Name: 細菌人工染色体cDNAクローンからの組換えジカウイルスの救出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 学ぼう、細菌人工染色体を用いたジカウイルスcDNAクローンからの感染性組換えウイルス救出法。Vero細胞へのトランスフェクションとウイルス力価測定を含む。ワクチン開発やウイルス病原性研究に応用可能です。

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著者らは、BAC cDNAクローン生成における彼女の技術的支援とスネザナ・ディミトロヴァがビデオの準備を手伝ってくれたことに感謝したいと思います。この研究は、スペイン経済競争力省(MINECO、助成番号BFU2016-79127-R)からF.A.T.と国立衛生研究所(NIH、助成番号1R21AI120500)からL.M.S.およびF.A.Tへの助成金によって一部支援されました。

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著者は何も開示していない。

感染性cDNAクローンは、RNAウイルスの基礎研究やワクチンの開発および/または抗ウイルス戦略の同定に不可欠な分子ツールを構成します。しかし、フラビウイルスを含む多くの陽性鎖RNAウイルスの場合、標準的な高コピー数プラスミドを用いて細菌に伝播した場合、クローン化されたcDNAの不安定性のために感染性cDNAクローンの生成は困難である。ZIKVおよび他のフラビウイルスの場合、この不安定性は主にウイルスゲノム14、15、16、17に存在する不可解な細菌プロモーターからの毒性ウイルスタンパク質の漏出発現によるものである。.ここでは、毒性問題を克服するためにBACプラスミドpBeloBAC1134(図2A)を使用することに基づいて、単一のプラスミドとして安定なZIKV全長感染性cDNAクローンを生成するための代替かつ強力なプロトコルを説明する。CMVプロモーターは、トランスフェクト細胞の核におけるvRNAの発現を可能にし、HDV RZは正確な3'-終端を持つvRNAを生成する(図2B)。この方法を用いて、感受性ベロ細胞の直接トランスフェクション後の感染性rZIKVの効率的かつ信頼性の高い回復を可能にするZIKV株RGNの完全に安定した感染クローンの生成に成功しました(図3および図4)。
ここ数年、ZIKV感染性cDNAクローンに関連する不安定な問題を克服するために多大な努力がなされ、cDNA断片のインビトロライゲーションを含むいくつかのアプローチが18に成功しました24 ,25, 低コピープラスミド19,20, サイレント変異の導入による不可解な細菌プロモーターの不活性化 26,27, イントロン挿入21,22歳,23、 ギブソン組み立て方法30、 ISA 法28,29、 および CPER31の使用 .これらのアプローチは毒性の問題を克服し、ZIKV感染性cDNAクローンを生成するのに有用であるが、それらのいくつかは手間がかかり、ウイルスを減らすインビトロライゲーションおよび転写ステップの必要性を含むいくつかの欠点を提示する回復効率またはウイルスの適合性に影響を与える可能性のある不可解な細菌プロモーターを不活性化する多数の無声突然変異の導入。このプロトコルで説明するアプローチには、次のような利点があります。 i) BACプラスミドpBeloBAC1134は、厳密に制御された複製を有し、細胞当たりプラスミドのコピーを1つまたは2つ保持し、毒性を最小限に抑え、不安定なcDNの細菌の安定した維持を可能にする。ii)BACプラスミドの伝播および修飾は、大型のBAC-DNA断片および低コピープラスミドを操作するために、このプロトコルに記載されているわずかな修飾を考慮して、従来のプラスミドのそれらにほぼ類似している。ろよ、 キャッピングされたZIKV vRNAの細胞内発現およびインビトロ転写ステップを必要とせずに感染性ウイルスの回復。iv) 感染性rZIKVは、BAC cDNAクローンを用いて感受性細胞(例えば、ベロ)の直接トランスフェクション後に生成される。哺乳動物細胞におけるDNAトランスフェクションはRNAトランスフェクションよりも効率的であるため、BACアプローチによるウイルス回収効率はRNA転写物を用いて観察されたものよりも高く、培養細胞における通過数を減少させ、ウイルスストックを生成し、その結果、細胞培養適応による望ましくない突然変異の導入を制限する。
最後に、BACアプローチの可能性は、デングウイルス36を含む他のフラビウイルスの感染性cDNAクローンを設計するために、この方法(わずかな変更で)の成功によってサポートされ、および高い影響を及ぼすいくつかのコロナウイルスヒトおよび動物の健康、例えば透過性胃腸炎コロナウイルス37(TGEV)、ネコ感染性性性性性性性性性性性性性ウイルス38(FIPV)、ヒトコロナウイルスOC4339(HCoV-OC43)、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス40(SARS-CoV)、および中東呼吸器症候群コロナウイルス41(MERS-CoV)、とりわけ。
ここで説明するプロトコルでは、考慮すべき重要な手順が 2 つあります。1つの重要な考慮事項は、BACプラスミドに存在しないウイルスゲノム中の適切な一意の制限部位を同定することです。十分な制限部位が利用できない場合、サイレントヌクレオチド変異の導入により、クローニング設計中に新しい制限部位を生成することができます。もう一つの重要な問題は、BACプラスミドが細胞あたり1つまたは2つのコピーにのみ存在し、したがって、細菌ゲノムDNAの高い汚染を有するBACプラスミドの低収率は、高および高のために設計された標準的なプロトコルを使用して得られるということです。中型コピー番号プラスミド。この潜在的な問題は、大量の培養量を使用して容易に克服し、BAC精製のために特別に開発された市販キットでBACプラスミドを精製します。
要約すると、我々は、これらの生物学の研究を容易にするために、他の陽性鎖RNAウイルスの安定した完全に機能的な感染性cDNAクローンを生成するために適応することができるBACの使用に基づいて強力なZIKV逆遺伝的アプローチを開発しました。ウイルスおよびワクチンの開発および/または抗ウイルス薬の同定を容易にする。

