Name: 液滴デジタルトラップ (ddTRAP): 液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応へのテロメア反復増幅プロトコルの適応 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: 学ぶ液滴デジタルPCRを用いたテロメラーゼ活性測定法ddTRAP。NP-40溶解バッファーとPMSFプロテアーゼ阻害剤を使用し、96サンプル同時処理が可能。高感度かつ定量的な解析により、細胞老化とがん研究の統計的信頼性を向上させる。

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著者は、国立衛生研究所 (NIH) (R00 ・ CA197672 ・ 01A1) からの資金調達源を確認したいと考えています。小細胞肺癌線 (SHP77 と H82) は、ジョン・みんなと Adi Gazdar ・メディカル・センターから贈られた、寛大な贈り物でした。

1. バッファの準備と保存
<ol><li>50の1x ストック RNase-/DNase-free NP-40 溶解バッファー (10 mM トリス-HCl [pH 8.0]、1 mM MgCl2、1 mm ethylenediaminetetraacetic 酸 (EDTA)、1% [vol/VOL] NP-40、10%(vol/vol] グリセロール、150 mm NaCl、5 mm β-メルカプトエタノール、および 0.1 mm 4-benzenesulfonyl 塩酸塩 (AEBSF))。このバッファは、将来の使用のために-20 ° c で等分および保存することができます。細胞の最適な溶解を得るために、凍結/解凍サイクルを避けてください。</li>
	<li>10倍のストック RNase-/DNase-free トラップ拡張バッファー (200 mm MgCl-HCl [pH 8.0]、15 mm アミノエチルシステイン2、630 mM KCl、0.5% [vol/vol] トゥイーン20、および 10 mM エチレングリコール-ビス (β-エーテル)-n、n、n ′、N′-tetraacetic 酸 (EGTA)) を50準備します。この緩衝液を 1 mL アリコートに等分し、将来の使用のために-20 ° c で保存することができます。</li>
</ol>2. 細胞溶解
<ol><li>
細胞の調製
	<ol>
<li>40溶解バッファーの冷凍アリコートを解凍します。解凍したら、溶解バッファーを氷上に置きます。40溶解バッファーに phenylmethylsulfonyl フッ化物 (PMSF プロテアーゼ阻害剤) を添加し、0.2 mM の最終濃度に達します。 注: これは、セルを溶解するする直前に行う必要があります。</li>
		<li>収集した細胞ペレットから余分な液体を除去して、乾燥細胞ペレットを確保します。これらの溶液が下流の手順に干渉する可能性があるため、新たに採取された、または以前に凍結していた (-80 ° c または液体 N2のフラッシュ冷凍の) 細胞ペレットは、以前の centrifugations からの残留溶液を含まないようにしてください。</li>
		<li>それらをポジティブおよびネガティブコントロールとして使用するために、テロメラーゼ陽性およびテロメラーゼ陰性細胞株 (BJ 線維芽細胞、IMR-90 または U2OS) の両方を成長、収集、凍結します。アッセイの再現性を確保するために毎回新しい制御溶解液を使用します。 注意: テロメラーゼ陰性細胞の大規模な培養は、細胞株の長期培養中に導入されるかもしれない組織培養関連のアーティファクトを除去するために凍結する前に増殖させ、等分することをお勧めします。陰性対照サンプル。</li>
		<li>細胞ペレットを氷上に置く。細胞が凍結していた場合は、氷の上で簡単に解凍することができます。 注: ddTRAP の典型的な細胞ペレットサイズは、50万と100万細胞の間にあります。より小さい細胞ペレットは、必要に応じて使用することもできるが、細胞数は、理想的には既知でなければならない。DdTRAP は、BCA タンパク質アッセイ (入力は通常1μ g) を使用してタンパク質入力に基づいて行うこともできます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
細胞の溶解する
	<ol>
<li>40溶解バッファー内のセルを溶解します。25000細胞/μ l のバッファーの細胞等価性を維持してください。例えば、溶解は40μ l の NP-40 溶解バッファーにペレット (100万細胞を含む) を含有する。セルを開くために、溶解液をそっと pipet ます。泡を作ることを避けるようにしてください。</li>
