</td></tr><tr><td>バイアルMicrotechST10024</td><td></td><td></td><td>フラットボトムチューブ100 x 24</td></tr><tr><td>ハンドブレンダーピミー</td><td>アリエテ</td><td></td><td>フードプロセッサー</td></tr><tr><td>インスタントサクセス酵母</td><td>ESKA</td><td></td><td>粉末酵母</td></tr><tr><td>敷設トレイ</td><td>クラフト</td><td></td><td>プレキシガラストレイ (11 cm x 2.6 cm) を敷設するための媒体を注</td></tr>ぐ <tr><td>Methyl4-hydroxy安息香酸</td><td>SIGMA</td><td>H5501</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>Falcon</td><td>351016</td><td>60x5</td></tr><tr><td>赤色染料 No. 40</td><td>SIGMA</td><td>16035</td><td></td></tr><tr><td>LEDライト付き実体顕微鏡</td><td>ライカ</td><td></td><td>S4E</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>HIMEDIA</td><td>MB025</td><td></td></tr><tr><td>トマトソース</td><td>Cirio</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ショウジョウバエメラメラノガスターにおける内分泌破壊を試験する方法

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

近年、すべての生物と環境が内分泌破壊物質(EDC)として知られているホルモンのような化学物質にさらされているという証拠が増えています。これらの化学物質は、内分泌系の正常なバランスを変更し、副作用につながる可能性があります, だけでなく、人間の集団内のホルモン障害の増加や成長を妨げ、野生生物種の繁殖を減少.一部の EDC では、健康への影響と使用に関する制限が文書化されています。しかし、それらのほとんどのために、この意味ではまだ科学的証拠がありません。完全な生物における化学物質の潜在的な内分泌効果を検証するためには、適切なモデルシステム、ならびにフルーツフライ、ショウジョウバエメラノガスターでテストする必要があります。ここでは、ショウジョウバエにおける内分泌破壊を研究するために生体内プロトコルで詳細に報告し、ハエの胎児/生殖能力、発達時期、寿命に対するEDCの影響に対処する。ここ数年、これらのショウジョウバエの生命特性を用いて、17-α-エチニルエストラジオール(EE2)、ビスフェノールA(BPA)、ビスフェノールAF(BPA F)への曝露の影響を調べた。全体として、これらのアッセイは、すべてのショウジョウバエのライフステージをカバーし、すべてのホルモン媒介プロセスにおける内分泌破壊を評価することを可能にしました。胎児/不妊症および発達タイミングアッセイは、それぞれ、ハエの生殖性能および発達段階におけるEDCの影響を測定するのに有用であった。最後に、寿命アッセイは、成人への慢性EDC暴露を伴い、その生存者を測定した。しかし、これらの生命特性はまた、慎重に制御されなければならなかったいくつかの実験因子の影響を受ける可能性があります。したがって、この作業では、これらのアッセイの正しい結果に合わせて最適化した一連の手順を提案します。これらの方法は、科学者が任意のEDCまたはドロソフィラの異なるEDCの混合物のために内分泌破壊を確立することを可能にするが、効果を担当する内分泌機構を同定するためには、さらなるエッセイが必要になる可能性がある。

このセクションでは、上記のプロトコルの主要な手順を簡略化されたスキームの形式で報告します。ハエは不快な化合物を避ける傾向があることを考えると、最初に行うことは、選択されたEDCの味をアッセイすることです。これは、食品着色料(例えば、赤色食品染料第40号)35を様々な用量で、または溶媒単独で選択されたEDCを補充した食品と混合することによって行うことができる。これらの培養物に餌を与えられたハエは立体顕微鏡下で調べられ、食物摂取量は腹部着色によって推定される(図1)。典型的な望ましい状況は、2人の成人女性を持つ図1に示されています:選択されたEDCを含む培地に1匹、EDCを含まない培地上に1匹、腹部に同じ着色を示す。
EDCは、天然ホルモンのような、非常に低用量で効果があり、用量と効果29の間に単純な線形関係がないことは広く受け入れられており、高用量は必ずしも大きな効果を有...

