Name: 巨小胞内部の単細胞レベルにおける細菌細胞培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: 学ぶ 巨小胞内での単細胞レベル細菌培養法。液滴転移法で作製したGVに大腸菌を封入し、支持膜上で固定して蛍光顕微鏡で増殖を直接観察します。未知環境細菌の代謝産物解析に応用可能です。

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この研究は、文部科学省の優秀若手研究者のためのリーディング・イニシアティブ(第16812285号)、若手科学者研究助成金(No.18K18157,16K21034)の支援を受けました。日本学術振興会(JSPS)からM.M.、文部科学省から株式会社への助成金(第17H06417号、17H06413)。

1. 液滴転写法による細菌細胞を含むGVの調製
<ol><li>1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC、 10 mM、1 mL)および1,2-ジステアロイル-snグリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[ビオチニル(ポリエチルネグリコール)-2000](ビオチン-PEG-DSPE、0.1mM、1mL)メタノール溶液(2/1、v/v)を保存し、-20°Cで在庫を保存します。</li>
	<li>脂質含有油溶液の調製
	<ol>
<li>POPC溶液の20μLとビオチン-PEG-DSPE溶液の4μLをガラス管に注ぎます(図1b(i)))。</li>
		<li>空気の流れによって有機溶媒を蒸発させ、脂質フィルムを形成し、フィルムを1時間のデシケータに入れ、有機溶媒を完全に蒸発させる(図1b(ii)))。 注:ヒュームフード内の有機溶媒を蒸発させる必要があります。</li>
		<li>ガラスバイアルに200μLの鉱物油(0.84g/mL、材料の表)をガラスバイアルに加えます(図1b(iii)))。</li>
		<li>ガラスバイアルの開口部をフィルムで包み、超音波浴(120W)で少なくとも1時間(図1b(iii))で超音波処理します。POPCおよびビオチン-PEG-DSPEの最終的な濃度はそれぞれ1 mMおよび0.002 mMである。</li>
	</ol></li>
	<li>細菌細胞の前培養
	<ol>
<li>大腸菌を1x LB培地(酵母エキス1g、バクテリアトリプトン2g、脱イオン水200mLの塩化ナトリウム2g)に接種し、37°C(一晩)でインキュベートします。</li>
		<li>インキュベーション後、培養液の20μLを回収し、新鮮な1xLB培地の1.98mLに移し、細胞を2時間再培養した。</li>
		<li>プレカルチャ溶液の600nm(OD600)値(ステップ1.3.2で調製)で光学密度を確認してください。OD600 = 1.0-1.5 のプレカルチャ ソリューションを使用する必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>GVの外側および内側水溶液の調製
	<ol>
<li>グルコースを1x LB培地に溶解させ、GVの外水溶液を調出し、ストックグルコース溶液(500mM)の20mLを調出す。</li>
		<li>1x LB培地でストックグルコース溶液を200mMに希釈する(表1)。</li>
		<li>1x LB培地にスクロースを溶解し、GVの内部水溶液を調出し、ストックショ糖溶液(500mM)の20mLを調剤する。</li>
		<li>プレカルチャ溶液(OD600 = 1.0~1.5)、スクロース溶液(500mM)、および1x LB培地(表1)を混合します。培養液の最終的なOD600値は0.01~0.015で、最終的なスクロース濃度は200mMでなければなりません。 注:浸透圧を避けるように注意してください。内側と外側の水溶液との濃度のバランスをとる必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>細菌細胞を含む水中油(W/O)液滴の調製
	<ol>
<li>脂質を含む油液(POPCとビオチン-PEG-DSPEを含む鉱物油)を0.6mLの蓋付きプラスチックチューブ(図1b(iv))にGVの内部水溶液の2μLを50μLに加えます。</li>
		<li>チューブを手でタップしてプラスチックチューブ内の2つの成分を乳化します(図1b(v)))。</li>
	</ol></li>
	<li>細菌細胞を含むGVの形成
	<ol>
<li>GVの外側水溶液の50μL(ステップ1.4.2で調製)を1.5mLの蓋付きプラスチックチューブ(図1b(vi)))に加え、脂質を含む油溶液(POPCとビオチン-PEG-DSPEを含むオイル溶液の150 μL)を外側の表面に穏やかに層状に加えます。溶液(図1b(vii)))このサンプルを室温(RT、25°C)で10~15分間インキュベートし、油と水溶液の界面が平らであることを確認してください。</li>
		<li>ピペットを使用して油と水溶液の界面にW/O液液(ステップ1.5.2で調製)の50 μLを追加します(図1b(viii)))。</li>
		<li>デスクトップ遠心分離機のRTで1,600 x gで10分間1.5mLの蓋付きプラスチックチューブ(ステップ1.6.2から)を遠心分離します(図1b(ix))。遠心分離後、ピペットを使用して1.5mL蓋付きプラスチックチューブから油(上層)を吸引し、細菌細胞を含むGVを集めます(図1b(x)))。</li>
	</ol></li>
</ol>2. GV観察システムの調製(細菌細胞培養システム)
<ol><li>
コンストラクティのための小胞(SV)の調製ng aサポートされる二層膜
	<ol>
<li>POPC溶液の20μLとビオチン-PEG-DSPE溶液の4μLをガラス管に注ぎます(ステップ1.1でGV調製に使用したのと同じ脂質組成物を使用)。</li>
		<li>空気の流れで有機溶媒を蒸発させ、脂質膜を形成し、このサンプルを1時間のデシケータに入れ、有機溶媒を完全に蒸発させます。</li>
		<li>ガラスバイアルに1x LB培地(GVの外水溶液)に200mMのブドウ糖の200 μLを加えます。</li>
		<li>ガラスバイアルの開口部をフィルムで包み、超音波浴(120W)で少なくとも1時間超音波で超音波処理します。</li>
		<li>押出方法21によりSVを100nmの細孔サイズのミニ押出機及びポリカーボネート膜を用いて調製する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
手作りの部屋の準備
	<ol>