ZIKVは、現在世界的な公衆衛生上の緊急事態1を構成するフラビリダ科内のフラビウイルス属の蚊媒介メンバーである。他のフラビウイルスと同様に、ZIKVは、約10.8kb(図1)2の正の感覚、一本鎖RNA分子を含むイコサヘドラ状構造を有する封入されたRNAウイルスである。ウイルスゲノムは、ウイルスおよび細胞プロテアーゼによって処理される約3,423アミノ酸の大きな多タンパク質を、3つの構造タンパク質(カプシド[C]、膜/膜前膜[prM/M]、およびエンベロープ[E])の形成に関与する3つの構造タンパク質にコードする。ゲノム複製、ウイルス組み立て、宿主免疫応答の回避に関与する7つの非構造(NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)のウイルス粒子および7個の非構造(NS)タンパク質(図1)3。
歴史的に、ZIKV感染は軽度の熱性疾患4、5と関連している。しかし、南米、中米、南太平洋、カリブ海諸国におけるZIKV感染の爆発的な最近のパンデミック、およびギラン・バレ症候群の発生との関連小頭症9、10、11、12、13は、歴史的認識を変更し、重要なヒト病原体としてのZIKVの関連性を増強した。この意味で、感染性cDNAクローンなどの分子ツールの開発は、ウイルス病因の研究と遺伝的に定義されたワクチンの開発、およびZIKV感染の治療のための抗ウイルス薬の同定を容易にする。他のフラビウイルスについて説明したように、ZIKV感染性クローンの生成は、ウイルスゲノム14における不可解な細菌プロモーターの存在により困難であり、その伝播中に有毒なウイルスタンパク質の漏出発現を可能にする。標準的な高コピー数プラスミド15、16、17を使用する細菌中のcDNAクローン。この毒性の問題を克服するために、いくつかの非伝統的なアプローチは、過去2年間で正常に実装されています18.これらには、低コピー数プラスミド19、20、有毒領域21、22、23を破壊するイントロンの挿入、cDNA断片のインビトロライゲーションの使用が含まれる。24歳,25, ウイルスゲノムに存在する不可解な細菌プロモーターの突然変異サイレンシング26,27, 感染性亜ゲノムアンプリコン (ISA)28,29, ギブソン組み立て方法30、および円形ポリメラーゼ拡張反応(CPER)31の使用。
本明細書では、ZIKV株ZIKV-RGN13の全長cDNAクローンのエンジニアリングのための詳細なプロトコルについて説明し、毒性問題を克服するためにBACを使用し、およびVEroへのBAC cDNAクローンの直接トランスフェクションによる感染性rZIKVの救出について説明する。細胞32は、ヒトワクチン33の開発のために食品医薬品局(FDA)によって承認された細胞株である。このシステムでは、ウイルスゲノムの全長cDNAコピーをBACプラスミドpBeloBAC1134(図2A)に組み立て、エシェリヒア大腸菌F因子35に由来する低コピー数プラスミド(細胞当たり1~2部)、これは、細菌の伝播中にフラビウイルス配列の毒性を最小限に抑えます。ZIKVゲノムのcDNAは、ヒトCMV即時早期プロモーターの制御下でpBeloBAC11に組み立てられ、細胞RNAポリメラーゼIIによるトランスフェクト細胞の核におけるウイルス(v)RNAの発現を可能にし、肝炎によって3'末端に横たわるデルタウイルス(HDV)リボザイム(RZ)、続いてウシ成長ホルモン(BGH)終端およびポリアデニル化シグナルの配列が続き、ウイルスゲノムの本物の5'-および3'末端を有する合成RNAを産生する(図2B)。このcDNA起動システムは、キャップされたウイルスRNAの細胞内発現を生み出し、インビトロ転写ステップを必要とせずに感染性ZIKVの回復を可能にする。BACアプローチは、他のフラビウイルスおよび他の陽性鎖鎖RNAウイルス36、37、および他の陽性鎖ウイルスの安定した、完全に機能的なcDNAクローンの構築に適用可能な強力な方法論を提供する。38、39、40、41.

