Name: 初期開発におけるアネモネのジェノタイピング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: 学ぶ イソギンチャクNematostella vectensisの初期発生段階で非致死ジェノタイピングを行う手法。胚を傷つけずに突然変異体を同定し、胚後発生の表現型解析を可能にする。

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私たちは、原稿を改善した原稿の以前のバージョンに関するコメントのための匿名のレビュー担当者に感謝します。この研究はアーカンソー大学の資金によって支えられた。

1. 産卵、体外受精、脱ゼリーの誘導
<ol><li>16 °Cで暗闇の中で1000(ppt)あたり12部のサリン度で海水中のネマトステラベクテン症を維持し、毎日アルテミアを供給します。</li>
	<li>産卵の前日に、動物を温度と光制御のインキュベーターに入れます。動物が25°Cで8時間の光にさらされるようにインキュベーターをプログラムします。オプション:産卵を強化するためにインキュベーターに入れる前に、個々の動物にカキの小片(<1 mm 3)を供給します。</li>
	<li>16°Cで1時間のインキュベーターに動物を残します。</li>
	<li>インキュベーターから動物を取り出し、室温(RT)で光でベンチトップに残して産卵を許可します。スポーンは通常、次の1.5-2時間以内に発生します。</li>
	<li>オスとメスが別々の容器に入っている場合は、卵が機械的ストレスによって損傷を受けないように先端を切断して開口部を拡大する転写ピペットを使用して、メスの容器から精子を含むオスの容器に卵のパッケージを置きます。転送。卵を少なくとも15分間オスの容器に入れて受精させなさい。</li>
	<li>ペトリ皿または15mLチューブに3%システイン(pH 7.4)を含む海水中の卵パッケージを脱ゼリー。シェーカーで12分間ゆっくりと攪拌します。</li>
	<li>プラスチック製のピペットを使用して塊を分割し、完全に脱ゼリーされるまで別の2-3分間攪拌し続けます。</li>
	<li>少なくとも5倍の新鮮な海水でメディアを交換することにより、システインを削除します。</li>
	<li>受精卵をガラスペトリ皿の上に16 °C または RT で保管します。</li>
</ol>2. 胃胚からの腹部組織の外科的除去
<ol><li>10 mMトリス-HCl(pH8)、50mM KCl、1mM EDTA、0.3%Tween20、0.3%NP40、および1mg/mLタンパク質数K.からなるDNA抽出バッファーを胚当たり20mL使用する。ボルテックスでよく混ぜ、バッファをPCRチューブにアリコートします。</li>
	<li>海水に1%アガロゼを溶かし、底を覆うためにペトリ皿に注ぎます。ベンチトップで冷やしてゲルベッドを作ります。ペトリ皿のゲルベッドをカバーするために新鮮な海水を注ぎます。</li>
	<li>24時間の受精後(hpf)胚(早期から中ガストルラ段階)をアガロースゲルベッドを含むペトリ皿に移す。</li>
	<li>タングステン針を針ホルダーに挿入し、アルコール(70%以上)に針の先端を浸し、アルコールを燃やすために炎に入れて殺菌します。</li>
	<li>解剖顕微鏡(20倍~40倍の倍率)の下で、タングステン針を使用して、操作する胚の大きさに関する表面アガロースを取り除き、胚を横にしてうつ病の上に置くことによって、アガロースベッドにうつ病を作ります。マイクロ手術のための胚の動きを制限するために下向きに側面。</li>