		<li>細胞を氷上で30分溶解ことができるようにします。細胞デブリのクラスターが形成されないように、溶解液を優しく渦巻きしてください。これは、10分ごとに行うことができ、溶解液を均質化した混合物を維持することを意味します。</li>
		<li>細胞溶解液 (25000 細胞/μ l) 1:20 を NP-40 溶解バッファーに希釈し、新しい細胞等価性1250細胞/μ l を作ります。例えば、5μ l の細胞溶解液を95μ l の溶解バッファーに希釈します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. テロメラーゼ伸長反応
<ol><li>テロメラーゼ伸長反応 (反応ごと) のためのマスターミックス (表 1) を準備します。 注: 細胞溶解中に伸長反応マスターミックスを準備し、それを氷上に保管することをお勧めします。<ol>
<li>Pipet 48 μ l の拡張マスターミックスを各 PCR チューブに混合します。</li>
		<li>希釈した (1250 細胞/μ l) ライセートの2μ l を伸長反応に加える。総容積は今50細胞/μ l の最終的な細胞の等量の50μ l であるべきである。</li>
	</ol>
</li>
	<li>テロメラーゼ伸長反応を行う (表 2)。</li>
	<li>テロメラーゼ延長製品を4° c で 3 ~ 5 日間保管してください。ただし、最初の24時間以内に拡張製品を使用することが最適です。</li>
</ol>4. 液滴デジタル PCR セットアップ
<ol><li>DdTRAP (反応ごと) のマスターミックス (表 3) を準備します。 注: 試薬が室温になったら、それらまたはマスターミックスを氷上に置かないでください。氷の上にミックスを配置すると、粘度が上昇し、液滴の形成につながる可能性があります。DdPCR スーパーミックスの DNA ポリメラーゼはホットスタートであり、室温で安定している必要があります。DdPCR スーパーミックスは、初期解凍後-20 ° c で4° c で保存することができます。<ol>
<li>Pipet 19.8 μ l の ddPCR マスターミックスを各 PCR チューブに挿入します。</li>
		<li>各チューブに2.2 μ l の伸長反応を加えます。合計体積が22μ l であることに注意してください。 注: ddTRAP に必要なサンプルの総量は、20μ l (100 細胞の細胞当量) です。余分なボリュームは、pipet エラーまたはサンプルの損失のための予防措置です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>液滴生成カートリッジをセットアップします。 注: カートリッジには、ラベル付けされたウェルの3つの異なる列が含まれています。<ol>
<li>ステップ4.1.2 に従って調製した反応の20μ l をカートリッジ内の試料ウェル (中段ウェル) にロードする。サンプルをピペッティングするときは、泡を避けてください。 注: 気泡がある場合は、カートリッジの側面を軽くタップして、これらの泡が溶液の上部に来るようにします。</li>
		<li>オイルウェルに70μ l の液滴発生油を負荷する (左よく)。 注: 汚染を避けるために、厳密に ddPCR 液滴生成ステップのためのピペットおよび先端の別のセットを使用してください。カートリッジのロード順序は重要です。油が重くなるにつれて試料を装填しなければならず、マイクロ流体チャンバを満たし、低液滴形成につながる。実行できるサンプルの最小数は8です。任意の空の井戸は、液滴発生器からの液滴発生で停止につながるように、カートリッジのすべてのウェルは、サンプルと一緒にロードする必要があります。カートリッジ内に8個のウェルをすべてロードするのに十分なサンプルがない場合は、ddTRAP マスター・ミックスの20μ l (ステップ 4.1) を残りのカートリッジにロードすることができます。</li>
		<li>ガスケットをカートリッジの端に固定して、取り付けます。 注: ガスケットの欠如または不適切な配置は、発電機が液滴を発生させるのを防ぎます。</li>
		<li>ロードされ、組み立てられたカートリッジをドロップレット・ジェネレーターに入れます。 注: カートリッジは発電機の磁石によって認識され、カートリッジが適切に配置されたときにユーザーに通知されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>液滴が生成され、サイクルが完了したら、カートリッジを取り外します (~ 60 ~ 90 秒)。<ol>
<li>カートリッジからガスケットをそっと取り外します。Pipet は、新たに生成された液滴 (右井戸) をマルチチャンネルピペットを使用して、96ウェル PCR プレートに挿入します。 注: 新たに生成された液滴エマルジョンのおおよその体積は、40〜43μ l でなければなりません。</li>