<table><tbody><tr><td><ストロング>1.分子生物学試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Afe I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0652S</td><td>10,000 Units/mL</td></tr><tr><td>AmpliTaq DNA ポリメラーゼ</td><td>ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems)</td><td>N8080161</td><td>5,000 Units/mL</td></tr><tr><td>ApaL I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0507S</td><td>10,000 units/mL</td></tr><tr><td>Asc I</td> New <td>England BioLabs</td><td>R0558S</td><td>10,000 Units/mL</td></tr><tr><td>BamH I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0136S</td><td>10,000 Units/mL</td></tr><tr><td>BstB I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0519S</td><td>20,000 Units/mL</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>ElectroMAX DH10B Cells&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td><td>18290015</td><td>Electocompetent DH10B cells</td></tr><tr><td>エレクトロポレーションキュベット、0.2 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2086</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>メルク</td><td>100983</td><td>可燃性</td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>メルク</td><td>109634</td><td>可燃性</td></tr><tr><td>ラージコンストラクトキット (10)</td><td>QIAGEN</td><td>12462</td><td>高純度 BAC 調製</td></tr><tr><td>用 LBBroth</td><td>ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td><td>12780029</td><td></td></tr><tr>Earn <td>ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td><td>でLB</td>も<td></td>自家製にできます<td>22700041</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Merck</td><td>106009</td><td>Flamable</td></tr><tr><td>Mlu I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0198S</td><td>10,000 Units/mL</td></tr><tr><td>Oligonucleotides</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>プラスミド pBeloBAC11</td><td>New England BioLabs</td><td>ER2420S (E4154S)</td><td></td></tr><tr><td>プラスミド ミディキット (25)</td><td>QIAGEN</td><td>12143</td><td>BAC プラスミドの中規模調製用</td></tr><tr><td>Pml I</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0532S</td><td>20,000 ユニット/mL</td></tr><tr><td>ポリプロピレンチューブ (10 mL)</td><td>DeltaLab</td><td>175724</td><td>他の商用ソースも許容されます</td></tr><tr><td>QIAEX II ゲル抽出キット (150)</td><td>QIAGEN</td><td>20021</td><td>10 kb 以上の DNA フラグメントに最適化されたゲルクリーンアップキット</td></tr><tr><td>Shrimp AlKaline Phosphatase (rSAP)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0371S</td><td>1,000 Units/mL</td></tr><tr><td>SOC Medium</td><td>ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td><td>15544034</td><td>自家製でも可能</td></tr><tr><td>cDNA フラグメントの合成</td><td>Bio Basic</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Sigma-Aldrich (Roche)</td><td>10481220001</td><td>1,000単位/mL</td></tr><tr><td><強>2.細胞培養試薬</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>ThermoFisher Scientific(Nunc)</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>12ウェルプレート</td><td>ThermoFisher Scientific(Nunc)150628</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>24ウェルプレート</td><td>ThermoFisher Scientific(Nunc)</td><td>142485</td><td></td></tr><tr><td>Agar Noble</td><td>VWR</td><td>214230</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Conjugate ant-mouse二次抗体</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化抗マウス 二次抗体</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養皿 (100 mm x 21 mm)</td><td>ThermoFisher Scientific (Nunc)</td><td>172931</td><td></td></tr><tr><td>コニカルチューブ (15 mL)</td><td>VWR</td><td>525-0150</td><td></td></tr><tr><td>コニカルチューブ (50 mL)</td><td>VWR</td><td>525-0155</td><td></td></tr><tr><td>クリスタルバイオレット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6158</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>毒性および発がん性</td></tr><tr><td>DEAE-デキストラン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9885</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher Scientific (Gibco)</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>ThermoFisher Scientific (HyClone))</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>毒性および発がん性</td></tr><tr><td>のある L-グルタミン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック (Gibco)</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック (Invitrogen)</td><td>11668019</td><td>トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック (Gibco)</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 還元血清中</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック (Gibco)</td><td>31985070</td><td>トランスフェクション培地</td></tr><tr><td>パンフラビウイルス E タンパク質 モノクローナル抗体 4G2</td><td>BEI リソース</td><td>NR-50327</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡 Sciences</td><td>15710-S</td><td>毒性および発がん性</td></tr><tr><td>PBS</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック (Gibco)</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック (Gibco)</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 退色防止試薬</td><td>ThermoFisher Scientific (Invitrogen)</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain ABC Kit</td><td>Vector Laboratories Inc</td><td>PK-4010</td><td>Avidin/biotin-based peroxidase kit</td></tr><tr><td>Vero Cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td></td></tr><tr><td>ZIKV E Protein mAb 1176-56</td><td>BioFront Technologies</td><td>BF-1176-56</td><td></td></tr><tr><td><強い>3.機器</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アガロースゲル電気泳動システム</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1704468</td><td>その他の商用ソースは許容されます</td></tr><tr><td>クラスII バイオセーフティ CO2 キャビネット</td><td>は異なります</td><td>N/A</td><td>他の商用ソースは許容されます</td></tr><tr><td>デスクトップ Refrigrated Centrifuge</td><td>Varies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>N</td><td>/A</td><td></td></tr><tr><td>変動 高速冷凍遠心分離機</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroPulser Electroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>1652100</td><td>他のマシンは許容されます</td></tr><tr><td>SimpliAmp サーマルサイクラー</td><td>ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems)</td><td>A24811</td><td>その他のマシンは許容されます</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>は</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table> 変動します