	<li>タングステン針を使用して、口腔の表開きに反対側に位置する卵巣組織の一部を外科的に切除する。経口側軸に沿った胚組織の3分の1から4分の1の卵巣で十分である。</li>
	<li>P20ピペットを使用して、単離された側組織(<2 mL)を20mLのDNA抽出バッファーを含むPCRチューブに移します。</li>
	<li>手術後の胚を、24-または96ウェルプレートに少なくとも500mLの新鮮な海水を含む井戸に移す。</li>
	<li>必要に応じて胚の数に対して手順 2.4 ~ 2.8 を繰り返します。</li>
	<li>手術後の胚を含むウェルプレートを、ジェノタイピングが完了するまで16°CまたはRTのインキュベーターに置きます。</li>
</ol>3. ゲノムDNA抽出とジェノタイピングPCR
<ol><li>DNA抽出バッファーを含むPCRチューブと、ミニ遠心分離機を用いて単離された胚組織を簡単にスピンダウンします(例えば、10sの場合は2,680 x g)。</li>
	<li>単一胚からゲノムDNAを抽出するには、PCRチューブを30分毎に30時間30°Cで55°Cでインキュベートし、細胞塊の分裂を確実にし、細胞分解を増強します。</li>
	<li>PCRチューブを95°Cで5分間インキュベートし、プロテインナーゼKを不活性化します。</li>
	<li>gDNA抽出物を4°Cまたは氷の上に保管し、直ちにPCRに進みます。 注:プロトコルは、-20 °C冷凍庫にgDNA抽出物を置くことによって、ここで一時停止することができます。</li>
	<li>抽出されたgDNAをテンプレートとして使用してPCR反応を設定し、目的のゲノム遺伝子座を増幅する。<ol>
<li>目的の軌跡で異なるアレルがサイズが異なる場合は、アガロースゲル電気泳動によってサイズの違いを検出できるように、遺伝子座全体を増幅するプライマーの単一のセットを設計します。</li>
		<li>あるいは、特定の対立遺伝子の存在下でのみPCR製品を生成する対立遺伝子特異的プライマーを使用する。たとえば、挿入/欠失変異を含む領域に結合するプライマーを設計します。</li>
		<li>一般的な20mL PCR反応ミックスを使用する:gDNA抽出物5mL、ヌクレルレスフリー水8mL、PCLバッファー4mL、10mM dNTP0.2mL、DMSO0.6mL、1mMフォワードプライマーの1mL、1mLの1mLのリバースプライマー、およびDNAポリメラーゼの0.2 mL(材料の表を参照)。 注:PCR反応に複数のプライマーを使用できます。例えば、1つのユニバーサルフォワードプライマーと2つの対立遺伝子特異的リバースプライマーを組み合わせることができますが、2つの逆プライマーが異なるサイズのPCR製品を生成するように設計されている限り、2つの対立遺伝子の有無が明確に可能になります。ゲル電気泳動によって決定される(代表的な結果セクションを参照)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>アガロースゲル電気泳動を実行して、PCR製品のサイズと有無を判断します。PCR製品の期待サイズに応じて、アガロースゲル電気泳動の状態(例えば、アガロースゲルのパーセンテージ、V/cm、持続時間)の状態を調整します。</li>
	<li>PCR製品のサイズと有無に関するPCRの結果を使用して、手術後の各胚に遺伝子型を割り当てます。たとえば、異なる対立遺伝子が異なるサイズの PCR 製品を生成することが予想される場合は、サイズ情報を使用して各胚に遺伝子型を割り当てます。対立遺伝子特異的プライマーを使用する場合、PCR産物の有無に関するデータを使用して、各胚に遺伝子型を割り当てる必要があります。</li>
	<li>遺伝子型に従って胚を並べ替えます。</li>
</ol>