<li>両面シール(10 mm x 10 mm x 1 mm)に中空のパンチで 7 mm の穴を開けます。</li>
		<li>両面シールをカバーガラス(30 mm x 40 mm、厚さ 0.25~0.35 mm)に貼り付けます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
チャンバの穴のカバーガラス上の支持された二層膜の調製
	<ol>
<li>チャンバーの穴(セクション2.2で調製)にSV溶液の30 μLを追加し、RTで30分間インキュベートします。</li>
		<li>ピペッティングにより200mMのブドウ糖(GVの外水溶液)を含む1x LB培地の20μLで2回静かに洗浄します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
上のGVの固定化チャンバーの穴のカバーガラスに支えられた二層膜
	<ol>
<li>GV(1mg/mL)の外側水溶液を入れた10μLのニュートラビジンを穴に入れ、RTで15分間インキュベートします。</li>
		<li>ピペッティングにより200mMのブドウ糖(GVの外水溶液)を含む1x LB培地の20μLで2回静かに洗浄します。</li>
		<li>GVを含むすべての溶液(ステップ1.6.3で調製)をチャンバーの穴に入れ、カバーガラス(18mm x 18 mm、厚さ0.13~0.17mm)でシールします(図2b)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
GV内部の細菌細胞増殖の顕微鏡観察
	<ol>
<li>40x/0.6の数値開口(NA)対物レンズを搭載した反転顕微鏡で顕微鏡加熱ステージシステムを設定します(図2b)。</li>
		<li>顕微鏡加熱ステージシステム(図2b)にチャンバーを置きます。37°Cで6時間の静電気状態でチャンバ内の細菌細胞を含むGVをインキュベートします。</li>
		<li>科学的な相補的な金属酸化物半導体(sCMOS)カメラを使用して、GV内部の細菌細胞増殖の顕微鏡画像を30分ごとにキャプチャし、記録します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Kurtser, I., Grossman, A. D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+noise+in+the+expression+of+a+single+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of noise in the expression of a single gene.</a> Nature Genetics. 31, 69-73 (2002).</li>
<li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulation+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307, 1962-1965 (2005).</li>
<li>Eldar, A., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+for+noise+in+genetic+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional roles for noise in genetic circuits.</a> Nature. 467, 167-173 (2010).</li>
<li>Hashimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-driven+growth+rate+gain+in+clonal+cellular+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).</li>
<li>Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+confinement+of+single+cells+of+bacteria+in+small+volumes+initiates+high-density+behavior+of+quorum+sensing+and+growth+and+reveals+its+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).</li>
<li>Christopher, M., Waters, B. L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+sensing%3A+cell-to-cell+communication+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).</li>
<li>Inoue, I., Wakamoto, Y., Moriguchi, H., Okano, K., Yasuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+culture+system+for+observation+of+isolated+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">On-chip culture system for observation of isolated individual cells.</a> Lab on a Chip. 1, 50-55 (2001).</li>
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<li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).</li>
<li>Tan, Y. C., Hettiarachchi, K., Siu, M., Pan, Y. R., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+microfluidic+encapsulation+of+cells%2C+proteins%2C+and+microbeads+in+lipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Controlled microfluidic encapsulation of cells, proteins, and microbeads in lipid vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (17), 5656-5658 (2006).</li>
