液滴デジタルトラップ (ddTRAP): 液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応へのテロメア反復増幅プロトコルの適応
May 3rd, 2019
我々は正常に液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応に採用される標準的なテロメア反復増幅プロトコル (TRAP) アッセイを変換しました。DdTRAP と呼ばれるこの新しいアッセイは、より高感度で定量的であり、様々なヒト細胞内のテロメラーゼ活性のより良い検出および統計分析を可能にします。
ddTRAPアッセイは、細胞内のテロメラーゼ酵素活性の高感度、堅牢、高定量的測定を得る能力を提供します。中スループット方式で 1 回あたり最大 96 サンプルを実行できることで、大きな利点があります。収集されたデータに対して適切な統計分析を行うコントロールと複製を実行できます。
細胞をライシングする直前に、NP-40リシスバッファーの凍結アリコートを解凍する。解凍したら、氷の上にリシスバッファーを置きます。PMSFプロテアーゼ阻害剤をNP-40リシスバッファーに加え、0.2ミリモルの最終濃度に到達します。
次いで、細胞ペレットを含むチューブに40マイクロリットルのライシスバッファーを加え、1マイクロリットル当たり25,000細胞の細胞同等値に達する。細胞を開くために、ライセートを上下に軽くピペットします。泡を作らないようにしてください。
細胞を氷の上で30分間氷上でライスします。細胞デブリのクラスターが形成されるのを防ぐために、10分ごとにlysateを穏やかに渦を起させます。細胞のリシスの間に、テロメラーゼ伸長反応のためのマイクロ遠心分離管でマスターミックスを準備し、氷の上に保存する。
細胞のリシスの後、延長マスターのピペット48マイクロリットルが各PCRチューブに混合する。各PCRチューブに希釈したライセートを2マイクロリットル加え、1マイクロリットル当たり50細胞の最終的な細胞同等性に達し、原稿に従ってテロメラーゼ伸展反応を継続する。ddTRAP用のマイクロ遠心分離管でマスターミックスを準備し、室温に保ちます。
ピペット19.8マイクロリットルのddPCRマスターは、各PCRチューブに混合します。各チューブに2.2マイクロリットルの伸張反応液を加える、 22マイクロリットルの総容積を残す。液滴生成カートリッジをセットアップするには、まず準備した溶液の20マイクロリットルをカートリッジの中のサンプルウェルに積み込みます。
カートリッジの側面を軽くタップして、泡を溶液の上部に移動します。カートリッジのすべてのウェルは、オイルをロードする前にサンプルを積み込む必要があります。その後、70マイクロリットルの液滴発生油を左油によく積み込む。
ガスケットをカートリッジの端にテザリングして所定の位置に固定し、装填および組み立てられたカートリッジを液滴発生器に挿入します。発電機はカートリッジが正しく置かけられていることを知らせる固体緑色のライトを示す。60~90秒後、発電機のライトが点滅を止めると、サイクルが完了します。
カートリッジを取り外します。カートリッジからガスケットをそっと取り出します。マルチチャンネルピペットを使用して、新たに生成された液滴を右から96ウェルPCRプレートに約40マイクロリットルのピペットで送ります。
すべてのサンプルを96ウェルプレートにロードすると、蒸発を防ぐために、アルミニウム箔PCRプレートシールでプレートを熱シールします。次に、96ウェルプレートをサーモサイクラーにロードして、PCR反応を行います。まず、96ウェルプレートを液滴リーダーにロードします。
A1サンプルがホルダーのサンプルと一致するようにプレートを正しく向けます。ドロップレットリーダーに関連付けられているソフトウェアを開きます。最初のウェル A01 をダブルクリックして、サンプルウェルエディター画面を開きます。
[実験]をクリックし、ドロップダウン メニューから使用するアッセイの種類を選択します。正しい検出方法として QX200 ddPCR エヴァグリーン スーパーミックスを選択します。ウェルエディタ画面の右下にある[適用]をクリックして、ハイライト表示されたすべてのウェルにユーザ定義設定を保存します。
次に、ウェルエディタ画面で[ターゲット]をクリックし、[ターゲット]ドロップダウンメニューをクリックして、不明、参照、またはテンプレートなしのいずれかのコントロールを選択してサンプルの種類を定義します。[サンプル名]セクションで、すべてのサンプルにラベルを付け、[適用]をクリックします。[実行] をクリックしてプレートを読み上げました。
プレートの読み取り方向を知らせるプロンプトが表示されたら、[実行オプション]画面で[列]または[行]を選択します。個々のウェルまたは列と行のヘッダーをダブルクリックして、情報のテーブルを提供することで、各サンプルの許容される液滴の数を決定します。ddTRAP の場合、10,000 個以上の液滴を含むサンプルは、さらなる分析に有効です。
サンプル複製と NTC サンプルを表すウェルを強調表示します。画面左下のしきい値を設定するためのアイコンをクリックして、サンプルのしきい値を手動で設定します。このプロトコルでは、テロメラーゼ活性は、肺癌およびテロメラーゼ陰性線維芽細胞の9つの細胞株からなる細胞パネルで測定した。
SHP77、H2887、およびNTCの3つの生物学的複製すべてに対して、約2,000の蛍光振幅に閾値を設定しました。陽性液滴は、6,000の蛍光振幅の周りに蛍光強度を有し、上部に明確な集団を形成し、1,100の蛍光振幅の周りの負の液滴から分離した。全てのサンプル間の細胞当たりの全テロメラーゼ伸展産物は、肺癌株におけるテロメラーゼ活性を表す核酸の測定濃度から推定した。
リソヌクレオ蛋白質複合体であるため、リシスまたは拡張反応ステップ中のRNase汚染は、テロメラーゼ酵素活性を破壊します。ddTRAPは、細胞内のhTERT mRNA発現レベルに対するddPCRをフォローアップすることができる。2つのデータセットにより、hTERTの発現をテロメラーゼ活性と相関させ、代替スプライシングなどの潜在的なテロメラーゼ調節機構を深く掘り下げることが可能になります。
特定のスプライシング因子の操作とテロメラーゼ活性への影響を調べることができます。現在、テロメラーゼ活性を標的とする潜在的な薬剤としてオリゴヌクレオチドスプライシングモジュレーターを設計しています。
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概要
ddTRAPアッセイは、テロメラーゼ活性の測定に対する新規アプローチで、感度と定量化能力が向上しています。この方法により、様々なヒト細胞におけるテロメラーゼ活性の分析が可能となり、データのより良い統計評価が可能になります。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 分子生物学
背景
- テロメラーゼ活性は、細胞の老化とがんの理解に重要です。
- 従来のTRAPアッセイには感度と定量化の限界があります。
- ドロップレットデジタルPCR技術はアッセイの性能を向上させます。
- 改良された統計分析により、テロメラーゼ機能のより良い洞察が得られます。
研究の目的
- テロメラーゼ活性のためのより感度が高く定量化可能なアッセイを開発すること。
- 複数のサンプルを同時に分析できるようにすること。
- テロメラーゼ研究における統計評価の信頼性を向上させること。
使用された方法
- 標準的なTRAPアッセイをddPCRフォーマットに変換すること。
- 細胞の溶解にNP-40溶解緩衝液を使用すること。
- サンプル調製にPMSFプロテアーゼ阻害剤を組み込むこと。
- 1回の実行で最大96サンプルを処理できる中規模スループット機能。
主な結果
- ddTRAPアッセイは著しく向上した感度を実証しました。
