ミバエショウジョウバエVivo で貪食能アッセイを使用しての細胞性免疫能を評価します。
2019年4月10日
このプロトコルでは、食細胞の認識および微生物感染症のクリアランスを定量化する大人のショウジョウバエの体内貪食アッセイについて説明します。
この生体内食細胞化アッセイは、研究者が成人血液細胞の貪食を調節する新しい遺伝子を同定するために、遺伝的スクリーンおよびゲノムワイド関連研究を行うことを可能にする。この実験は、定量的に実行しやすく、病原体の認識、取り込み、およびクリアランスに影響を与える宿主因子の生きた動物のスクリーニングに適用することができる。薄壁のガラス毛細血管を針の引き手で引っ張った後、マイクロメーターを使用して針を顕微鏡の下に保持し、5番の細かい点、ステンレス鋼のピンセットを使用して先端を100マイクロメートルの先端直径に割ります。
各フライに注入される液体の量を測定するには、PBSで無菌5%の食品着色剤を持つ毛細血管針をロードし、0.01ミリメートルの段階マイクロメートルで鉱物油の滴に液体を排出します。1ミリリットル当たり10マイクロリットルをパラフィルムの小さな正方形に分配し、液体を針に引き込みます。注射器ノズルに針を取り付け、麻酔付きハエをフライパッドの指定された領域に沿って並べ、腹側を上に、ヘッドはパッドの前面に向けます。
バイアルをベンチの対応する領域に置き、腹部の上部にハエを5個、100ミリ秒の液体ポンプで注入し、合計で約10ナノリットルの粒子を送達します。各フライを適切なバイアルに移し、バイアルの時間に基づいて注入します。次に、0.4%のTrypan Blue溶液で新しい針をロードし、空気インジェクターをゲートに設定して、一定の空気の流れが針から液体を押し出すことを可能にします。
最初の注射の30分後、腹部がいっぱいになるまでトリパンブルーで各フライ腹部を注入し、膨張させます。ハエを電気テープで顕微鏡スライドに取り付け、腹側を下に下ろし、翼をハエの側面に押し付けてテープに固定します。その後、テープに頭をそっと押し込み、フライが動かないようにします。
すべてのハエが確保された直後に、デジタルカメラとコンピュータに取り付けられた反転蛍光顕微鏡上で、デジタルカメラ用のコンピュータソフトウェアを使用して各ハエの後部血管に焦点を当てて、昆虫を一度に1回ずつ画像化します。次に、実験間の露光時間と倍率を記録する。蛍光を定量するには、適切なイメージング解析プログラムを開き、1つの画像を開きます。
後部血管の蛍光強度を測定するには、後部血管の周囲に多角形を描き、測定を選択して多角形内部の蛍光強度を記録します。背景蛍光強度を決定するには、最初のポリゴンをコピーし、各フライの裏側血管に隣接する領域に移動します。次に、[測定]を選択し、背景領域の蛍光強度を記録します。
バックグラウンド蛍光による背部血管蛍光を正規化するために、残りのハエの蛍光強度を測定した後、背部血管をバックグラウンド蛍光で除算し、全てのハエの平均正常化された背振り強度を1株で算出する。電気テープの上に腹側を取り付けた後、後部容器が置かれている腹部の最初の2つのセグメントははっきりと見える。実験エラーの主な原因は、手順の注入およびイメージングステップで発生します。
同じ針を使用して複数のハエを注入すると、フライ組織や粒子で詰まる可能性があります。十分なトリパンブルー蛍光を十分に受け取らないハエは、腹部全体を通して明るく、後部血管の背景蛍光に対する比率を減少させ、動物の真の蛍光強度比を低下させることができる。ハエは二酸化炭素で固定化しながら撮影する必要があります, 積極的に動くハエは、定量化することができないぼやけた画像を生成します.