		<li>プレートをアルミ箔 PCR プレートシールで熱シールすると、PCR ステップ中の蒸発を防ぐために、すべてのサンプルが96プレートにロードされます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>96-ウェルプレートを thermocycler にロードし、次の PCR 反応を行います (表 4)。 注: 適切に反応を加熱するためには、温度ステップ間のすべてのランプレートを2.5 ° c/s に設定する必要があります。</li>
</ol>5. テロメラーゼ拡張製品の検出
<ol><li>96-ウェルプレートを液滴読み取り装置にロードします。 注: A1サンプルがホルダと一致するように、プレートの向きを正しくしてください。<ol>
<li>ドロップレットリーダーに関連付けられているソフトウェアを開きます。最初のウェルA1をダブルクリックして、サンプル/ウェルエディタ画面を開きます。</li>
		<li>[実験] をクリックし、ドロップダウンメニューから [ ABS ] を選択します。 注:実験は、使用するアッセイの種類 (すなわち、絶対定量または遺伝子コピー数アッセイ) を定義します。ABSは絶対定量の略です。</li>
		<li>QX200 DdPCR Evagreen スーパーミックスを選択して、正しい検出方法がリーダーによって使用されていることを確認します。[ウェルエディタ] 画面の右下にある [適用] をクリックして、強調表示されているすべての井戸にユーザー定義の設定を保存します。 注:スーパーミックスは、読者が読み取る PCR ミックスと検出化学のタイプを定義します。</li>
		<li>サンプルを定義するために、ソフトウェアのウェルエディタ画面でターゲットをクリックしてください。</li>
		<li>[ターゲット] ドロップダウンメニューをクリックし、[不明]、[参照]、または [ NTC ] (テンプレートなしのコントロール) のいずれかを選択して、サンプルのタイプを定義します。 注: Unknownは、実験的サンプルを参照し、参照は既知のテロメラーゼ活性の対照サンプルであり得る、およびNTCは、汚染という点でアッセイの妥当性を決定するための重要な制御であり、バックグラウンドシグナル。</li>
		<li>[サンプル名] セクションのすべてのサンプルにラベルを付け、[適用] をクリックして、ハイライト表示されたウェルを適切に編集します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>プレートを実行/読み込みするには、[実行] をクリックします。プレートの読み取り方向を機械に通知するよう求められたら、[実行オプション] 画面で列または行のいずれかを選択します。</li>
</ol>6. データ分析
<ol><li>個々の井戸をクリックして、各サンプルの受け入れられた液滴の数を決定します。個々のウェルまたは列/行ヘッダーをダブルクリックして、サンプルデータを表示および分析します。 注: 特定のサンプルの分析を進めるかどうかに関する最も重要な基準は、「受け入れられた液滴」の数です。DdTRAP の場合、1万以上の受け入れられた液滴を有するサンプルは、さらなる分析のために有効である。データは、.csv テーブル、.jpg イメージ、ヒストグラムなど、さまざまな形式でユーザーに提供できます。DdTRAP11、13などの ddPCR データの詳細な分析に使用できる多くのリソースがあります。これらのリソースは、閾値11,13の選択から、さらなる分析のためのサンプルの選択までの ddTRAP データを分析するためのガイド11,13, 偽陽性とネガ13を識別し、一般的なトラブルシューティング13.</li>
	<li>サンプルの反復および NTC サンプルを表すウェルをハイライトします。BJ 細胞などの NTC コントロールラインまたはネガティブ制御線と比較してサンプルを分析します (ステップ2.1.2 の上に示しました)。<ol>
<li>画面の左下にあるしきい値を設定するアイコンをクリックして、サンプルのしきい値を手動で設定します。個々のウェルまたは複数のウェルのしきい値を一度に設定します (推奨)。 注: 「NTC」でバックグラウンドが検出された場合は、他のすべてのサンプルから減算してシグナルを「正規化」し、真陽性シグナルのみが分析されるようにすることができます。NTC 値は、通常、NP-40 溶解バッファーシステムの 0.2-1 分子/μ l の範囲にあります。他のバッファー・システムおよびコンポーネントをテストする必要があります (例えば、バッファー)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

