Name: 細菌病原体脂肪酸を膜リン脂質に取り込む研究のための鶏卵黄からのリポタンパク質粒子の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 59 s
Description: 学ぶ、鶏卵黄からリポタンパク質粒子を単離し、Staphylococcus aureusなどの細菌膜への脂肪酸取り込みを質量分析で解析する方法です。宿主由来脂質と細菌病原体の相互作用を解明します。

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私たちは、この作品の原稿とサポートの彼らの批判的な評価のためにハンマー研究室のメンバーに感謝します。コロラド大学医学部のアレックス・ホースウィル博士はAH1263を親切に提供しました。ミシガン州立大学のクリス・ウォーターズ博士の研究室は試薬を提供しました。この研究は、アメリカ心臓協会の助成金16SDG30170026とミシガン州立大学が提供するスタートアップ資金によって支援されました。

著者は開示を持っていません。

S.アウレウスは、その膜リン脂質27、32、43に外因性脂肪酸を組み込む。外因性脂肪酸を用いるリン脂質合成は、FASII阻害をバイパスするが、膜27、32、44の生体物理学的特性も変化する。グラム陽性病原体のリン脂質への外因性脂肪酸の取り込みは十分に文書化されているが、宿主脂肪酸貯留の同一性と3つの主要なブドウ球菌リン脂質タイプの構造変化にギャップが残っている。外因性脂肪酸の取り込みから生じる。ここでは、i)鶏卵黄からLDL粒子を濃縮し、脂肪酸の供給源であるii)外因性脂肪酸がS.アウレウスの成長に及ぼす影響を決定し、iii)に対して公平な脂肪分析を利用するプロトコルについて説明する。S.aureusの膜リン脂質へ...

メチシリン耐性S.アウレウス(MRSA)は、ヘルスケア関連感染の主な原因であり、関連する抗生物質耐性はかなりの臨床的課題である1、2、3である。したがって、新規治療戦略の開発は最優先事項である。グラム陽性病原体の有望な治療戦略は、脂肪酸合成を阻害しており、S.アウレウスにおいて、ホスファチジルグリセロール(PG)、リシル-PG、およびカージリピン4を含むリン脂質産生の要件である。細菌では、脂肪酸合成II経路(FASII)5を介して脂肪酸産生が起こり、真核生物とはかなり異なり、FASIIは抗生物質開発の魅力的な標的となる5,6.FASII阻害剤は、主にFabIを標的とし、脂肪酸炭素鎖伸びに必要な酵素7.FabI阻害剤トリクロサンは、広く消費財や医療用品8、9で使用されています。追加のFabI阻害剤は、S.アウレウス感染症10、11、12、13、14の治療のためにいくつかの製薬会社によって開発されています ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26.しかしながら、S.aureusを含む多くのグラム陽性病原体は、リン脂質合成のための外因性脂肪酸を清掃し、FASII阻害27、28、29をバイパスすることができる。したがって、FASII阻害剤の臨床的可能性は、宿主脂肪酸の供給源と病原体が宿主27、28から脂肪酸を抽出するメカニズムに関する我々の知識のかなりのギャップのために議論される。これらのギャップに対処するために、リポタンパク質粒子からS.aureusの膜リン脂質への外因性脂肪酸の取り込みを監視する偏りのないリピドミック分析法を開発した。
敗血症の間、宿主リポタンパク質粒子は血管内の宿主由来脂肪酸の潜在的な供給源を表し、宿主脂肪酸の大部分は粒子30に関連している。リポタンパク質は、リン脂質およびタンパク質からなる親水性シェルからなるもので、トリグリセリドおよびコレステロールエステル31の疎水性コアを囲む。シロミクロン、非常に密度の高いリポタンパク質、高密度リポタンパク質、低密度リポタンパク質(LDL)の4つの主要なクラスは、ホストによって生成され、脂質輸送手段として機能し、脂肪酸とコレステロールを送達します。血管系を介して細胞をホストします。LLLは、トリグリセリドおよびコレステロールエステル31を含むエステル化脂肪酸に豊富である。我々は、高度に精製されたヒトLLLがPG合成のための外因性脂肪酸の生存可能な供給源であることを以前に実証し、したがってFASII阻害剤バイパス32のメカニズムを提供する。精製ヒトLLLの浄化は技術的に困難で時間がかかる一方で、精製されたヒトLLLの商業的供給源は日常的に使用したり、大規模な細菌スクリーンを実行するために非常に高価です。これらの制限に対処するために、我々は、リポタンパク質粒子33の豊富な供給源である鶏卵黄からのLLLの濃縮のための手順を修正した。我々は、S.aureus32の膜へのヒトLDL由来脂肪酸の取り込みを監視するために、標的とされていない、高解像度/正確な質量分析とタンデム質量分析を使用することに成功しました。以前に報告された方法とは異なり、このアプローチは、3つの主要なブドウ球菌リン脂質タイプのそれぞれについて個々の脂肪酸異性体を定量することができる。オレイン酸(18:1)は、S.アウレウスリン脂質29、30、32に容易に組み込まれるすべての宿主リポタンパク質粒子内に存在する不飽和脂肪酸である。S.アウレウスはオレイン酸合成29ができない。従って、リン脂質組み込みオレイン酸の量は、ブドウ球菌膜29内の宿主リポタンパク質由来脂肪酸の存在を確立する。これらのリン脂質種は、ここで説明する最先端の質量分析法によって同定することができ、脂肪酸源の存在下で培養されたS.aureusの膜組成の前例のない分解能を提供する可能性が高い感染中に遭遇する。