<ol><li>Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+hypotheses+of+basal+animal+phylogeny+using+complete+sequences+of+large+and+small+subunit+rRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).</li>
<li>Erwin, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cambrian+Conundrum%3A+Early+Divergence+and+Later+Ecological+Success+in+the+Early+History+of+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Cambrian Conundrum: Early Divergence and Later Ecological Success in the Early History of Animals.</a> Science. 334 (6059), 1091-1097 (2011).</li>
<li>Putnam, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sea+anemone+genome+reveals+ancestral+eumetazoan+gene+repertoire+and+genomic+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sea anemone genome reveals ancestral eumetazoan gene repertoire and genomic organization.</a> Science. 317 (5834), 86-94 (2007).</li>
<li>Magie, C. R., Daly, M., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrulation+in+the+cnidarian+Nematostella+vectensis+occurs+via+invagination+not+ingression%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Gastrulation in the cnidarian Nematostella vectensis occurs via invagination not ingression.</a> Developmental Biology. 305 (2), 483-497 (2007).</li>
<li>Nakanishi, N., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+knockouts+reveal+an+endogenous+role+for+ancient+neuropeptides+in+regulating+developmental+timing+in+a+sea+anemone%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">CRISPR knockouts reveal an endogenous role for ancient neuropeptides in regulating developmental timing in a sea anemone.</a> eLife. 7, e39742(2018).</li>
<li>He, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+axial+Hox+code+controls+tissue+segmentation+and+body+patterning+in+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis.</a> Science. 361 (6409), 1377(2018).</li>
<li>Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALEN+and+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+in+the+early-branching+metazoan+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis.</a> Nature Communications. 5, 5486(2014).</li>
<li>Servetnick, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-mediated+excision+of+Nematostella+brachyury+disrupts+endoderm+development%2C+pharynx+formation+and+oral-aboral+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cas9-mediated excision of Nematostella brachyury disrupts endoderm development, pharynx formation and oral-aboral patterning.</a> Development. 144 (16), 2951-2960 (2017).</li>
<li>Kraus, Y., Aman, A., Technau, U., Genikhovich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-bilaterian+origin+of+the+blastoporal+axial+organizer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Pre-bilaterian origin of the blastoporal axial organizer.</a> Nature Communications. 7, 11694(2016).</li>
<li>Fritzenwanker, J. H., Genikhovich, G., Kraus, Y., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+development+and+axis+specification+in+the+sea+anemone+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Early development and axis specification in the sea anemone Nematostella vectensis.</a> Developmental Biology. 310 (2), 264-279 (2007).</li>
<li>Lee, P. N., Kumburegama, S., Marlow, H. Q., Martindale, M. Q., Wikramanayake, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+developmental+potential+along+the+animal-vegetal+axis+in+the+anthozoan+cnidarian%2C+Nematostella+vectensis%2C+is+mediated+by+Dishevelled%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Asymmetric developmental potential along the animal-vegetal axis in the anthozoan cnidarian, Nematostella vectensis, is mediated by Dishevelled.</a> Developmental Biology. 310 (1), 169-186 (2007).</li>
<li>Shinzato, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+Acropora+digitifera+genome+to+understand+coral+responses+to+environmental+change%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Using the Acropora digitifera genome to understand coral responses to environmental change.</a> Nature (London). 476 (7360), 320-323 (2011).</li>
<li>Gold, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+the+jellyfish+Aurelia+and+the+evolution+of+animal+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">The genome of the jellyfish Aurelia and the evolution of animal complexity.</a> Nature Ecology & Evolution. 3 (1), 96-104 (2019).</li>
<li>Clevesa, P. A., Strader, M. E., Bay, L. K., Pringle, J. R., Matz, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+in+a+reef-building+coral%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated genome editing in a reef-building coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (20), 5235-5240 (2018).</li>
<li>Momose, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+doses+of+CRISPR%2FCas9+ribonucleoprotein+efficiently+induce+gene+knockout+with+low+mosaicism+in+the+hydrozoan+Clytia+hemisphaerica+through+microhomology-mediated+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion.</a> Scientific Reports. 8, 11734(2018).</li>
<li>Artigas, G. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gonad-expressed+opsin+mediates+light-induced+spawning+in+the+jellyfish+Clytia%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A gonad-expressed opsin mediates light-induced spawning in the jellyfish Clytia.</a> eLife. 7, e29555(2018).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