<li>Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+Living+Cells+within+Giant+Phospholipid+Liposomes+Formed+by+the+Inverse-Emulsion+Technique%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique.</a> ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).</li>
<li>Morita, M., Katoh, K., Noda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+bacterial+growth+in+giant+unilamellar+vesicles%3A+a+novel+tool+for+bacterial+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22ChemistryOpen%22%5BJournal%5D)">Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures.</a> ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).</li>
<li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Unilamellar+Vesicles+Using+an+Inverted+Emulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li>
<li>Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+large+unilamellar+vesicles+by+a+rapid+extrusion+procedure.+Characterization+of+size+distribution%2C+trapped+volume+and+ability+to+maintain+a+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).</li>
<li>Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+formation+of+giant+liposomes+through+the+gentle+hydration+of+phosphatidylcholine+films+doped+with+sugar%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68, 98-105 (2009).</li>
<li>Li, A., Pazzi, J., Xu, M., Subramaniam, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulose+abetted+assembly+and+temporally+decoupled+loading+of+cargo+into+vesicles+synthesized+from+functionally+diverse+lamellar+phase+forming+amphiphiles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Cellulose abetted assembly and temporally decoupled loading of cargo into vesicles synthesized from functionally diverse lamellar phase forming amphiphiles.</a> Biomacromolecules. 19, 849-859 (2018).</li>
<li>Weinberger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel-assisted+formation+of+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles.</a> Biophysical Journal. 105, 154-164 (2013).</li>
<li>Kurokawa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+cytoskeleton+for+stabilizing+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).</li>
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<li>Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalizing+cell-mimetic+giant+vesicles+with+encapsulated+bacterial+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors.</a> Interface Focus. 8, 20180024(2018).</li>
<li>Elani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+vesicle-based+artificial+cells+with+embedded+living+cells+as+organelle-like+modules%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Constructing vesicle-based artificial cells with embedded living cells as organelle-like modules.</a> Scientific Reports. 8, 4564(2018).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