- テロメラーゼ活性の定量測定が可能になりました。
- 適切な対照と複製を通じて、テロメラーゼ活性の統計分析が向上しました。
- この方法により、複数のサンプルにわたる堅牢なデータ収集が可能になりました。
結論
- ddTRAPアッセイはテロメラーゼ研究の貴重なツールです。
- 従来の方法と比較して、感度と定量分析が向上しています。
- この進歩により、様々な生物学的文脈におけるテロメラーゼの理解が促進される可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
The ddTRAP assay enables highly quantitative, sensitive measurement of telomerase activity, addressing a key bottleneck in early oncology target validation and mechanistic de-risking. Its medium-throughput format and absolute quantification support robust statistical analysis, facilitating confident go/no-go decisions in discovery and translational research. This capability enhances portfolio prioritization by providing reliable, reproducible data on telomerase modulation across diverse cell models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous interrogation of telomerase as a therapeutic target through quantitative enzyme activity measurement.
- Supports mechanistic de-risking by correlating telomerase activity with hTERT mRNA expression and splicing events.
- Facilitates robust statistical validation with controls and replicates, increasing predictive confidence in target engagement.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, quantitative telomerase activity assays for downstream compound screening workflows.
- Delivers standardized, reproducible outputs suitable for medium-throughput evaluation of modulators or genetic perturbations.
- Enables reliable comparison of compound effects across multiple cell lines and experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns telomerase activity measurements with disease-relevant models, supporting translational biomarker strategies.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling direct quantification of functional target modulation.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by integrating quantitative activity data with molecular expression profiles.
Pipeline & Workflow Integration
The ddTRAP assay fits at the intersection of early discovery, lead identification, and translational research, providing a bridge from mechanistic studies to preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying telomerase activity in manipulated systems.
- Screening: Offers assay readiness and reproducibility for evaluating candidate modulators in a 96-well format.
- Analytics: Delivers absolute quantification and robust statistical outputs for cross-condition comparisons.
- Translational Research: Enables alignment of functional activity with disease models and biomarker development.
- Enterprise Reuse: Provides a scalable, standardized platform for telomerase activity measurement across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in telomerase-targeted programs.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput for enzyme activity assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust statistical analysis.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of telomerase-related assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in droplet digital PCR and quantitative assay design.
- Needs access to droplet generation, thermocycling, and droplet reading instrumentation.
- Demands rigorous cross-team standardization of sample preparation and data analysis workflows.
- Must be adapted for different cell types and experimental contexts as supported by the protocol.
- Is sensitive to RNase contamination, which can compromise telomerase activity measurements.