細菌人工染色体cdnaクローンからの組換えジカウイルスの救出

Rescue of Recombinant Zika Virus from a Bacterial Artificial Chromosome cDNA Clone

ジカウイルス(ZIKV)感染と神経性合併症との関連、および承認されたワクチンおよび/または抗ウイルス薬の欠如は、ZIKV生物学の研究と治療および/または予防的アプローチの開発。しかし、他のフラビウイルスと同様に、ZIKV全長感染性cDNAクローンの生成は、細菌の増幅中にウイルス配列の毒性のために妨げられてきた。この問題を克服するために、細菌人工染色体(BAC)の使用に基づく非伝統的なアプローチを開発しました。このアプローチを使用して、ZIKV株リオグランデドノルテナタール(ZIKV-RGN)の全長cDNAコピーは、4つの合成DNA断片から生成され、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)の制御下で単一コピーpBeloBAC11プラスミドに組み立てられます。即時早期プロモーター。組み立てられたBAC cDNAクローンは細菌の伝播中に安定であり、感染性組換え(r)ZIKVはBAC cDNAクローンのトランスフェクション後にベロ細胞で回収される。ここで説明するプロトコルは、ZIKVおよび他の陽性鎖RNAウイルス、特に細菌の間に安定性の問題を有する大きなゲノムを持つものを含むフラビウイルスの感染性クローンの生成のための強力な技術を提供する伝播.