<table><tbody><tr><td>硫酸アンモニウム</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP212R-1</td><td>&ge;純度99.5%</td></tr><tr><td>細胞培養インキュベーター</td><td>Thermo</td><td>MaxQ 6000</td><td></td></tr><tr><td>Centrafuge</td><td>Thermo</td><td>75-217-420</td><td>Sorvall Legen XTR, ローター F14-6x250 LE</td></tr><tr><td>Costar assay plate</td><td>Corning</td><td>3788</td><td>96 well</td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Schleicher &Schuell</td><td>597</td><td></td></tr><tr><td>Large chicken egg</td><td>N/</td><td>A N/A</td><td>Common store bought egg</td></tr><tr><td>マイクロプレート分光光度計</td><td>BioTek</td><td>Epoch 2</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>S. aureus strain AH1263</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>コロラド大学のAlex Horswill提供</td></tr> 透<tr><td>析チューブ</td><td>Pierce</td><td>68700</td><td>7,000MWCO</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Becton, Dickison and Company</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mm 酸化ジルコニウムビーズ</td><td>Next Advance</td><td>ZROB05</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender</td><td>Next Advance</td><td>BBX24B</td><td></td></tr><tr><td>メタノール (LC-MS グレード)</td><td>Fisher</td><td>A4561</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム (試薬グレード)</td><td>Fisher</td><td>MCX10559</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール (LC-MS グレード)</td><td>フィ</td><td>ッシャーA4611</td><td></td></tr><tr><td>ジミリストイルホスファチジルコリン</td><td>アバンティ極性脂質</td><td>850345C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸アンモニウム</td><td>シグマ</td><td>9830</td><td>&ge;純度99.5%</td></tr><tr><td>のギ酸アンモニウム</td><td>Sigma</td><td>70221-25G-F</td><td></td></tr><tr><td>Xcaliburソフトウェア</td><td>Thermo Scientific</td><td>OPTON-30801</td><td></td></tr><tr><td>LTQ-Orbitrap Velos 質量分析計</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>高分解能/精密質量 MS</td></tr><tr><td>Agilent 1260 キャピラリーHPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac 真空濃縮器</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

細菌病原体脂肪酸を膜リン脂質に取り込む研究のための鶏卵黄からのリポタンパク質粒子の単離

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

黄色ブドウ球菌および他のグラム陽性病原体は、環境からの脂肪酸を膜リン脂質に組み込む。感染中、外因性脂肪酸の大部分は宿主リポタンパク質粒子内に存在する。宿主脂肪酸の貯蔵所や、細菌がリポタンパク質粒子から脂肪酸を抽出するメカニズムに関しては、不確実性が残っている。本研究では、鶏卵黄からの低密度リポタンパク質(LDL)粒子を濃縮し、LDLがS.アウレウスの脂肪酸貯留槽として機能するかどうかを決定するためのプロトコルについて説明する。この方法は、LLLと細菌間の相互作用を探索するための効果的かつ経済的なモデルである、公平なリピドミック分析と鶏LLLを利用する。LDLからの外因性脂肪酸のS.aureus統合の解析は、高解像度/正確な質量分析とタンデム質量分析を用いて行われ、細菌の脂肪酸組成の特性評価を可能にする。LLLへの曝露時に細菌膜脂質に生じる脂肪酸の新しい組み合わせの膜および公平な同定。これらの高度な質量分析技術は、リン脂質に組み込まれた特定の外因性脂肪酸を明らかにすることによって、脂肪酸の組み込みの比類のない視点を提供します。ここで概説する方法は、他の細菌病原体および複合脂肪酸の代替供給源の研究に適応可能である。

