自由浮遊免疫蛍光アッセイによる皮下末梢神経線維におけるアルファシヌクレイン凝集体の標的化
2019年6月25日
ここでは、パーキンソン病に関与するαシヌクレインの疾患特異的立体構造変異体および複数のタンパク質の同定を可能にする皮膚生検セクションにおける自由浮遊間接免疫蛍光アッセイのプロトコルを提示する。末梢神経系。
パーキンソン病の診断は、実質的なニグラのニューロンのほとんどがすでに失われている病気の過程で後に現れる運動関与の臨床的徴候に依然として依存している。このプロトコルは、皮膚生検による真皮神経分析を可能にし、それは、疾患の潜在的な新しいバイオマーカーを表し、臨床試験で使用される。皮膚生検は、病理になりやすい末梢神経組織の分析を可能にする、容易に評価可能で侵襲性のない処置である。
皮膚生検によるαシヌクレイン凝集体の検出は、潜在的な治癒が最も効果的である場合、おそらく初期段階で診断目的に使用することができる。同じ患者におけるフォローアップ皮膚生検は、ヒト皮膚神経系に広がるαシヌクレイン集合体の時間および特別な経過解析を可能にする。これらは病気の病因に光を当てることができます。
この手順を開始するには、テキスト プロトコルの表 1 に示すように、新しい PLP 固定ソリューションを準備します。皮膚生検を採取した直後に、10ミリリットルの固定液を含むチューブに沈下する。摂氏4度で一晩インキュベートします。
翌日、ヒュームフードでPLP固定剤をそっと取り除きます。同じチューブで、生検をそれぞれ5分間3回洗浄し、洗浄ごとに0.1モルソレンセンの溶液を5ミリリットル使用します。ソレンセンの溶液を捨て、5ミリリットルの凍結保護液を加える。
摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、クリオトームで切り取る場合は、1週間以内に生検を摂氏4度で保存します。まず、クライオトームをマイナス20度に設定します。
クライオオールを取り、クライオ埋め込み媒体でそれを埋めます。ピンセットを使用して、クリオムノルドの底に平行な長手軸を持つクリオ埋め込み培地に生検を浸します。液体窒素で試料を凍結し、正しい配向で生検を含む凍結埋め込み培地の固体立方体を得た。
サンプルをクライオスタットに入れ、30分待って生検が順応するのを許す。その後、クライオスタットのサンプルを固定し、50マイクロメートルのセクションに切断します。小さなブラシを使用して、各ウェルに200マイクロリットルの不凍液を含む96ウェルプレートにクライオセクションを移します。
その後、マイナス20度でプレートを保管してください。まず、新鮮な96ウェルプレートの井戸の一部に100マイクロリットルの洗浄液を充填します。分析するセクションを保管プレートから洗浄液を含むセクションに移します。
洗浄液中のセクションを室温で10分間放置します。次に、各セクションを同じ洗浄液を含む空の井戸に移し、洗浄を繰り返す。次に、洗浄液をセクションに加え、100マイクロリットルのブロッキング溶液を含む新しいウェルに移します。
室温で90分以上、最大4時間インキュベートします。一次抗体、抗PGP9.5および抗5G4を働く溶液で希釈する。一次抗体の100マイクロリットルの作動溶液を含む新しいウェルに切片を移し、室温で一晩インキュベートする。
翌日、先に述べたように洗浄液を含むウェルで切片を洗う。二次抗体を希釈し、ヤギ抗ウサギはPGP9.5を検出し、ヤギ抗マウスは5G4を検出し、働く溶液中で。洗浄した切片を、二次抗体の働く溶液の100マイクロリットルを含む新しいウェルに移す。
二次抗体と共役したフルオロフォアの漂白を避けるために、アルミニウム箔でプレートを覆い、室温で90分間インキュベートします。この後、先に述べたように洗浄液中のセクションを2回洗う。洗浄した切片を、室温で5分間、100マイクロリットルのDAPIを含む新しいウェルに移します。
先に述べたように洗浄液でセクションを2回洗う。次に、正しい位置にスライド上のセクションを取り付け、誤った折り畳みを回避します。スライドに取り付け媒体を数滴追加し、カバースリップでセクションを覆います。
スライドを一晩乾燥させます。翌日、スライドを摂氏4度の適切なボックスに保管し、光の露出を避けるようにします。反転蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して、切片を見る。
顕微鏡に接続されたカメラで画像を取得します。次に、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して、テキストプロトコルに概説されているように、空間分布と信号の強度の観点から正の信号を分析します。記載された方法に従って、5G4抗体で標識されたαシヌクレイン凝集体は、PD患者の真皮神経筋膜内自律神経構造で検出される。
αシヌクレイン沈着物の形態は、真皮神経の軸索に沿った点線信号として現れる。3つの解剖学的部位における19のPD患者および17の皮膚生検における17の対照におけるこのプロトコルの代表的な使用は、5G4が健康なコントロールと比較して81%の感受性および86%の特異性を有することを示す。リン酸化アルファシヌクレインは56%の感度を有し、100%5G4の特異性を有し、リン酸化されたαシヌクレイン陽性沈着物は主に汗腺の周りに見られるが、筋肉アレクターピリ、小血管、および皮下および皮膚神経叢にも見られるが、エピ皮内神経線維では見なされていない。
一般に、汗腺内の内腔は、5G4またはリン酸化されたαシヌクレイン陽性と誤って解釈され得る非特異的なシグナルを観察することができる。このタイプのシグナルは、点線、球状であり、一次および二次抗体のない技術的制御で示されているように、おそらくイントラミナル自己蛍光材料によるものである。形態学的に細長い神経線維をマークするPGP9.5との共局在化は、正しい信号を識別するのに役立ちます。
したがって、5G4シグナルの特異性は、軸索マーカーを用いた二重免疫染色によって高くなる。良質な免疫蛍光染色を行い、蛍光シグナルの信頼性の高い解釈のためには、生検の正確な固定化が必要です。固定剤が正しく調製されていない場合、または過剰固定が発生した場合、結果は、真皮表皮接合部を横切る神経線維の信号を隠すか、または主要な真皮構造を内面化する高い自己蛍光になります。
この手順の最も重要なステップは、組織の固定です。自己蛍光と特定のシグナルを避けるために、PLP固定液のpH、およびインキュベーションのタイミングに注意してください。
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概要
この研究は、パーキンソン病に関連するアルファ・シヌクレイン変異体を特定するための皮膚生検断面における遊離浮遊間接免疫蛍光法のプロトコルを提示します。この方法は皮膚神経の分析を可能にし、早期診断のための潜在的なバイオマーカーに関する洞察を提供します。
主要な研究要素
科学の領域
- 神経科学
- 病理学
- 診断方法
背景
- パーキンソン病の診断は主に後期の臨床徴候に依存しています。
- 皮膚生検により、病気によって影響を受けた末梢神経組織の分析が可能になります。
- アルファ・シヌクレイン凝集体の検出は、早期診断に役立つ可能性があります。
- ヒトの神経系における凝集体の拡散を理解することで、病気の病因の側面を明らかにすることができます。
研究の目的
- アルファ・シヌクレイン変異体を特定するための堅牢なプロトコルを確立すること。
- 侵襲性のない診断ツールとしての皮膚生検を評価すること。
- アルファ・シヌクレイン凝集体の分布と特性を分析すること。
使用された方法
- 皮膚生検断面における間接免疫蛍光アッセイ。
- 疾患特異的マーカーを評価するための皮膚神経の分析。
- プロトコルには、サンプル固定、断面化、および抗体染色が含まれます。
- 特定の変異体を標的とする一次および二次抗体を使用します。
- 主要なステップには、制御された温度でのインキュベーションと綿密な洗浄手順が含まれます。
主な結果