ここで説明するプロトコルは、いくつかのフラビウイルス配列に関連する毒性の問題を最小限に抑えるためにBACを使用して安定なZIKV全長cDNA感染クローンの生成を可能にする。BAC cDNAクローンからの感染性rZIKVの効率的な回収は、感受性ベロ細胞のトランスフェクション後に容易に達成することができる(図2)。このプロトコルを使用して、我々は、従来のクローニング方法とユニークな方法を使用して、BACプラスミドpBeloBAC1134に4つの重なり合うcDNA断片を順次クローニングすることにより、ZIKV株RGN 32の安定した全長cDNAクローンを生成しました。ウイルスゲノムに存在する制限部位(図2)。全長cDNAクローンは、トランスフェクト細胞の核内でvRNAの発現を可能にするためにヒトCMVプロモーターによって5'末端に横たわり、HDV RZによって3'末端に続いてBGHポリアデニル化および終端配列を、含むRNAを産生する。ウイルスゲノムの正確な3'-終わり(図2)。生成されたBAC cDNAクローンの細菌の安定性と、標準的な組換えDNA技術を用いて容易な操作が行われ、安定した全長cDNAクローンの迅速かつ信頼性の高い生成のためのBAC cDNAアプローチの可能性が強調されています。ZIKVおよび他のフラビウイルスまたは不安定なウイルスゲノムを有する陽性鎖RNAウイルス。
BAC cDNAクローンを組み立てた後(図2)、カチオン性リポソームを用いたBAC cDNAクローンを用いた感受性ベロ細胞の直接トランスフェクション後に感染性ウイルスを容易に回収できる(図3)。このcDNA起動システムは、キャップされたvRNAの細胞内発現を可能にし、インビトロ転写ステップを必要とせずに感染性ウイルスの回復を可能にした。このアプローチを用いて、トランスフェクション後5日間で106 PFU/mLより高い力価でrZIKV-RGNを救出することができました(図4A)。また、救助されたウイルスは、明確なCPE(図4B)を誘導し、約2mmの均質なプラーク(図4C)を生成し、その同一性をmAb特異的を用いてシーケンシング(図示せず)と免疫蛍光分析によって確認した。ZIKV Eタンパク質の場合、1176-56 (図 4D)インビトロデータは、回収されたrZIKV-RGNがベロ細胞および天然ZIKV単離32と比較してレベルに効率的に複製されたことを示す(データは示さない)。全体的に、これらの結果は、感染性rZIKVがBACで組み立てられた全長のcDNAクローンから救出できることを示している。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig1.jpg"> 図 1: ZIKVゲノム組織とビリオン構造(A) ゲノム組織:ZIKVは、単一のポリタンパク質として翻訳される正の一本鎖RNAを含む。翻訳されたポリタンパク質をウイルス(矢印)および宿主(ダイヤモンド)プロテアーゼで切除し、構造タンパク質キャプシド(C、青)、マトリックス(M、茶色)、およびエンベロップ(E、緑色)、および7つの非構造タンパク質(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)を産生した。ウイルスゲノムの末端にある5'および3'未翻訳領域(UtR)は、黒い線で示されます。(B)ビリオン構造:ZIKVビリオンは、EおよびMタンパク質で飾られ、イコサヘドラ状構造を持つ脂質二重層に固定された。ウイルスエンベロープの下には、ウイルスゲノムRNAに関連するCタンパク質からなるウイルスヌクレオカプシドであった。この図は、アビラ・ペレスら18から適応されています.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig1large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig2.jpg"> 図 2: BACにおけるZIKV全長感染性cDNAクローンの組み立て。