ここでは、動物を犠牲にすることなく単一の海アネモネ胚を遺伝子型化するPCRベースのプロトコルを説明する。産卵および脱ゼリーに続いて、受精卵はガストラーに発達することを許される。各ガストラ胚の卵巣領域は外科的に除去され、その後のゲノムDNA抽出に単離された卵巣組織が使用され、残りの手術後の胚は治癒し、発達を続ける。次に、gDNA抽出物をPCRアッセイに使用して、各胚の遺伝子型を決定します。この方法は、10、11、および胚の大部分を調節し、開発する海アネモネ胚の経口半分の能力を利用する(>90%)通常、手術を生き残り、適切な培養条件下で正常に発症する。この遺伝子入力アッセイに必要な組織量は、ガストルラ胚全体の半分未満であり、gDNA抽出失敗による陰性の結果はまれです(<5%)。少量の組織のみが必要であることを考えると、この遺伝子型付けアッセイに前ガストラステージ胚を使用する可能性が高い。しかし、これはまだテストされていません。この方法は、動物がアクティブな水泳の段階に達していない限り効率的に行うことができる(すなわち、自由泳...

クニダリアンはクラゲ、サンゴ、海のアネモネを含む動物の多様なグループを表します。それらは、細胞外マトリックス(メソグレア)によって分離された外皮および内皮から成るジプロプラストである。クニダリアは、ショウジョウバエやムスなどの伝統的な動物モデルが1に属するビラテリアを見極める姉妹グループです。さらに、クニダリア・ビラテリアの発散は、カンブリア紀前の2年に起こったと考えられている。したがって、クニダリアンと二国間の比較研究は、彼らの最も最近の共通の祖先の生物学に関する洞察を得るために不可欠です。最近、比較ゲノミクスは、クニダリアンと二国間の遺伝子がノッチやbHLHなどの多くの発達ツールキット遺伝子を共有していることを明らかにし、彼らの共通の祖先はすでにこれらの遺伝子3を持っていたことを示唆している。しかし、Cnidariaとバイラテリアの最後の共通祖先におけるこれらの発達ツールキット遺伝子の役割は、比較してあまりよく理解されていない。この問題に対処するためには、これらの深く保存された遺伝子がクニダリアンでどのように機能するかを研究することが重要です。
新しいクニダリアン遺伝モデルの一つは、アントゾアン・ネマトステラ・ベクテンシスである。そのゲノムは3を配列し、モルフォリノ媒介遺伝子ノックダウン、メガヌクレアーゼ媒介トランスジェネシス、CRISPR-Cas9媒介遺伝子ノクチンおよびノックアウトを含む様々な遺伝的ツールがこの動物で使用できるようになりました。また、ネマトステラの開発は比較的よく理解されています。胚発生時には、胃形成は浸変4によって起こり、胚は自由泳ぎプラヌラ幼虫に発達する。その後、プラヌラは口と円周触手を持つセッシルポリープに変身します。ポリープは成長し、性的成熟に達します。
CRISPR-Cas9媒介型標的変異体は、現在、ネマトステラベクテンシス5、6、7、8、9の遺伝子機能を研究するために日常的に使用されている。ネマトステラでノックアウト変異体を生成するために、遺伝子座特異的なシングルガイドRNAとエンドヌクレスリースCas9タンパク質を含むカクテルを最初に未受精または受精卵に注入し、F0の創始者の動物を生成する。モザイク。F0動物は、その後、性的成熟に育てられ、F1集団を生成するために互いに交差し、そのサブセットは、変異体6をノックアウトしてもよい。あるいは、性的に成熟したF0動物は、F1ヘテロジゴウス動物を生成するために野生型の動物と交配することができ、興味のある軌跡でノックアウト対立遺伝子を運ぶF1ヘテロジゴットは、F2子孫、四分の一を生成するために互いに交差することができますそのうちの5はノックアウト変異体であると予想される。どちらのアプローチも、遺伝的に異種集団からノックアウト変異体を同定する方法を必要とする。ポリープ触手は、ジェノタイピング6、7のためのゲノムDNAを抽出するために使用することができます。しかし、対象遺伝子の発達機能が調査され、変異胚がポリープ段階に達しない場合(すなわち、変異に関連する幼虫致死性のために)、ノックアウト変異体を早期に同定する必要がある。ここで説明するPCRベースのプロトコルは、動物を犠牲にすることなく、ガストラ段階で個々の動物を遺伝子型化するプロトコルであり、これは胚の遺伝的に異種集団からのノックアウト変異体の同定を可能にする。ジェノタイピングプロセス全体の持続時間は、スクリーニングする胚の数に依存しますが、最小限に4〜5時間を必要とします。

<table><tbody><tr><td>ショウジョウバエペルチェ冷蔵インキュベータ</td><td>ーShellab</td><td>SRI6PF</td>産<td>卵誘導に使用</td></tr><tr><td>インスタントオーシャンシーソルト</td><td>インスタントオーシャン</td><td>138510</td><td></td></tr><tr><td>ブラインシュリンプシスト</td><td>Aquatic Ecosystems, Inc.</td><td>BS90</td><td></td></tr><tr><td>L-システイン塩酸塩</td><td>Σ Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>標準オービタルシェーカー、モデル 3500</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td></td></tr><tr><td>TRIS-HCl、1M、pH8.0</td><td>QUALITY BIOLOGICAL</td><td>351-007-01</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>VWR</td><td>BDH9258</td><td></td></tr><tr><td>EDTA、0.5M pH8</td><td>VWR</td><td>BDH7830-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet-P40 Substitute</td><td>US Biological</td><td>N3500</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K溶液(20 mg / mL)、RNAグレード</td><td>ThermoFisher</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>VWR</td><td>710</td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Needle</td><td>Holder Roboz</td><td>RS-6060</td><td></td></tr><tr><td>タングステン解剖針</td><td>Roboz</td><td>RS-6063</td><td></td></tr><tr><td>PCR Eppendorf Mastercycler サーマルサイクラー</td><td>Eppendorf</td><td>E6336000024</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA ポリメラーゼ</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>dNTP ミックス</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>GLWamide ユニバーサルフォワードプライマー</td><td></td><td></td><td>5'- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3'</td></tr><tr><td>glw-a</td><td></td><td></td><td>5'-CCAGATGCCTGGTGATAC-3'</td>に特異的なリバースプライマー</tr><tr><td>glw-c </td><td></td><td></td><td>5'- CGGCCGGCGCATATATAG-3'</td> に固有のリバースプライマー</tr></tbody></table>