ここでは、GV内部の単細胞レベルで細菌細胞を培養する方法について述べている。この簡易方法は、液滴転写法を用いて単細胞レベルで細菌細胞を含むGVを形成することを含む。細菌細胞を含むGVを得るための他のアプローチと比較して、この方法には2つの利点があります:(i)開発が容易であり、(ii)GVを調作するためにサンプル溶液の少量(2μL)が必要である。細菌細胞を含むGVを用いた液滴転写方法20は、古典的な水和22およびマイクロ流体法17よりも単純である。例えば、古典的な水和方法22は、GVを調製するための簡単で簡単な方法であるが、GVへの材料の封入効率は非常に低く、サンプルの少なくとも数百マイクロリットルが必要である。最近開発されたセルロース紙アベド水和23およびゲル支援水和24法は、古典的な水和法22と比較して...

単細胞レベルでの細菌細胞の培養が注目を集めています。限られた空間内の単細胞レベルで細菌細胞を培養すると、表現型変動性1、2、3、4、細胞挙動5などの細菌機能を解明できる。6,7,8,9、および抗生物質耐性10、11。近年の培養技術の進歩により、単一細菌の培養は、ウェルチップ4、7、8、ゲル液滴12、13などの限られた空間内で達成することができる。、および水中油(W/O)液滴5、11.単一細菌細胞の理解や利用を促進するためには、栽培技術のさらなる技術開発が必要である。
生体細胞膜を模倣する小胞は、両生類分子からなる球状の区画であり、様々な物質を保持することができる。小胞はサイズに応じて分類され、小さな小胞(SV、直径<100 nm)、大きな小胞(NEV、<1 μm)、および巨大な小胞(GV、>1 μm)が含まれます。SVまたはNEVは、生体細胞膜14に対する親和性のために薬物担体として一般的に使用される。GVは、原始電池15または人工細胞16の構築のための原子炉システムとしても使用されている。生体細胞をGVに封入すると17、18、したがってGVは、反応器系と組み合わせると細胞培養システムとしての可能性を示す。
ここでは、実験手順のビデオと共に、GVを新規細胞培養器19として使用する方法について説明する。細菌を含むGVは、液滴転写方法20により作製され、次いでカバーガラス上の支持膜上に固定化した。このシステムを用いて、GV内部の単細胞レベルで細菌の増殖をリアルタイムで観察した。

<table><tbody><tr><td>バクトトリプトン</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>和光 純薬品</td><td>032-21921</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス (18 回; 18 mm)</td><td>松波ガラス Ind.</td><td>C018181</td><td>厚さ0.13&ndash;0.17 mm</td></tr><tr><td>カバーガラス (30 &times; 40 mm)</td><td>松波硝子工業</td><td>カスタムオーダー</td><td>の厚さ0.25&ndash;0.35 mm</td></tr><tr><td>卓上遠心分離機</td><td>Hi-Tech Co.</td><td>ATT101</td><td>スイングローター式</td></tr><tr><td>両面シール (10回 10</td>回 10回 1mm) <td>ニトムス</td><td>T4613</td><td></td></tr><tr><td>ガラスガラスバイアル</td><td>AS ONE</td><td>6-306-01</td><td>ダーラム発酵管</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>和光純薬</td><td>049-31165</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>IX-73</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>和光純薬</td><td>133-16771</td><td></td></tr><tr><td>微細加熱ステージシステム</td><td>東海ヒット</td><td>TP-110R-100</td><td></td></tr><tr><td>鉱物油</td><td>ナカライテスク</td><td>23334-85</td><td></td></tr><tr><td>ミニ押出機</td><td>アバンティ 極性脂質</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>ニュートラビジン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>対物レンズ</td><td>オリンパス</td><td>LUCPLFLN 40回;/0.6 NA</td><td></td></tr><tr><td>ポリカーボネート膜</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610005</td><td>孔径 100nm</td></tr><tr><td>sCMOSカメラ</td><td>Andor</td><td>Zyla 4.2 plus</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>和光純薬</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>和光純薬</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>超音波浴</td><td>AS ONE</td><td>ASU-3D</td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出物</td><td>BD Biosciences</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>0.6 mL フタ付きプラスチックチューブ</td><td>ワトソン</td><td>130-806C</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL フタ付きプラスチックチューブ</td><td>住友ベークライト</td><td>MS4265-M</td><td></td></tr><tr><td>1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン</td><td>アバンティ極性脂質</td><td>850457P</td><td>POPC</td></tr><tr><td>1,2-ジステアロイル-スニセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[ビオチニル(ポリエチレングリコール)-2000]</td><td>アバンティ極性脂質</td><td>880129P</td><td>ビオチン-PEG-DSPE</td></tr></tbody></table>