(A) pBeloBAC11 BACの概略表現:調節遺伝子parA、parB、parC、およびrepE、F因子複製起源(OriS)、クロラムフェニコール耐性遺伝子(Cm r)、およびlac Z遺伝子が示される。感染性ZIKV cDNAクローンの組み立てに使用される関連する制限部位には、下線が引かれています。(B) ZIKV全長感染性cDNAクローンをpBeloBAC11 BAC:4つの重なり合うDNA断片(Z1-Z4)を組み合わせ、ZIKVゲノム全体をカバーし(図1)、示された制限部位によって横たわって、化学的に生成したpBeloBAC11に合成し、順次クローン化して感染性ZIKV cDNAクローンpBAC-ZIKVを生成した。全長ZIKV感染性cDNAは、ヒトサイトメガロウイルス即時早期プロモーター(CMV)の制御下で組み立てられ、HDVリボザイム(RZ)およびウシ成長ホルモン(BGH)終端およびポリアデニル化配列によって3'末端に横たわっていた。ウイルス遺伝子および調節要素の頭字語は、図1に記載されているようにである。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig2large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig3.jpg"> 図 3: BAC cDNAクローンからrZIKVを生成するワークフロー。合流の90%におけるベロ細胞を、カチオン性リポソームを用いてZIKV全長感染性cDNAクローンpBAC-ZIKV(図2)を用いて単層にトランスフェクトした。4-6日後に、CPEが明らかになったとき、rZIKVを含む組織培養上清を採取し、ウイルスの存在について評価した(図4)。.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig3large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59537/59537fig4.jpg"> 図 4: rZIKVのリカバリとインビトロ特性。(A) BAC cDNAクローンからの感染性rZIKVの救助:合流の90%のベロ細胞(6ウェルプレートフォーマット、トリプリケート)を模擬トランスフェクトまたはpBAC-ZIKV(図3)の4μg/ウェルでトランスフェクションし、および移植後の指定日に、組織培養上清におけるウイルス力料は、プラークアッセイ(PFU/mL)によって決定した。誤差バーは、3つの異なるトランスフェクション実験からの標準偏差を示します。点線の黒い線は検出の限界を示します(50 PFU/mL)。(B) ウイルスCPE:90%合流(6ウェルプレートフォーマット、三価)のベロ細胞は、rZIKVで模擬感染(上)または感染(0.5 PFU/細胞のMOI)を有し、48h後感染時に、CPEの存在を光顕微鏡検査により評価した。スケールバー = 100 μm. (C)ウイルスプラークアッセイおよび免疫染色: 90%合流(12ウェルプレートフォーマット)のベロ細胞はrZIKVに感染し、72時間の感染後、ウイルスプラークは結晶紫色染色(左)または免疫染色によって可視化された(右)パンフラビウイルスEタンパク質mAb 4G2を用いて。スケールバー = 5mm. ( D) 免疫蛍光:90%合流(24ウェルプレートフォーマット、トリプリケート)のベロ細胞をrZIKVで感染させ(0.5 PFU/細胞のMOI)、48h後感染時に、mAb 1176-56を用いて免疫蛍光で分析し、ZIKVに特異的Eタンパク質。細胞核をDAPIで染色した。ZIKV感染ベロ細胞の代表的なマージ画像を示す。右上の白い正方形は、ZIKV感染ベロ細胞の拡大画像を表しています。スケールバー = 100 μm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59537/59537fig4large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