内分泌破壊物質(EDC)は、生物および自然環境にとって深刻な問題を表します。ショウジョウバエメラノガスターは、生体内のEDC効果を研究するための理想的なモデルを表します。ここでは、ショウジョウバエにおける内分泌破壊を調査する方法を紹介し、胎児、生殖能力、発達時期、ハエの寿命に対するEDCの影響に対処する。

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

ショウジョウバエメラノガスターは、人間の健康や自然環境に深刻な問題を示す内分泌破壊物質などの化学物質の潜在的な毒性および内分泌効果をインビボで評価する強力なモデルです。EDCがハエのホルモン生命特性(例えば、胎児性、生殖能力、発達時間、寿命)に及ぼす影響に対処する。これは、インビボで内分泌破壊を調査するための簡単で安価で迅速な方法です。ショウジョウバエの生殖能力、発達、寿命は、このプロトコルの成功した結果を確実にするために慎重に制御されなければならないいくつかの要因の影響を受ける可能性があります。そのため、ハエの飼育や取り扱いには最大限の注意が必要です。選択したEDCの味をアッセイするために、麻酔後、フライベッドから15匹の若いハエを、食品着色料と混合したコーンミール培地を含む4つの平行バイアルに移す。対照バイアルは、単独で溶媒を含み、他の3つのバイアルは、選択されたEDCの異なる用量で補充されます。天然の12時間の光で1日、加湿インキュベーターにバイアルを保管してください。ハエを再び麻酔した後、固定されたハエを白紙に移し、ステレオ顕微鏡の下に置いて観察します。対照群に対して各治療群の腹部着色を比較する。ハエの生殖性能をアッセイするには、EE2を補充したコーンミール培地の10ミリリットルに8人のメスと4人の男性を含む、親のバイアルとして各EDCのためのハエの3つのバイアルを準備する。コントロールのために、EE2溶媒を補充したコーンミール中食品の10ミリリットルに8匹のメスと4人の男性をそれぞれ8匹のハエのバイアルを準備します。リアは摂氏25度のインキュベーターで飛ぶ。彼らの開発中に、幼虫を過密にしないでください。4日後、エーテルを介して各バイアルを反転して両親を取り除き、バイアルを5日間インキュベーターに戻します。9日目の午後遅く、エータライザーの上に各バイアルを反転して、バイアルから新たに出現したすべてのハエを取り除き、バイアルを一晩摂氏18度の別のインキュベーターに入れます。10日目の朝、ショウジョウバエの二酸化炭素ワークステーションで、麻酔されたハエが媒体に落ちるのを防ぐために培養バイアルを慎重に反転させ、綿のストッパーとバイアルの壁の間のバイアルに針を持つゴムチューブを挿入します。バルブを開けて二酸化炭素を供給します。ほんの数秒で、ハエを顕微鏡でフライベッドに移します。処女女性と若い男性を別々にハエベッドの2つのグループに集めます。小さなサブグループのハエの各グループをランダムに細分化し、10匹のメスまたは20匹の雄が新鮮な対応するコーンミール培地で満たされたバイアルあたり。インキュベーションを続け、各EDCに対して30人の処女女性と30人の男性、そして90人の処女女性と90人の男性を集めてコントロールします。エローション後4日になるまで、これらのハエのグループを摂氏25度で収容してください。その後、2日ごとに新鮮な対応する媒体を含む新しいバイアルにそれらを転送します。メスのバイアルに幼虫がいないか確認してください。次に、バイアルに次の処置のための連続番号の異なるシリーズをラベル付けします。麻酔後、EE2溶媒処理メス1匹をEE2なしで新鮮なコーンミールトマト培地を含む小さなバイアルに移し、EE2溶媒処理された男性を1匹加えて制御します。EE2処理の男性とEE2溶媒処理雌またはEE2処理雌とEE2溶媒処理の男性を各処理に対して組み合わせる。25°Cで家20シングルクロス。各交配ペアを、その後の10日間、毎日EDCなしで新鮮なコーンミールトマト培地バイアルに移します。