- パーキンソン病患者の皮膚神経束にアルファ・シヌクレイン凝集体が同定されました。
- 5G4抗体は、健常者対照と比較して81%の感度と86%の特異性を示しました。
- リン酸化されたアルファ・シヌクレイン沈着は、さまざまな感度と特異性で検出されました。
- PGP9.5と適切な重複局在化により、陽性信号の特異性が向上しました。
結論
- この研究は、皮膚生検におけるアルファ・シヌクレイン凝集体を検出する実行可能な方法を示しています。
- 結果は、早期段階のパーキンソン病の診断バイオマーカーとして皮膚生検を使用することの可能性を示しています。
- 凝集体の分布に関する洞察は、病気の進行に関する理解を深める可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Early, minimally invasive detection of alpha synuclein aggregates in cutaneous nerve fibers addresses a critical gap in Parkinson's disease biomarker development. This immunofluorescence assay enables quantitative, reproducible assessment of disease-relevant protein pathology in accessible tissue, supporting translational research and portfolio triage. Integration of this protocol into discovery and preclinical workflows enhances predictive confidence for neurodegenerative disease programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of alpha synuclein pathology in peripheral nerves for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by quantifying disease-relevant protein aggregates in human tissue.
- Facilitates hypothesis-driven studies on aggregate distribution and disease progression.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible immunofluorescence workflow for robust biomarker quantification.
- Delivers quantitative readouts of aggregate localization and intensity for assay benchmarking.
- Enables cross-sample and longitudinal analysis to support screening and validation studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns peripheral biomarker detection with disease-relevant pathology for translational continuity.
- Supports longitudinal monitoring of aggregate spread in patient-derived samples.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by linking molecular pathology to clinical endpoints.
Pipeline & Workflow Integration
This immunofluorescence assay bridges early discovery, target validation, and translational research by enabling quantitative detection of alpha synuclein aggregates in skin biopsies.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and mechanistic clarification of protein aggregation in neurodegeneration.
- Screening: Provides validated, reproducible assay outputs for aggregate detection and quantification.
- Analytics: Generates spatial and intensity data for statistical comparison across patient cohorts and timepoints.
- Translational Research: Enables preclinical-to-clinical continuity through minimally invasive, repeatable sampling.
- Enterprise Reuse: Protocol adaptability allows targeting of additional proteins or disease models in peripheral nerves.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodegenerative disease research.
- Operational Value: Standardizes sample processing and immunofluorescence analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation by providing early, quantitative biomarker data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurodegenerative disease assets based on validated pathology.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence, microscopy, and quantitative image analysis.
- Demands precise fixation, sectioning, and antibody handling to ensure signal specificity and minimize autofluorescence.
- Necessitates standardized protocols for cross-site and longitudinal reproducibility.
- Adaptable to other protein targets with validated antibody panels and controls.
- Potential limitations include tissue autofluorescence and nonspecific signal, requiring rigorous technical controls.