作者は何も開示することはありません。

テロメラーゼの活動の測定は、癌、テロメア生物学、老化、再生医療、および構造ベースの薬物設計を含むが、これらに限定されない研究テーマの茄多に重要です。テロメラーゼ RNPs は、がん細胞であっても、豊富に不足しているため、この酵素の検出と研究は困難です。本論文では、新たに開発した ddTRAP アッセイについて、細胞内のテロメラーゼ活性を確実に定量化するためのステップバイステップの手順について説明しました。DdPCR との伝統的なテロメラーゼ伸長反応を組み合わせることにより、肺癌細胞におけるテロメラーゼ活性 (テロメラーゼ拡張産物) を定量的に検出することができました。
DdTRAP アッセイは、トラップアッセイと同じ理論に依存しています。細胞溶解物は、溶解する細胞によって得られ、非イオン性洗剤 (NP − 40) 溶解緩衝液中で酵素活性を維持し、次いで、「TS」基質/プライマーのテロメラーゼ伸長反応を実行するために使用される。DdTRAP の新規性は、PCR の前に液滴の形成に依存しています。サンプルを液滴に分割することにより、アッセイでは細胞ごとのテロメラーゼ活性を絶対的に定量す...

テロメアは、線状染色体の末端にある動的な DNA-タンパク質複合体です。ヒトテロメアは、出生1で 12-15 キロベース (kb) の長さが異なる 5 '-TTAGGGn hexameric の繰り返しの配列で構成されています。ヒトテロメラーゼは、テロメアを維持する ribonucleoprotein 酵素を、HeLa 細胞溶解物 (癌細胞株)2で最初に同定した。共に、テロメアとテロメラーゼは、ゲノム保護、遺伝子調節、および癌細胞不滅性3、4、5、6などの生物学的プロセスのスペクトルにおいて主要な役割を果たしています。
ヒトテロメラーゼは主に、テロメラーゼ逆転写酵素とテロメラーゼ RNA (hTERT および hTERC) の2つの主要成分から構成されています。タンパク質サブユニットは、hTERT、テロメラーゼ酵素の触媒活性逆転写酵素成分である。RNA テンプレート、hTERC は、テロメアを拡張および/または維持するためのテンプレートをテロメラーゼに提供する。ほとんどのヒト体細胞組織は、検出可能なテロメラーゼ活性を有しない。DNA ポリメラーゼが不足している DNA の末端を広げることができないことは、テロメラーゼの欠如とともに、細胞分裂の毎ラウンド後のテロメアの漸進的短縮につながります。これらの現象は、ほとんどの体細胞において、非常に短い長さに達するまでテロメア短縮をもたらし、それによって細胞は複製老化の状態に入る。細胞が分裂できる最大回数はそのテロメア長によって決まり、このブロックはもとづき7への進行を防ぐと考えられています。がん細胞はテロメア誘発複製の老化を克服することができ、テロメラーゼを利用してテロメアを維持することによって増殖を続けています。癌の約 90% がテロメラーゼを活性化し、癌の検出と治療の両方においてテロメラーゼ活性を極めて重要なものにします。
1990年代の TRAP アッセイの開発は、テロメラーゼ酵素の必要な成分の同定、ならびに正常および癌性の両方の細胞および組織の広い範囲におけるテロメラーゼの測定に役立った。元のゲルベース PCR アッセイは、テロメラーゼの活性を検出するために放射能標識された DNA 基質を使用しました。2006では、アッセイは、蛍光標識された基材8、9を用いて非放射性形態に適応した。蛍光標識された基質を使用することにより、ユーザーは正しい励起波長に曝露することによってテロメラーゼ伸長製品をゲル上のバンドとして可視化することができました。トラップアッセイの感度と、粗細胞溶解物中のテロメラーゼ活性を検出する能力は、このアッセイをテロメラーゼ活性検出に最も広く使用されている方法にしました。しかし、TRAP アッセイには限界があります。このアッセイはゲルベースであるため、適度な高スループットの試験では必要とされる反復を行うことが困難であり、適切な統計分析はほとんど達成されません。さらに、ゲルベースのアッセイは、サンプル間のテロメラーゼ活性の2倍未満の差を検出できないため、確実に定量化することが困難である。これら2つの制限を克服することは、患者のサンプルまたは薬物設計研究におけるテロメラーゼの活性を検出するための臨床または業界の設定に移動するトラップなどの酵素活性アッセイにとって重要である。
デジタル PCR は、PCR の指数的およびアナログ的性質を線形およびデジタルアッセイ10に変換する手段として、1999年に最初に開発されました。液滴デジタル PCR (ddPCR) は、元のデジタル PCR の方法論の最新の技術革新です。液滴デジタル PCR は確実に安定した、同じ大きさの液滴を生成するために、高度なマイクロ流体と水中油エマルジョン化学の出現によって来ました。ゲルベースであっても定量 PCR (qPCR) とは異なり、ddPCR は入力材料の絶対定量を生成します。DdPCR の鍵は、サンプルを液滴に分割することによって、〜2万の個々の反応を生成することです。エンドポイント PCR に続いて、液滴読み取り装置は、フローサイトメーターのような方法で各液滴をスキャンし、カウント、サイジング、および個々の液滴における蛍光の有無 (すなわち、各液滴における PCR アンプリコンの存在または不在) を記録する。次いで、ポアソン分布を用いて、液滴の総数に対する正の液滴の比率に基づいて入力分子が推定される。この数値は、各 PCR における入力分子数の推定値を表します。さらに、ddPCR は、ユーザーが多くのサンプルを実行することを可能にし、適切な統計分析のために生物学的および技術的な複製を行うことができる96ウェルプレート上で実行され、分析します。その結果、ddPCR の強力な定量と中程度のスループットの性質をトラップアッセイと組み合わせて、ddTRAP アッセイ11を開発しました。このアッセイは、生物学的試料11,12からの絶対的なテロメラーゼ活性を研究し、確実に定量化するためにユーザが設計されています。DdTRAP の感受性は単一細胞の測定を含む限られた、貴重なサンプルからのテロメラーゼの活動の定量化を可能にする。さらに, ユーザーは、2倍未満の変化 (〜 50% の差) の絶対定量とテロメラーゼの操作および/または薬物の効果を研究することができます。DdTRAP は現代実験室の実験および臨床設定のデジタルおよびより高い効率の性質にトラップの試金の自然な進化である。