初期開発におけるアネモネのジェノタイピング

Genotyping of Sea Anemone during Early Development

ここに記載されているのは、動物の生命を犠牲にすることなく、アントゾアン・クニダリアン・ネマトステラ・ヴェテンシスのガストラ期胚を遺伝子型化するPCRベースのプロトコルである。体外受精および脱ゼリーに続いて、ザイゴットは早期から中型ガストルラ段階に達するために室温で24時間の開発を可能にする。ガストラ胚は、海水を含むペトリ皿のアガロースゲルベッドに置かれる。解剖顕微鏡の下では、タングステン針を使用して、各胚から卵巣組織断片を外科的に分離する。手術後の胚は治癒し、発達を続けることを許される。ゲノムDNAは、単離された組織断片から抽出され、遺伝子座特異的PCRのテンプレートとして使用される。遺伝子型は、PCR産物の大きさまたは対立遺伝子特異的PCR産物の有無に基づいて決定することができる。手術後の胚は、遺伝子型に従ってソートされます。ジェノタイピングプロセス全体の持続時間は、スクリーニングする胚の数に依存しますが、最小に4-5時間を必要とします。この方法は、胚の遺伝的に異種集団からのノックアウト変異体を同定し、発達中の現象型の分析を可能にするために使用することができる。

ネマトステラゲノムは、神経ペプチドGLWamideの前駆体タンパク質をコードする単一の遺伝子座を有する。この遺伝子座で3つのノックアウト変異体ア列(glw-a、glw-b、およびglw-c)は、以前に5が報告されている。野生型対立遺伝子を運ぶ4人のヘテロザイゴウス雄(+)とGLWamide遺伝子座(遺伝子型:+/glw-c)でノックアウト対立遺伝子glw -cは、野生型の対立遺伝子と異なるノックアウトを運ぶヘテロジゴウスメスと交配された。同じ遺伝子座でアレルglw-a (遺伝子型: +/glw-a)子孫を生成する。子孫には、glw -a/glw -c、+/glw -c、glw<su...

このプロトコルの目的は、胚を犠牲にすることなく、胃形成中に海アネモネネネメテラステッラベクテンシスを遺伝子入力することです。

Described here is a PCR-based protocol to genotype the gastrula stage embryo of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis without sacrificing the ...