巨小胞内部の単細胞レベルにおける細菌細胞培養

Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles

我々は、巨大小胞(GV)内の単細胞レベルで細菌細胞を培養する方法を開発した。細菌細胞培養は、自然環境における細菌細胞の機能を理解するために重要である。技術の進歩により、限られた空間内の単細胞レベルで様々な細菌細胞機能が明らかになります。GVは、親和性脂質分子からなる球状の微小サイズのコンパートメントで、細胞を含む様々な材料を保持することができます。本研究では、液滴転写法により10~30μm GVに単一の細菌細胞を封入し、細菌細胞を含むGVをガラス基板上の支持膜上に固定化した。本手法は、GV内の単一細菌のリアルタイム増殖を観察するのに有用である。大腸菌(大腸菌)細胞をGV内のモデルとして培養したが、この方法は他の細胞型に適応できる。微生物学、生物学、バイオテクノロジー、合成生物学の科学・産業分野で活用できます。

液滴転写法を用いて単一細菌細胞を含むGVを生成する簡単な方法を提示する(図1)。図1aは、細菌を含むGVの沈殿物の概略図を示す。細菌を含むW/O液滴は、遠心分離によって油水(脂質単層)界面を越えてGVを形成する。スクロース(内部水溶液)とブドウ糖(外水溶液)の密度の違いは、W/O液滴の油水界面の交差を助けます。これらの溶液間の濃度のわずかな違いは、GVの変形および崩壊を引き起こす可能性があるため、内側および外側の水溶液中の浸透圧を監視する必要があります。液滴転写法により細菌細胞を含むGVを調製するためのフローチャートを図1bに示す。この手順に従うことにより、単一の細菌細胞を含むGVを容易に得ることができる。
GV内の細菌細胞増殖を観察するために、顕微鏡観察用の独自の培養システ...

我々は、巨大な小胞(GV)内の細菌の単細胞培養を実証する。細菌細胞を含むGVは液滴転写法により調製し、ガラス基板上の支持膜上に固定化し、細菌増殖を直接観察した。このアプローチは、他の細胞にも適応可能である。

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for ...