ジカウイルスの最近の流行は、ワクチンや治療戦略を開発するための逆遺伝的アプローチを確立することの重要性を強調しています。ここでは、ヒトサイトメガロウイルスの制御下で細菌人工染色体に組み立てられた全長cDNAクローンから感染性組換キンジカウイルスを早期に促進するプロトコルについて説明する。

細菌人工染色体cDNAクローンからの組換えジカウイルスの救出

The association of Zika virus (ZIKV) infection with neurological complications during the recent worldwide outbreak and the lack of approved vaccines ...

この実験手順の全体的な目標は、ヒトサイトメガロウイルス即時早期プロモーターの制御下で細菌人工染色体に組み立てられた全長cDNAクローンからの感染性組換えジカウイルスの生成である。ジカウイルスなどのRNAウイルスの逆遺伝子システムの開発により、ウイルスゲノムの直接操作は、ウイルス生物学と病因の複数の側面を研究し、ワクチン戦略を開発することができます。この技術の主な利点は、細菌人工染色体としてのジカウイルス感染性クローンの構築がフラビウイルスゲノムに関連する毒性を克服し、BAC cDNAクローンを感受性細胞に直接トランスフェクションすることによって感染性ウイルスを救い出すことができる点である。この方法論は、他のフラビウイルスおよび他の陽性鎖RNAウイルスに対する安定した完全に機能する感染性cDNAクローンの構築に適用することができる。この手順を開始するには、適切な制限サイトを使用して、テキストプロトコルで概説されているようにジカウイルスcDNAクローンを構築します。5素端のヒトCMVプロモーターと3素端のウシ成長ホルモン終了およびポリアデニル化配列によって横たわるジカウイルスゲノムにまたがる4つのDNA断片は、細菌性人工染色体プラスミドに組み立てられる。まず、pBAC-ジカウイルス感染クローンを5ミリリットルのLB培地に含むpBAC-ジカウイルス感染クローンを、穏やかな揺れで摂氏37度で8時間運ぶ大腸菌DH10Bの単一コロニーを成長させる。次いで、クロラムフェニコールを含むLB培地を500ミリリットルの2リットルフラスコに加える。調製した細菌培養物を1ミリリットルをフラスコに加え、OD600が約0.6~0.8になるまで14〜16時間摂氏37度で細胞を増殖させます。この後、BAC精製用に開発された市販キットを使用して、製造者の指示に従ってアルカリ性のリシスによりBAC感染cDNAクローンを精製する。トランスフェクションの1日前に、ベロ細胞を成長培地中のウェルあたり500,000個の密度で6ウェルプレートのウェルにプレートします。トランスフェクションミックスを調製するには、BAC cDNAクローンの4マイクログラムを250マイクロリットルの血清還元培地に加え、慎重に混合します。別のチューブでは、250マイクロリットルの血清還元培地で12マイクロリットルのトランスフェクション剤を希釈する。室温で5分間混合し、インキュベートするボルテックス。次に、希釈したBAC cDNAをトランスフェクション剤と組み合わせます。慎重に混ぜ、室温で20〜30分間インキュベートします。このインキュベーション期間中、抗生物質を使わずに増殖培地を使用してVero細胞を洗浄し、抗生物質を使わずに1ミリリットルの新鮮培地に細胞を残します。次いで、500マイクロリットルのcDNAおよびトランスフェクション試薬混合物をセロ細胞上に滴下して分配する。プレートを前後に揺らし、加湿したインキュベーターで5%の二酸化炭素を6時間混合し、加湿インキュベーターにインキュベートします。この後、トランスフェクション培地を取り除き、抗生物質で新鮮な成長培地を2ミリリットル加えます。5%の二酸化炭素で摂氏37度の加湿インキュベーターで細胞をインキュベートし、細胞パシー効果の誘導を毎日チェックしてください。トランスフェクションの4〜6日後、CPEが約50〜75%である場合、細胞の破片を除去するために15ミリリットルの円錐管および遠心分離機で組織培養上清を10分間収集する。次いで、組換えジカウイルスを含む上清を収穫し、細胞ペレットを廃棄する。クライオチューブで上清をアリコートし、マイナス80度で保存します。まず、ベロ細胞を90%合流まで増殖させます。細胞をPBSで2回洗浄し、2%FBSを含む増殖培地において0.1の感染の多重度で救出されたウイルスに感染させる。90分間の吸着期間は、5%の二酸化炭素と15分ごとに揺れる37°Cの加湿インキュベーターに細胞のプレートを置きます。ウイルス吸着後、ウイルス接種を除去し、2%FBSで新たな成長培地を添加する。前に使用したのと同じ条件で3〜4日間インキュベートする。CPEが約75%の場合、組織培養上清と遠心分離機を収集して細胞の破片を除去する。次いで、組換えジカウイルスを含む上清を収穫し、ペレットを廃棄する。上清をクライオチューブにアリコートする。チューブを凍った箱に入れ、マイナス80度で保管します。準備ができたら、フリーザーからウイルスアリコートを取り除き、テキストプロトコルに概説されているようにプラークアッセイによってウイルスのチターを決定する。本研究では、ジカウイルス株リオグランデ・ド・ノルテ・ナタールの安定した全長cDNAクローンは、従来のクローニング法とウイルスゲノムに存在するユニークな制限部位を用いて、4つの重なり合うcDNA断片を細菌人工染色体pBeloBAC111に順次クローニングすることによって生成される。この全長cDNAクローンは、ヒトサイトメガロウイルスプロモーターによって5プライムエンドに横たわり、トランスフェクトされた細胞の核内および3プライム末端で、肝炎デルタウイルスリボソームによる3プライムエンドで、続いてウシ成長ホルモン終了およびポリアデニル化配列を続けて、ウイルスゲノムの正確な3プライムエンドを含むRNAを産生した。BAC cDNAが組み立てられると、カチオンリポソームを用いたBAC cDNAクローンを用いた感受性ベロ細胞の直接トランスフェクション後に、感染性ウイルスを容易に回収することができる。このアプローチを使用して、RジカウイルスRGNは1ミリリットル当たり100万個以上のプラーク形成単位を持つタイターで救助することができる。さらに、救出されたウイルスは明確な細胞病的効果を誘発し、約2ミリメートルの大きさの均質なプラークを生成する。救出されたウイルスの同一性は、ジカウイルスEタンパク質に特異的なモノクローナル抗体を用いた免疫蛍光分析によって確認される。全体として、これらの結果は、感染性組換えジカウイルスがBACに組み立てられた全長cDNAクローンから救出できることを示している。要約すると、我々は、病理学の研究を容易にし、ワクチンを開発し、抗ウイルス活性を有する薬物の同定を容易にするために、他の陽性鎖RNAウイルスのcDNAクローンで安定した機能的感染を生成するために適応することができる細菌人工染色体の使用に基づいて強力なジカウイルス逆遺伝的アプローチを開発した。