<table><tbody><tr><td>1 M Tris-HCl pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td>RNAse/DNAse フリー</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td>RnAse/DNAse フリー</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9261</td><td>RNAse/DNAse フリー</td></tr><tr><td>サーファクタアンプ NP-40</td><td>Thermo Scientific</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>100% Ultrapure Glycerol</td><td>Invitrogen</td><td>15514011</td><td>RNAse/DNAse フリー</td></tr><tr><td>フッ化フェニルメチルスルホニル</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td>粉末</td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>516732</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー H20</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td>RNAse/DNAse free</td></tr><tr><td>2.5 mM dNTP mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>R72501</td><td>各dATP、dCTP、dGTP、dTTPの各2.5 mM</td></tr><tr><td>2 M KCl</td><td>Ambion</td><td>AM9640G</td><td>RNAse/DNAseフリー</td></tr><tr><td>100% Tween-20</td><td>Fisher</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EGTA pH 8.0</td><td>Fisher</td><td>50-255-956</td><td>RNAse/DNAse free</td></tr><tr><td>Telomerase Substrate (TS) Primer</td><td>Integrated DNA Technology (IDT)</td><td>Custom Primer (HPLC Purified)</td><td>5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'ACX</td></tr> <tr><td>(Revers) Primer</td><td>Integrated DNA Technology (IDT)</td><td>Custom Primer (HPLC Purified)</td><td>5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3'</td></tr><tr><td>薄肉(250 ul)PCRグレードのチューブ</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2900</td><td>ストリップ、プレート、チューブなど</td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>Bio Rad</td><td>1864034</td><td></td></tr><tr><td>Twin-Tec 96 Well Plate</td><td>Fisher</td><td>Eppendorf 951020362</td><td></td></tr><tr><td>Piercable ホイルヒートシール</td><td>Bio Rad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>液滴発生器カートリッジ (DG8)</td><td>Bio Rad</td><td>1863008</td><td></td></tr><tr><td>液滴発生器オイル</td><td>Bio Rad</td><td>1863005</td><td></td></tr><tr><td>液滴発生器ガスケット</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェル サーモサイクラー T100</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>PX1 PCR プレートシーラー</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1814000</td><td></td></tr><tr><td>QX200 ドロップレットリーダーおよびクアンタソフトソフトウェア</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1864001 および 1864003</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR ドロップレットリーダー オイル</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1863004</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー フィルター付きピペットチップ</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td></td><td>10 ul、20 ul 、200 ul、1000 ul</td></tr></tbody></table>