このプロトコルは、巨大小胞内の単細胞レベルで細菌細胞を培養する手段を提供する。巨大な小胞を開発するのは簡単で、小胞を準備するために必要なサンプル溶液はごく少量です。この手順のデモンストレーションは、当研究室の博士候補生である太田百合です。まず、20マイクロリットルの新しく調製したPOPC溶液と4マイクロリットルの新たに調製したビオチン-PEG-DSPE溶液をガラスバイアルに添加します。脂質膜が形成されるまで空気流により有機溶媒を蒸発させる。フィルムを乾燥剤に1時間入れ、有機溶媒を完全に蒸発させます。その後、バイアルに200マイクロリットルのミネラルオイルを加えます。プラスチックパラフィンフィルムでバイアルの開口部をカバーし、少なくとも1時間の120ワットで超音波浴中のバイアル内容物を超音波処理します。小さな小胞の調製のために、ちょうど示したように、脂質膜を作成し、フィルムにLB培地で200ミリメートルのグルコースの200マイクロリットルを追加します。その後、少なくとも1時間120ワットでフィルムを超音波処理し、その後、100ナノメートルの孔サイズのミニ押出機とポリカーボネート膜を使用して、得られた巨大な小胞を小さな小胞に押し出します。細菌細胞前培養の場合、LBプレートから37°Cで一晩培養するためにLB培地のミリリットルに接種大腸菌。翌朝、培養物の上清の20マイクロリットルを1.98ミリリットルの新鮮なLB培地に移し、さらに2時間培養する。インキュベーションの終了時に、分光光度計上の培養前溶液の光学密度を600ナノメートル(OD600)で確認します。1~1.5のOD 600を含む培養前溶液を使用する必要があります。次に、作りたてのショ糖溶液と新鮮なLB培地と共にプレカルチャー溶液を混合する。巨大な小胞形成のために、1.5ミリリットル蓋付きプラスチックチューブに巨大な小胞の新しく調製された外水溶液の50マイクロリットルを追加します。巨大小胞の外水溶液の上に脂質含有油溶液の150マイクロリットルを穏やかに層化する。得られた溶液を室温で10~15分間インキュベートし、オイルと水溶液の界面が平坦であることを確認します。液滴形成を含む水および油菌細胞の場合、0.6ミリリットルの蓋付きプラスチックチューブに超音波処理された脂質含有油溶液の50マイクロリットルに、調製したばかりの内水溶液の2マイクロリットルを巨大小胞に加えます。次に、チューブをタップして2つの成分を乳化します。次に、ピペットを使用して、油および水溶液の界面に50マイクロリットルの水および油滴溶液を添加し、遠心分離によって細菌細胞含有巨大小胞を沈降させる。その後、トップオイル層を吸引し、巨大な小胞を収集します。手作りのチャンバーを準備するには、10対10で中空のパンチで7ミリメートルの穴を1ミリメートル両面シールで掘削し、2面シールを30~40ミリメートルのカバーガラスに貼り付けます。サポートされている二層膜を調製するには、手作りのチャンバーの穴に小さな小胞溶液の30マイクロリットルを加えます。室温で30分間小胞をインキュベートします。インキュベーションの終わりに、200ミリミラーグルコースを添加したLB培地20マイクロリットルで穴を2回静かに洗います。サポーターの二層膜に巨大な小胞を固定化するには、外水性巨大小胞溶液中の10マイクロリットルのノイトラビジンを室温で15分間インキュベーションする穴に導入する。インキュベーションの終わりに、20マイクロリットルのLB培地で2回、200ミリミラーのグルコースを添加し、巨大な小胞溶液の全容をチャンバーの穴に加えて、穴を2回静かに洗浄します。その後、18 18ミリメートルのカバーガラスで穴を密封します。巨大小胞内の細菌の増殖を監視するには、反転顕微鏡上で40Xの目的を選択し、顕微鏡加熱段階システム上にチャンバーを置きます。その後、37°Cで6時間静条件下でチャンバー内の細菌細胞含有巨大小胞をインキュベートし、30分ごとに細菌細胞増殖の画像をキャプチャして記録し、科学的相補的な金属酸化物半導体カメラで撮影します。細菌細胞を含む巨大小胞は、通常、10〜30マイクロメートルの大きさの範囲である。巨大小胞の両方の大きさについて、大腸菌細胞は伸びおよび分裂プロセスを経て、一部の大腸菌細胞は6時間の観察期間中に非常に多くの細胞に増殖する。単一の細胞レベルを含む巨大小胞の相対的な頻度は、得られた巨大小胞の約10%であり、単一細胞レベルでカプセル化された巨大小胞は、細菌細胞を含む巨大小胞の約50%である。油水界面の安定性は、細菌細胞を含む巨大な小胞を得るために重要である。巨大な小胞矯正の前に油を慎重に吸引するように注意してください。このビデオを見た後、あなたは個々の巨大な小胞内の単一の細胞レベルで細菌細胞を培養する方法をよく理解しているはずです。当社の細菌培養法は、未知の環境細菌を培養して代謝産物を得たり分析したりするための微生物学の新しいツールです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

出典: ワトソン、DC、 et.al。大腸菌と他の細菌からの細胞外小胞のスケーラブルな単離と精製 J. Vis. 経験。 (2021年)このビデオは、遺伝子組み換え細菌の外膜に由来する細胞外小胞(EV)の単離と濃縮を示しています。このプロセスには、細菌を培養して EV...