rescue-recombinant-zika-virus-from-bacterial-artificial-chromosome

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

プラスミドDNAからのインフルエンザウイルスの救助は、インフルエンザの研究者がインフルエンザウイルスの生物学のさまざまな側面を研究するために組換えウイルスを生成するために、そして潜在的なベクトルまたはワクチンとして使用することを可能にする基本的かつ本質的な実験的な手法です。...

プラスミドDNAの組換えインフルエンザウイルスの生成

クローニングされたcDNAからの組換えアレナウイルスのレスキュー、逆遺伝学と呼ばれるアプローチは、研究者はアレナウイルスの生物学のさまざまな側面に、特定のウイルス遺伝子産物の役割、ならびにそれらの異なる特定ドメイン及び残基の寄与を調べることができ。同様に、人間の病原アレナウイルスに対抗するための効果的かつ安全なワクチンの生成のための新規な可能性を提供するワクチン開発のためのFDA承認された細胞株（ベロ）における遺伝学技術を逆転。...

FDAの承認を受けたVero細胞におけるワクチン開発のための組換えアレナウイルスの生成

ニューカッスル病ウイルス（NDV）は広く、とりわけ、ワクチン接種および治療のための新たなベクターを開発するために、ここ数年で研究されてきた。これらの研究は、そのような私たちがここで説明しているようなcDNAから組換えウイルスを救出するための技術、することが可能となっている。...

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ここでは、日本脳炎ウイルスの正鎖ゲノムRNAの完全長cDNAを含む感染性細菌人工染色体を作成するためのプロトコルが提示されます。このプロトコルは、他のポジティブストランドRNAウイルスの機能的cDNAを構築するために使用できるため、ウイルス生物学を研究するための強力なゲノムツールとなります。...

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このプロトコールは、2プラスミドの感染性cDNAクローンからの感染性Zikaウイルスの回収を記載している。...

新世界Zikaウイルス感染クローンからの組換えウイルスの救出とキャラクタリゼーション

良品組換えネッタイシマカdensovirus (AaeDV)生体内での配信システムを開発する、人工イントロン小 RNA 発現戦略を使用して報告します。建設、パッケージング、および幼虫の感染に関しては同様に rAaeDV...

蚊幼虫における遺伝子の機能解析の遺伝子配達ベクトルとして組換え蚊 Densovirus を使用

このプロトコルでは高密度ペプチド マイクロ アレイを用いたジカ...

ジカ特定診断エピトープの探索

ジカ ウイルス (ZIKV) のための Ifnar1-/-マウスのモデルの immunoprivileged 器官の抗原特異的 T 細胞応答を評価するためのプロトコルを説明します。このメソッドは、有効性評価の貴重なも ZIKV...

ジカ ウイルス特異 Immunoprivileged 臓器感染 Ifnar1-/-マウスの T 細胞応答の評価

提示されたプロトコルは、封じ込めの設定で、ジカのような特定のウイルスに対する Aedes aegypti...

ジカウイルスを用いた Aedes aegypti蚊の ベクターコンピテンス分析

本研究では、ハイスループットスクリーニング形式でジカウイルス複製の阻害剤をスクリーニングするための、レビコンベースおよびウイルス酵素ベースのアッセイで使用されるプロトコルについて説明する。...

ジカウイルス複製阻害剤をスクリーニングする高スループット抗ウイルスアッセイ

学ぼう、細菌人工染色体を用いたジカウイルスcDNAクローンからの感染性組換えウイルス救出法。Vero細胞へのトランスフェクションとウイルス力価測定を含む。ワクチン開発やウイルス病原性研究に応用可能です。

細菌人工染色体cDNAクローンからの組換えジカウイルスの救出

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