液滴デジタルトラップ (ddtrap): 液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応へのテロメア反復増幅プロトコルの適応

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

テロメア反復増幅プロトコル (TRAP) は、所与のサンプル内のテロメラーゼ活性を検出するために最も広く使用されているアッセイです。ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 法は、ほとんどの細胞溶解物からの酵素活性のロバストな測定を可能にします。蛍光標識されたプライマーを用いたゲルベースのトラップはサンプルのスループットを制限し、サンプルの差を検出する能力は酵素活性の2倍以上の変化に制限される。液滴のデジタルトラップ、ddTRAP は従来のトラップの試金から変更された非常に敏感なアプローチであり、ユーザーが実行ごとの96サンプルの強い分析を行い、DNA の絶対定量化を得ることを可能にする (テロメラーゼの延長プロダクト) は、各 PCR 内で入力します。従って、新しく開発された ddTRAP の試金は従来のゲルベースのトラップの試金の限界を克服し、実験室および臨床設定内のテロメラーゼの活動を測定するためにより有効で、正確な、量的なアプローチを提供する。

DdTRAP を用いて、テロメラーゼの活性を、以下の細胞株からなる細胞パネルで測定した (図 1): nonsmall 細胞肺癌 (H2882、H1299、Calu6、H920、A549、および H2887)、小細胞肺癌 (H82 および SHP77)、およびテロメラーゼ陰性線維芽細胞 (BJ)。100万細胞ペレットを NP −40バッファーで溶解し、テロメラーゼ伸長反応を生物学的 triplicates で行った。一般的で強く推奨されるネガティブコントロールは「NTC」であり、テンプレートなしのコントロールです。このサンプルは、テロメラーゼ伸長反応に NP-40 溶解バッファー (2 μ l) を添加し、実際の細胞溶解物を含む他のサンプルと同一の方法で伸長産物を進行させることによって生成されます。このサンプルでは、ユーザーは、テロメラーゼの活動をより良く定量化するために、もしあれば、バックグラウンドシグナルを減算することができます。なお、この図には示されていないが、別の陰性対照としてテロメラーゼ伸長反応の前に5...

我々は正常に液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応に採用される標準的なテロメア反復増幅プロトコル (TRAP) アッセイを変換しました。DdTRAP と呼ばれるこの新しいアッセイは、より高感度で定量的であり、様々なヒト細胞内のテロメラーゼ活性のより良い検出および統計分析を可能にします。

液滴デジタルトラップ (ddTRAP): 液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応へのテロメア反復増幅プロトコルの適応