エチルメタンスルホン酸ハエのZukerコレクションからの変異線は、グラム陰性およびグラム陽性細菌を貪食することができず、生体内ファゴサイトーシスアッセイにおいてほとんど背後血管蛍光を示さない。ハエが画像化されたときに病原体認識と取り込みの同等の段階にあることを確認するために、ハエが注入される時間と順序を追跡します。食細胞性欠損の根底にある分子メカニズムは、共焦点顕微鏡による単血球の研究、または蛍光活性化細胞選別後、または成体血球の磁気ビーズ単離によって決定することができる。
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概要
本プロトコルでは、微生物感染に対する食細胞の認識および除去を定量化するための、成体キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）におけるin vivo食作用アッセイについて説明します。この実験は定量的な手法であり、実施が容易であるため、病原体の認識、取り込み、および除去に影響を与える宿主因子の生体動物スクリーニングに適用することが可能です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 免疫学
- 遺伝学
背景
- 食作用は極めて重要な免疫応答です。
- キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）はモデル生物として利用されます。
- 食細胞の機能を理解することで、免疫調節に関する知見を得ることができます。
- 本アッセイは、関連遺伝子を特定するための遺伝学的スクリーニングを容易にします。
研究目的
- 微生物感染に応答した食細胞活性を定量化すること。
- 食作用を制御する新規遺伝子を特定すること。
- 宿主と病原体の相互作用に関する理解を深めること。
使用方法
- 注入用薄壁ガラスキャピラリーの調製。
- 液体量測定のためのPBS調製滅菌食用色素の使用。
- ショウジョウバエへの注入に向けたParafilm上への粒子の分注。
- 正確な注入を行うための麻酔下にあるショウジョウバエの固定。
主な結果
- 食細胞による認識およびクリアランスの定量化に成功したこと。
- 食作用に影響を与える遺伝的因子の特定。
- 本アッセイが生体動物に適用可能であることの提示。
- 免疫応答に関するさらなる研究の促進。
結論
- in vivo 食細胞機能解析アッセイは、研究者にとって価値のあるツールです。
- これにより、免疫機能に対する遺伝的影響を探索することが可能になります。
- 今後の研究は、これらの知見に基づいて免疫研究をさらに深化させることができます。
よくある質問
産業界における重要性
キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）を用いたこのin vivo食作用アッセイは、宿主と病原体の相互作用を評価し、細胞性免疫の遺伝的調節因子を特定するための遺伝学的操作が容易なシステムを提供します。その定量的かつ再現性のあるリードアウトにより、免疫学に特化した創薬プログラムにおける初期段階のターゲットバリデーションおよびメカニズムのリスク低減が可能になります。本アッセイは、自然免疫機能における予測信頼性の高い治療ターゲットを優先的に選定するためのスクリーニングキャンペーンを支援します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 生体動物内における粒子の取り込みと破壊を定量化することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用上の価値： 食細胞作用に影響を与える新規遺伝子を特定するための遺伝学的スクリーンを通じて、生物学的なリスク低減を促進する。
- 予測的価値： 血球細胞の活性を病原体認識および除去メカニズムに結びつけることで、ポートフォリオの優先順位付けを支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：定量的蛍光測定により、異なる遺伝的背景における食細胞能の標準化された評価が可能になります。
- 運用の価値：宿主因子のライブアニマルスクリーニングに対応した、拡張可能で簡便なワークフローを提供します。
- 再現性の価値：粒子の投与量を制御し、背側血管の蛍光強度を正規化することで、一貫した結果を保証します。
翻訳および前臨床研究
- 科学的価値： 翻訳バイオマーカーとの整合性を備え、保存された自然免疫メカニズムを研究するための疾患関連システムを提供する。
- 運用の価値： 貪食能の欠損と変異体表現型を相関させることで、リスクを調整した開発推進の意思決定を可能にする。
- 予測的価値： 病原体の取り込みと排除を調節する遺伝的要因を特定することにより、メカニズムに基づいたリスク低減を支援する。
パイプラインおよびワークフローの統合
本アッセイは、免疫学における仮説検証およびパスウェイの解明を支援する初期探索段階に位置付けられており、微生物クリアランスに影響を与える宿主因子の遺伝学的スクリーニングを通じたリード同定に直接的に活用できます。
- 探索生物学：制御された条件下でショウジョウバエの血球における粒子の取り込みを測定することにより、食細胞作用のメカニズムに関する仮説検証を可能にする。
- スクリーニング：病原体の認識および取り込みに影響を与える遺伝的変異体を評価するための、アッセイの準備体制と定量的出力を提供する。
- 分析：正規化された蛍光強度読取り値を生成し、異なる実験条件下での食細胞活性の比較を可能にする。
- トランスレーショナルリサーチ：無脊椎動物と哺乳類の間で進化的に保存された免疫経路を利用することで、前臨床段階への継続性を確保する。
- 企業の再利用：遺伝的な扱いやすさと定量的な設計により、免疫学的な標的に対する再利用可能なスクリーニングプラットフォームとして機能する。
運用および企業への影響
- 科学的価値：細胞免疫応答におけるメカニズム的な曖昧さを排除することで、標的バリデーションの予測信頼性を向上させる。
- 運用の価値：精密な粒子注入と蛍光定量により、標準化と再現性を確保する。
- 戦略的価値：変異株における食細胞機能不全の早期検出を可能にし、go/no-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響：病原体クリアランス効率への影響に基づいた、リスク調整後の標的優先順位付けを支援する。
実施上の検討事項
- Drosophilaの取り扱い、マイクロインジェクション、および蛍光顕微鏡に関する専門知識が必要です。
- 粒子の安定した導入と検出のためには、ニューマチックインジェクター、キャピラリーニードル、およびイメージングシステムに依存します。
- 再現性のあるイメージングを確保するために、ハエの固定および腹側マウントの標準化されたプロトコルが必要です。
- 本アッセイを異なる種類の粒子や感染モデルに拡張する場合、適応に関する検討が必要です。
- 実用上の制限として、ハエの組織によるニードルの詰まりや、背景蛍光に影響を与えるTrypan Blue注入のばらつきが挙げられます。