このプロトコルにより、研究者は初期胚発生時に変異型イソギンチャクを同定し、胚発生後の表現型を分析することができます。この技術の主な利点は、動物の生命を犠牲にすることなく、早期に個々のイソギンチャクを遺伝子型化することができるということです。この手順を実証することは、私の研究室の大学院生であるミゲル・シルバです。産卵誘導の前日に、アネマトステッラの静脈を温度および光制御インキュベーターに入れ、動物が摂氏25度で8時間の光にさらされるようにインキュベーターをプログラミングする。翌日、インキュベーターから動物を取り出し、室温のベンチトップにライトを当て、産卵を可能にします。チップを切って開口部を拡大し、メス容器の卵パッケージを精子を含む男性容器に入れ、受精を可能にするために少なくとも15分間男性容器に入れます。受精後、卵のパッケージを脱ゼゼするには、ガラスペトリ皿の上に3%システインを含む海水に入れ、シェーカーの上で12分間静かに攪拌します。その後、プラスチック製のピペットで塊を分割し、完全にデジェリになるまでさらに2〜3分間攪拌し続けます。受精卵は同じ皿の上に摂氏16度または室温で保管してください。翌日、原稿に記載されているとおりにDNA抽出バッファーを調製し、ボルテックスでよく混合し、各チューブに20マイクロリットルを加えてPCRチューブにアリコートします。海水に1%アガロースを溶かし、底を覆うためにペトリ皿に注ぎ、ベンチトップで冷やしてゲルベッドを作ります。ゲルベッドに新鮮な海水を覆います。ピペットを使用して24時間受精後の胚をアガロースゲルベッド含有ペトリ皿に移す。タングステン針を必要ホルダーに挿入し、チップをアルコールに浸し、炎に入れてアルコールを燃やして殺菌します。解剖顕微鏡の下で、タングステン針を使用して、操作する胚の大きさの表面アガロースの一部を除去することによって、アガロースにうつ病を作る。次に、タングステン針を使用して、胚をうつ病に入れ、その側側を下にして、微小手術のための胚の動きを制限する。手術を成功させるためには、胚の動きを制限することが重要です。タングステン針で、口腔の斜口開口部の反対側に位置する口腔腹腔軸に沿って、腹腔組織の一部を外科的に除去する。P20ピペットを用いて、DNA抽出バッファーの20マイクロリットルを含むPCRチューブに単離された腹腔組織を移す。手術後の胚を、少なくとも500マイクロリットルの淡水を含む24ウェルプレートの井戸に移す。そして、ジェノタイピングが完了するまで、手術後の胚を含むプレートをインキュベーターに摂氏16度で置きます。単一胚からゲノムDNAを抽出するには、まず、ミニ遠心分離機を使用してDNA抽出バッファーおよび単離胚組織を含むPCRチューブを簡単にスピンダウンします。その後、30分ごとに30秒間ボルテックスしながら3時間摂氏55度でチューブをインキュベートし、細胞塊の分解を確実にし、細胞のライシスを増強します。プロテイナーゼKを摂氏95度で4分間不活性化した後、抽出されたゲノムDNAを鋳型にして、目的の遺伝子座を増幅するPCR反応を設定します。原稿に記載されているとおりに、目的のプライマーを設計します。20マイクロリットルPCR反応を設定します。PCRを完了した後、アガロースゲル電気泳動を実行してPCR産物のサイズと存在感または存在を決定し、PCR産物の予想サイズに応じてアガロースゲル電気泳動の状態を調整してください。サイズと存在または不在またはPCR産物に関するPCR結果を使用して、外科手術後の胚ごとに遺伝子型を割り当て、その遺伝子型に従って胚を並べ替えます。線虫ステラゲノムは、ニューロペプチドGLワミドの前駆体タンパク質をコードする単一の遺伝子座を有する。軌跡における3つのノックアウト突然変異対立遺伝子が以前に報告されている。Aノックアウト対立遺伝子を運ぶヘテロ接合系女性とCノックアウト対立遺伝子を運ぶヘテロ接合性雄との間のF1十字架の子孫の間で無作為にサンプリングされた胚から得られたPCR結果は、異なる遺伝子型を示す。胚1及び2は、Aノックアウトアレールの予想サイズに対応する単一のPCRバンドを示す。胚3および6は、ノックアウトアレスAおよびC.胚4、7、および8に予想されるサイズを有する2つのPCRバンドを示し、Cノックアウトアレーレの予想サイズに対応する単一のPCRバンドを示す。胚5はバンドを示さない、プライマー結合の欠如を示唆する。ゲノムDNA抽出失敗の可能性を排除するために、野生型配列に結合できるリバースプライマーを用いて別のPCRを実行した。予想サイズのPCR産物が検出されたところで、ゲノムDNA抽出が成功した。一方、抽出の失敗を示唆した製品はなかった。このプロトコルはイソギンマの胚のために設計されていますが、ゲノム情報や胚がアクセス可能なサンゴやクラゲなどの他のクニダリアンにこの方法を適用することは確実です。この手順に従って、同定された変異体は、発達表現型を評価するために使用される。例えば、免疫染色などの組織学的手法を使用して形態の欠陥を評価し、その際に遺伝子の発現の欠陥を評価するために、その際に、リアルタイム定量的RT-PCR、およびRNA-seqを用いることができる。また、生画像化は、幼虫や初期ポリープなどの胚後の発達中の挙動の欠陥を評価するために使用することができる。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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シンプルの力：ウニ胚として<em&gt; in vivoで</em&gt;複雑な細胞間シグナル伝達ネットワークの相互作用を研究するための発達モデル

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C.エレガンス胚発生を解析するセミハイスループットイメージング法とデータ可視化ツールキット

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簡単なバイオアッセイによる海アネモンからの粗抽出物中の溶血性およびホスホリパーゼ活性の同定

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クニダリアンモデル系Exaiptasia diaphanaにおけるクロマチン免疫沈降

学ぶ イソギンチャクNematostella vectensisの初期発生段階で非致死ジェノタイピングを行う手法。胚を傷つけずに突然変異体を同定し、胚後発生の表現型解析を可能にする。

初期開発におけるアネモネのジェノタイピング

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