卵のために毎日各バイアルを視覚的に検査し、不妊治療スプレッドシートに自分の番号を報告します。各バイアルでは、新しく出現したハエを注意深くチェックし、10日間の成人子孫の毎日の数を記録します。最初の交配から10日後、バイアルの最後のシリーズから両親を取り除きます。エローションアッセイプロトコルでは、まず、各治療群に対して、生後2日以内に生後2日以内に生後2日以内に10個の若くて健康なハエのバイアルを設置し、それぞれEDCなしのコーンミール食品の10ミリリットルに6人の女性と3人の男性を設置する。ハエを24時間食べ物に乗せ、交尾できるようにします。次に、異なるEDC濃度またはEE2溶媒単独で補った新鮮なコーンミール食品のそれぞれを10ミリリットルで処理グループごとに別の10並列バイアルを調製し、コントロールします。交配ハエをこれらの新しいバイアルに移します。異なるシリーズを記録するために、開発用スプレッドシートを作成します。ハエが16時間卵を産むことを許可します。次に、バイアルから両親を取り除きます。バイアルを摂氏25度で3~4日間、または放浪の幼虫が見えるまでインキュベートする。毎日、バイアルの外側に各子犬の順序で番号を書くことによって、各バイアルの新しい子犬の数を数え、同じ子犬を2回数えないようにします。新たに出現した子犬の数を3〜4日間、またはこれ以上の子犬の形がなくなるまで報告する。9日目から、成人が出現しなくなるまで、毎日新興成人の数を数えます。開発スプレッドシートに報告し、原稿に従って残りのエクロスションアッセイを実行します。寿命プロトコルでは、最初に8人の女性と4人の男性で20バイアルを設置し、それぞれが10ミリリットルのコーンミール食品で満たされ、摂氏25度で収容します。4日後、ハエを捨て、バイアルをインキュベーターに戻します。9日目の午後遅く、バイアルから新しく出現したすべてのハエを取り除き、バイアルをインキュベーターに戻します。16〜24時間後、両性の250匹の1日齢の成体ハエを軽い二酸化炭素麻酔下で4つのグループに分け、成人培地食品を含む250ミリリットルのボトルに移し、3つは異なるEDC濃度で補い、1つはEE2溶媒だけで補う。ハエを2〜3日間摂氏25度に保ち、交尾できるようにします。その後、性別によってハエの各コホートを2つのグループに分類します。各治療条件内では、男女ともに、各グループを1バイアルあたり20個の密度でランダムに5つの平行バイアルに細分化する。死んだハエの数を以前の転送から生き残ったハエの数から差し引く寿命スプレッドシートを準備し、各転送で生存者の数が自動的に得られるようにします。3日後、麻酔なしでハエを対応する食物を含む新しいバイアルに同時に移し、死亡を確認する。ハエの年齢と死んだハエの数を記録します。すべてのハエが死ぬまで3日ごとに転送を繰り返します。この実験では、寿命曲線を、各EDC濃度および対照の累積生存期間と経過日数に対してプロットした。この対照については、生存曲線が比較的高いままであった長い初期期間の後、約60日後に指数関数的に低下した。EDC曝露後、治療されたハエの生存曲線は有意に影響を受け、36日後に劇的な減少を示した。分析の下で平行バイアルは非常に似ているべきである、そうでなければ、どちらを破棄するかを理解することは困難であることをお勧めします。したがって、我々は、大きなサンプルサイズを使用して、良い実験の練習を採用し、細心の注意を払ってお勧めします。このプロトコルに従って、選択された内分泌破壊物質の世代間の影響を評価するだけでなく、異なる内分泌破壊物質の組み合わせの潜在的な添加効果を試験することもできる。

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JoVE Journal

Developmental Biology

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