細菌からの外膜由来細胞外小胞の単離と濃縮

出典: 森田正氏 他巨大小胞内の単細胞レベルでの細菌細胞培養 J. Vis. 経験。...

巨大小胞内の細菌の単細胞培養

出典:ケイビーン、M. T.らバチルス・サブティリスの単細胞マイクロ流体解析。J. Vis.

マイクロ流体システムにおける細菌増殖を単細胞分解能で追跡

このプロトコルでは、原核微生物のシングルセル分析のためのマイクロ流体ピコリットルバイオリアクター(PLBR)の製作、セットアップ、および基本的な操作が紹介されています。工業的に関連性のある微生物を原理の証明として分析し、従来の方法では不可能だった特定の期間の成長率、形態、表現型の不均一性についての洞察を可能にしました。...

微生物シングルセル解析のためのマイクロ流体ピコリットルバイオリアクター:作製、システムセットアップ、操作

ジャイアントベシクルは、マイクロメートルサイズの成分を高度に詰め込んだ有用な細胞モデルです。油中水型エマルジョン遠心分離法は、カプセル化された材料で巨大小胞を調製するためのシンプルで強力なツールです。...

油中水型エマルションの遠心分離により巨大ベシクルカプセル化微小球の調製

例として枯草菌を使用して個々...

枯草菌の単一細胞マイクロ流体解析

ここでは、感染アメーバの分離のための単一細胞マイクロ吸引法について説明する。ファウストウイルスと未知の巨大ウイルスに感染したヴェルマメーバ・バーミフォルミスのウイルス亜集団を分離するために、以下に詳述するプロトコルを開発し、2つの低存在量の新規巨大ウイルスを分離する能力を実証した。...

巨大ウイルス混合物分離のための蛍光活性化細胞選別の代替戦略としての単一細胞マイクロ吸引

細菌は、生理活性のある生体分子を運ぶナノメートルサイズの細胞外小胞(EV)を分泌します。EVの研究は、それらの生合成、微生物-微生物および宿主-微生物の相互作用および疾患における役割、ならびにそれらの潜在的な治療用途を理解することに焦点を当てています。EV研究の標準化を促進するために、さまざまな細菌からEVをスケーラブルに分離するためのワークフローが提示されます。...

大腸菌およびその他の細菌からの細胞外小胞のスケーラブルな単離および精製(英語)

本プロトコールは、シアノバクテリア培養物からの細胞外小胞の単離、濃縮、および特性評価に関する詳細な説明を提供する。異なるスケールの培養物から小胞を精製するためのアプローチ、方法論間のトレードオフ、およびフィールドサンプルを扱うための考慮事項についても議論する。...

シアノバクテリア細胞外小胞の単離と特性評価

このプロトコルは、脂質二重層へのモデル膜タンパク質の合成および取り込みの研究のために、巨大単層小胞(GUV)内に無細胞発現(CFE)システムをカプセル化するために使用される逆エマルジョン法を説明しています。...

無細胞発現系のカプセル化による細菌グルタミン酸受容体チャネルの再構成

この記事では、小胞内構造を持ち、内側、環状、および外側の領域で電気伝導性がカスタマイズされた化合物ジャイアントユニラメラベシクル(cGUV)を調製する方法を紹介します。電気形成は単純なGUVを合成し、浸透圧ショックによって気孔細胞やcGUVに変換されるため、有核細胞の生物物理学を研究するための貴重なモデルを提供します。...

化合物巨大ユニラメラ小胞の合成:核細胞の生体模倣モデル

学ぶ 巨小胞内での単細胞レベル細菌培養法。液滴転移法で作製したGVに大腸菌を封入し、支持膜上で固定して蛍光顕微鏡で増殖を直接観察します。未知環境細菌の代謝産物解析に応用可能です。

巨小胞内部の単細胞レベルにおける細菌細胞培養

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