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

ddTRAPアッセイは、細胞内のテロメラーゼ酵素活性の高感度、堅牢、高定量的測定を得る能力を提供します。中スループット方式で 1 回あたり最大 96 サンプルを実行できることで、大きな利点があります。収集されたデータに対して適切な統計分析を行うコントロールと複製を実行できます。細胞をライシングする直前に、NP-40リシスバッファーの凍結アリコートを解凍する。解凍したら、氷の上にリシスバッファーを置きます。PMSFプロテアーゼ阻害剤をNP-40リシスバッファーに加え、0.2ミリモルの最終濃度に到達します。次いで、細胞ペレットを含むチューブに40マイクロリットルのライシスバッファーを加え、1マイクロリットル当たり25,000細胞の細胞同等値に達する。細胞を開くために、ライセートを上下に軽くピペットします。泡を作らないようにしてください。細胞を氷の上で30分間氷上でライスします。細胞デブリのクラスターが形成されるのを防ぐために、10分ごとにlysateを穏やかに渦を起させます。細胞のリシスの間に、テロメラーゼ伸長反応のためのマイクロ遠心分離管でマスターミックスを準備し、氷の上に保存する。細胞のリシスの後、延長マスターのピペット48マイクロリットルが各PCRチューブに混合する。各PCRチューブに希釈したライセートを2マイクロリットル加え、1マイクロリットル当たり50細胞の最終的な細胞同等性に達し、原稿に従ってテロメラーゼ伸展反応を継続する。ddTRAP用のマイクロ遠心分離管でマスターミックスを準備し、室温に保ちます。ピペット19.8マイクロリットルのddPCRマスターは、各PCRチューブに混合します。各チューブに2.2マイクロリットルの伸張反応液を加える、 22マイクロリットルの総容積を残す。液滴生成カートリッジをセットアップするには、まず準備した溶液の20マイクロリットルをカートリッジの中のサンプルウェルに積み込みます。カートリッジの側面を軽くタップして、泡を溶液の上部に移動します。カートリッジのすべてのウェルは、オイルをロードする前にサンプルを積み込む必要があります。その後、70マイクロリットルの液滴発生油を左油によく積み込む。ガスケットをカートリッジの端にテザリングして所定の位置に固定し、装填および組み立てられたカートリッジを液滴発生器に挿入します。発電機はカートリッジが正しく置かけられていることを知らせる固体緑色のライトを示す。60~90秒後、発電機のライトが点滅を止めると、サイクルが完了します。カートリッジを取り外します。カートリッジからガスケットをそっと取り出します。マルチチャンネルピペットを使用して、新たに生成された液滴を右から96ウェルPCRプレートに約40マイクロリットルのピペットで送ります。すべてのサンプルを96ウェルプレートにロードすると、蒸発を防ぐために、アルミニウム箔PCRプレートシールでプレートを熱シールします。次に、96ウェルプレートをサーモサイクラーにロードして、PCR反応を行います。まず、96ウェルプレートを液滴リーダーにロードします。A1サンプルがホルダーのサンプルと一致するようにプレートを正しく向けます。ドロップレットリーダーに関連付けられているソフトウェアを開きます。最初のウェル A01 をダブルクリックして、サンプルウェルエディター画面を開きます。[実験]をクリックし、ドロップダウン メニューから使用するアッセイの種類を選択します。正しい検出方法として QX200 ddPCR エヴァグリーン スーパーミックスを選択します。ウェルエディタ画面の右下にある[適用]をクリックして、ハイライト表示されたすべてのウェルにユーザ定義設定を保存します。次に、ウェルエディタ画面で[ターゲット]をクリックし、[ターゲット]ドロップダウンメニューをクリックして、不明、参照、またはテンプレートなしのいずれかのコントロールを選択してサンプルの種類を定義します。[サンプル名]セクションで、すべてのサンプルにラベルを付け、[適用]をクリックします。[実行] をクリックしてプレートを読み上げました。プレートの読み取り方向を知らせるプロンプトが表示されたら、[実行オプション]画面で[列]または[行]を選択します。個々のウェルまたは列と行のヘッダーをダブルクリックして、情報のテーブルを提供することで、各サンプルの許容される液滴の数を決定します。ddTRAP の場合、10,000 個以上の液滴を含むサンプルは、さらなる分析に有効です。サンプル複製と NTC サンプルを表すウェルを強調表示します。画面左下のしきい値を設定するためのアイコンをクリックして、サンプルのしきい値を手動で設定します。このプロトコルでは、テロメラーゼ活性は、肺癌およびテロメラーゼ陰性線維芽細胞の9つの細胞株からなる細胞パネルで測定した。SHP77、H2887、およびNTCの3つの生物学的複製すべてに対して、約2,000の蛍光振幅に閾値を設定しました。陽性液滴は、6,000の蛍光振幅の周りに蛍光強度を有し、上部に明確な集団を形成し、1,100の蛍光振幅の周りの負の液滴から分離した。全てのサンプル間の細胞当たりの全テロメラーゼ伸展産物は、肺癌株におけるテロメラーゼ活性を表す核酸の測定濃度から推定した。リソヌクレオ蛋白質複合体であるため、リシスまたは拡張反応ステップ中のRNase汚染は、テロメラーゼ酵素活性を破壊します。ddTRAPは、細胞内のhTERT mRNA発現レベルに対するddPCRをフォローアップすることができる。2つのデータセットにより、hTERTの発現をテロメラーゼ活性と相関させ、代替スプライシングなどの潜在的なテロメラーゼ調節機構を深く掘り下げることが可能になります。特定のスプライシング因子の操作とテロメラーゼ活性への影響を調べることができます。現在、テロメラーゼ活性を標的とする潜在的な薬剤としてオリゴヌクレオチドスプライシングモジュレーターを設計しています。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

このビデオでは、デジタルポリメラーゼ連鎖反応またはdPCRによって標的核酸を検出するための乳化ナノ液滴を生成する手順を段階的に紹介します。...