鶏卵黄からのLDLの濃縮のためのプロトコルを図1に示す。このプロセスは、全卵黄を生理食で希釈し、顆粒と呼ばれる卵黄固体をLLLを含む可溶性または血漿分画から分離することから始まる(図1)33。血漿画分のLDL含有量は、〜30〜40kDaβ-ライブチン(図2)33の沈殿によってさらに濃縮される。140、80、65、60および15 kDaにおけるタンパク質バンドの存在は、LLLのアポプロテインと相関する(図2)33、39。トリクロサンによる治療は、脂肪酸フリー培中のS.アウレウスの増殖<sup class="xr...

この方法は、複雑な宿主源から細菌膜、特に黄色ブドウ球菌に外因性脂肪酸を取り込む研究のためのフレームワークを提供する。これを達成するために、鶏卵黄からのリポタンパク質粒子の濃縮のためのプロトコルと、質量分析を利用した細菌リン脂質のその後の脂肪酸プロファイリングについて説明する。

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

このプロトコルは、複雑な宿主源から細菌膜、特に黄色ブドウ球菌への外因性脂肪酸の取り込みを研究するためのフレームワークを提供する。このプロトコルは、鶏卵黄から分離された公平なリピドミック分析とリポタンパク質粒子を、脂肪酸を細菌脂質に組み込むものを定量化する複雑な脂肪酸の経済的源として利用しています。質量分析技術は、ここで記載されているブドウ球菌脂質の脂肪酸プロファイルの比類のない視点を提供するが、他の細菌膜を研究するために適応することができる。このプロトコルを実行する場合は、LDL 含有分数を識別して保持するために、各分数処理手順に注意する必要があります。血漿分画からの硫酸アンモニアの除去は、LDLの下流の用途に不可欠です。まず、2つの卵黄を30ミリリットルの無菌リン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し、残りのアルブミンを除去します。無菌ピペットチップでビテリン膜を穿刺し、無菌50ミリリットル円錐形遠心管に膜の内容物を排出します。卵黄にpH 7で約24〜30ミリリットルまたは17モル塩化ナトリウム溶液を加え、激しく混ぜます。その後、ロッキングシェーカーの上にチューブを置き、摂氏4度で60分間混ぜます。卵黄希釈液を摂氏10度で10,000倍gで45分間遠心分離する。上清プラズマ分を無菌50ミリリットル円錐形チューブに移し、ペレット状の粒状分画を残します。そして再び遠心分離機。まず、4°Cのロッキングシェーカーまたは同様の装置で、プラズマ分率を40質量体積%硫酸アンモニウムと60分間混合します。pHを調整した後、45分間、プラズマ画分を摂氏4度、10,000時間gで遠心分離する。上部半固体黄色の分率を7キロダルトンの孔サイズ透析管に取り除く。チュービングに25%以上の余分な部屋を用意して膨らませます。透析チューブを3リットルの超純水に入れ、硫酸アンモニウムを取り除くために一晩透析を摂氏3度で下します。透析後、前述のように摂氏4度で溶液を遠心分離する。上半固体の黄色分率を滅菌チューブに慎重に取り出し、摂氏4度で保管します。培養物を一晩培養した後、500マイクロリットルを1%トリプコンブロスの49.5ミリリットルを含む2つの無菌250ミリリットルバッフルフラスコに移す。摂氏37度で約4時間インキュベートし、揺れが中期に達する。100ミリリットルの培養物を25ミリリットル単位で4本の無菌50ミリリットル遠心管に移し、4本のチューブを10,000gで遠心分離して細胞をペレット化する。上清を取り除き、1%トリプトンブロスの750マイクロリットルの各細胞ペレットを再中断します。4つの750マイクロリットルセルサスペンションを15ミリリットルチューブに組み合わせます。そしてアリコート350マイクロリットルの細胞懸濁液を6つの無菌1.5ミリリットル遠心分離管に入った。ピペットを使用して1.5ミリリットル遠心分離管に30マイクロリットルのLLDを加え、所望の最終濃度5%を達成し、摂氏37度で4時間の振盪を行います。2分間16,000倍のgで摂氏4度で文化を遠心分離します。そして、洗浄するために330マイクロリットルの無菌リン酸緩衝生理食塩水中の細胞ペレットを再懸濁する。この洗浄をもう一度繰り返します。空の管の重量を減算して、6つの湿潤細胞ペレットの重量を記録する。スナップはドライアイス上の細胞ペレットを凍結します。まず、各細胞ペレットの上に5ミリメートル酸化ジルコニウムビーズの1スクープを追加します。740マイクロリットルの740マイクロリットルの75%HPLCグレードのメタノールをマイナス80°Cまで直接各チューブに加えます。