Droplet Digital Polymerase Chain Reaction:希少腫瘍変異検出のためのナノDroplet PCR反応作製法

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標的遺伝子のインデル変異検出のためのデジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応

このビデオでは、デュプレックスデジタルPCR(ddPCR)技術を示しています。これは、従来のPCR技術の修正版で、2つの異なる遺伝子マーカーを同時に検出するのに役立ちます。1つのPCR反応をナノリットルサイズの乳化液滴に分割し、それぞれに増幅し、液滴画分から異なる色の蛍光増幅シグナルを検出することで、標的配列の初期濃度を算出します。...

デュプレックスデジタルPCRによるデュアル遺伝マーカーの同時定量

この作品は、マイクロ流体の液滴ベース プラットフォームの作製とポリアクリルアミド微粒子微粒子に PCR の拡大のためのアプリケーションのメソッドを提供します。微粒子 PCR 法は、DNA 二重鎖を分離することがなく単一座礁させた DNA...

マイクロ液滴手法と一本鎖 DNA 産物の微粒子に PCR 増幅

ここでは、ドロップオフ ddPCR と加水分解プローブの一意のペアを使用して単一の反作用で対象地域の複数の遺伝子の変異を正確に定量化するためのプロトコルを提案する.

ホット スポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタル ポリメラーゼの連鎖反応

ここでは、患者の生体液(生体流体)に存在する循環DNAにおける腫瘍体細胞変異を検出するプロトコルを提示する。当社の液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応(dPCR)ベースの方法は、腫瘍変異アレーリン周波数(MAF)の定量化を可能にし、腫瘍応答の診断および時間的モニタリングに最小限に侵襲的な補体を促進する。...

患者の生体流体における腫瘍関連循環DNAの検出とモニタリング

エピジェネティックマーカーは、DNAメチル化パターンの定量化を通じて白血球(WBC)のサブタイピングに使用されます。このプロトコルは、熱可塑性エラストマー(TPE)ベースのマイクロ流体デバイスを使用した多重液滴ポリメラーゼ連鎖反応(mdPCR)法を提示し、WBC差動度数の正確かつ多重化メチル化特異的ターゲット定量を可能にする液滴生成を行う。...

ポリマードロップレット生成装置によるメチル化特異的多重ドロップレットPCR

油中水滴アッセイは、分析化学、酵素進化、単一細胞分析に有用であるが、通常は液滴を形成するためにマイクロ流体が必要である。ここでは、液滴アッセイを行うマイクロ流体フリーアプローチである粒子鋳型乳化について述べている。...

粒子テンプレート化乳化により、マイクロ流体フリーのドロップレットアッセイが可能

この作業では、2色ddPCRシステムを使用したSARS-CoV-2検出のためのさまざまなアッセイを開発する手順を要約しています。手順は精巧であり、アッセイと実験のパフォーマンスを改善する方法に関するメモが含まれています。これらのアッセイは、複数のSARS-CoV-2...

SARS-CoV-2の検出と定量のための2段階逆転写液滴デジタルPCRプロトコル

ここでは、遺伝子治療ベクターの臨床開発を支援するために、液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応によるヒト涙液中のアデノ随伴ウイルスベクターのコンプライアント検出における優れた実験室慣行の開発と検証のためのプロトコルを提示します。...

涙液のバイオシェディング研究におけるアデノ随伴ウイルスベクターの検出のための検証可能な液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応アッセイ

本研究は、多孔質膜挿入を用いて軸索mRNAを単離する堅牢な方法を提示し、全ニューロンと神経突起の分離およびRNA精製を可能にします。RTddPCRと組み合わせることで、低コピー転写体の絶対定量が可能となり、mRNA輸送および局所翻訳の研究を高感度、再現性、そして広範な実験応用で可能にします。...

多孔質膜挿入およびRTddPCRを用いた軸索mRNAの単離および定量

学ぶ液滴デジタルPCRを用いたテロメラーゼ活性測定法ddTRAP。NP-40溶解バッファーとPMSFプロテアーゼ阻害剤を使用し、96サンプル同時処理が可能。高感度かつ定量的な解析により、細胞老化とがん研究の統計的信頼性を向上させる。

液滴デジタルトラップ (ddTRAP): 液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応へのテロメア反復増幅プロトコルの適応

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