次に、50マイクロモルジミリストイルホスファチジルコリンの2マイクロリットルを内部標準として追加します。1.5ミリリットルの遠心分離管を含むサンプルを弾丸ブレンダー組織ホモジナイザーの利用可能なポートに入れる。サンプルを低速で均質化します。2~3分の間に3分を設定します。サンプルの均質性を視覚的に検査します。セルの束が見える場合は、弾丸ブレンダーで 2 分ずつ均質化を続けます。次に、化学ヒュームフードの各サンプルにクロロホルムの270マイクロリットルを追加します。30分間、サンプルを激しく渦にかけます。ベンチトップ遠心分離機のサンプルを最低2,000回gで最大30分間遠心分離します。化学煙フードでは、モノファシカル上清を収集し、抽出管の底にあるタンパク質ペレットを慎重に避けながら、新しい試験管に移します。あらかじめ調製した希釈脂質抽出物を適切なオートサンプラーバイアルに移す。フローインジェクションベースの解析では、オートサンプラーバイアルをキャピラリーフローアプリケーションが可能なHPLCシステムの温度制御オートサンプラーに配置します。原稿に従ってHPLCシステムを設定します。溶離液は、HPLC移送ラインから質量分析計に、低流量34ゲージの金属針を取り付けたエレクトロスプレーイオン化源を介して導入される。Thermo Tune Plus の計測器制御ソフトウェアで、イオン化電圧を 4,000 ボルト、シースガスを 5 に設定します。同様に、キャピラリー温度を摂氏150度に設定し、Sレンズを50%に設定して、スキャンを定義ボタンをクリックし、アナライザーメニューでFTMSを選択します。質量範囲フィールドを標準に設定し、解像度フィールドで 100,000 を選択します。スキャンの種類が [完全] に設定されていることを確認します。スキャン範囲メニューで、最初の質量フィールドに 200 と入力し、最後の質量フィールドに 2,000 と入力します。観測質量精度をさらに定義した後、全イオンクロマトグラムの広いピークを横切る信号を平均化します。マススペクトル表示ウィンドウでサムタックアイコンを右クリックし、スペクトル表示リストを選択します。同じメニューから表示オプションを選択し、表示メニューのすべてのピークトグルボックスを選択します。[大丈夫]ボタンをクリックして、表示ウィンドウを閉じます。マススペクトル表示ウィンドウで thumbtack アイコンをもう一度右クリックし、エクスポートクリップボードの正確な質量を選択します。最初のワークシートのエクスポートされたデータセルA1を新しいExcelスプレッドシートに貼り付け、原稿に従って処理を進めます。正確な質量ベースの脂質同定を行うために、LIMSAソフトウェアを開いてください。メインメニューから、スペクトルタイプメニューのピークリストを選択します。質量分析データが取得された極性に対応するには、正のモードまたは負のモードを選択します。ピークの最大の最大と z の上のピークの全幅で、ピーク検索のための目的のマス検索ウィンドウを入力します。このプロトコルでは、血漿分画のLDL含有量は、30〜40キロダルトンβレビチンの沈殿によってさらに濃縮された。140、80、65、60、および15キロダルトンのタンパク質バンドの存在は、LDLのアポタンパク質と相関します。外因性脂肪酸源として卵黄血漿で培養物を補いながら、トリクロサン誘発性の成長阻害を克服する。同様に, 富化卵黄 LDL とトリクロサン処理培養の補充は、成長を復元します。.また、卵黄LDLの添加は、以前に特徴づけられていたS.アウレウス脂肪酸、食後の成長を支える。プレ脂肪酸含量は、フロー注入高分解能精度質量分析法を採用することにより、1%トリプトンブロスまたは鶏卵黄LDLで測定した。遊離脂肪酸の最小量が見つかりました.豊富なステープル・アウレウス膜リン脂質の直交部分最小二乗法分析は、未処理の脂肪酸組成と鶏卵黄LDL処理条件下で明確なクラス分離を示した。鶏卵黄からのLDLの濃縮は、細菌病原体と宿主リポタンパク質との相互作用を調査するための複雑な脂肪酸の安価な供給源を提供する。脂質抽出物の調製に用いるクロロホルムおよびメタノールは危険である。これらの試薬は化学発煙フードに入れて使用し、すべての廃棄物の流れを含めてください。

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Biochemistry

生物化学

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