Name: 二次細菌性肺炎のマウスモデルに対する精密病原体送達と回復システム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 s
Description: 学ぼう、二次細菌性肺炎のマウスモデルにおける非侵襲的な気管內接種法と細菌回収・RNA精製技術。この方法は病原体の病原性寄与を解析し、疾患転帰を解明する上で有用です。

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著者らは、モンタナ州立大学のニコール・マイスナー博士に対し、気管内インスティレーション法の確立に協力してくれたことに感謝する。この研究は、米国国立衛生研究所(助成金NIH-1R56AI135039-01A1、GM110732、R21AI128295、U54GM115371)、ならびにモンタナ大学システム研究イニシアティブ(51040-MUSRI205-03)の資金によって支援されました。農業実験ステーション。

すべての方法は、国立衛生研究所のガイドラインに準拠し、モンタナ州立大学の機関動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。
1. 気管内刺激
<ol><li>次の消耗品を含むワークスペースを準備する:挿管プラットホーム、無菌1 mLシリンジ、無菌の鈍い先端の鉗子、無菌の21ゲージの鈍い先端の針および注射器および鉗子を貯えるために2つの円錐形の管。 注:挿管プラットフォームは、商業的に購入することも、社内で構築することもできます。ここで使用される挿管プラットホームは0.25インチプレキシガラスを使用して組み立てられた。簡単に言えば、プレキシガラスに熱を加え、ボードは約65°の内部角度に曲がっています。挿管プラットフォームの外側には、2本の機械ネジが3インチ離れて播種され、2本のネジの間にゴムバンドが吊り下げられました。</li>
	<li>目的の最終濃度が50μLの総体積で得られるようにサンプルを連続的に希釈して病原体接種を準備する。</li>
	<li>滅菌手袋を着用し、21Gの鈍い先端の針を約35°に曲げます。 注:マウスごとに別々の針が必要です。</li>
	<li>曲がった21Gの鈍い先端の針を1 mLの注射器に固定します。100 μL のエアクッションを注射器に引き込み、続いて感染剤の 50 μL を引き出します。荷を積んだ針と注射器を、支配的な手で簡単にアクセスできる場所に置きます。</li>
	<li>4%イソフルラン/酸素混合物または同様のIACUC承認された麻酔法を用いてマウスを深く麻酔する。適切な麻酔深さは、呼吸速度が5〜8sあたり約1吸入に遅い場合に通常得られ、付属品をつまみ、マウスからの反応を観察することによって確認することができる。 注:麻酔のこの方法は、約1.5分の十分な麻酔期間を提供しました。これは、私たちの研究室のメンバーがこのインスティレーション手順を学び、実行するのに十分でした。しかしながら、他の制度的に承認された麻酔法は、11、12、13を採用してもよい。</li>
	<li>麻酔室から麻酔マウスを取り出し、上顎切開から挿管プラットフォーム上のマウスを中断します。</li>
	<li>気管に明確な通路を開くために、鈍い先端の鉗子を使用して、口の外側の舌を穏やかにつかみ、伸ばします。鉗子から非支配的な手の親指と人差し指に舌を移します。</li>
	<li>非支配的な手で舌を保持し、プリロードされた注射器を拾います。針の曲がった端を体から離し、口腔に針を舌の基部に挿入します。</li>
	<li>舌の付け根に針を付けて、手首をそっと角度を付けて、針を体から少し押し出します。このステップは針が食道ではなく気管に挿入されることを保証する。</li>
	<li>ゆっくりと気管に針を導きます。多くの場合、針が声の折り目を通過するようにわずかなダニが感じられます。針がカリーナに遭遇するにつれてわずかな抵抗が感じられるまで、気管を通して針を渡します。</li>
	<li>わずかに近位方向に針を持ち上げて、カリーナの上に針を吊り下げます。これは2つの主要な気管支への配達を可能にする。注射器のプランジャーを完全に押し下して、感染負荷を引き出します。気管から針を上に持ち上げて取り出し、捨てます。</li>
	<li>ゴムバンドを押し下げて挿管プラットフォームからマウスを取り外しますが、マウスを直立した位置に保持したままにします。鼻の上に直接指を置くことによって鼻気道を妨害する。約1分間、またはいくつかの深い呼吸が観察されるまで、この位置を保持します。 注:この最後のステップは、合計接種体積が下気道に送達されることを保証する。</li>
	<li>マウスをケージに戻し、麻酔からの完全な回復を観察します。</li>
</ol>2. 感染した肺の切除
<ol><li>無菌性を維持するために層流フード内で働き、スケールおよび無菌の重量を量るボート、解剖プラットホーム、はさみおよび鉗子を含む解剖キット、無菌のRNAE自由なPBSおよび無菌ガーゼとのワークスペースを準備する。</li>
	<li>感染したマウスをCO2または類似のIACUC承認済み安楽死法で安楽死させる。</li>
	<li>感染したマウスを解剖プラットフォームに置き、各付属品の最後にピンを使用してマウスを固定します。作業面の無菌性を維持するためにエタノールでマウスをスプレーします。</li>
	<li>臍から始まり、一対の鉗子を使用して皮膚を持ち上げ、気管の基部まで切開する。最初の切開の両側の皮膚をつかみ、皮膚を体から引き離し、組織の接続を切断する。 注:胸部領域の多くを明らかにするために、皮膚全体にいくつかの横切りを行うことができると便利です。</li>
	<li>xiphoid プロセスの基部から始まり、横隔膜を穿刺する意図で小さな切開を行います。これは、肺を後退させる胸腔内の圧力の増加をもたらす。肺を引き込んで、横隔膜を解放するために切開を続ける。</li>
	<li>肋骨ケージの両側に沿って切開を行い、肋骨を取り除きます。これは完全に胸腔および肺を露出させる。</li>
	<li>肺を取り除くために、鉗子で心臓の基部をつかみ、上に持ち上げます。肺の後ろにはさみを置き、心臓を上に持ち上げ続けながら、組織の接続を介して小さな切開を開始します。</li>
	<li>肺を摘出したら、無菌ガーゼの上に置き、心臓を取り除きます。心臓は鉗子で肺から離れて持ち上げ、残りの組織の接続を切断することによって容易に取除くことができる。</li>
	<li>肺をタール前の計量ボートに移し、重量を記録する。</li>
	<li>肺の計量後、無菌リン酸緩衝生理食生(PBS)に移し、病原体の回収と分析のステップに進むまで一時的に氷の上に保存します。</li>
</ol>3. 病原体の回収と分析
<ol><li>層流フード内で作業を続け、次の消耗品でワークスペースを準備します:組織粉砕機、無菌RNAseフリーPBS、β-メルカプトエタノール(1:100)を補充したバッファRLT、および1.5 mL RNAEフリーマイクロセントリファージチューブ。 注意:β-メルカプトエタノールは、皮膚接触、摂取、眼接触、または吸入の場合に危険な場合があります。緩衝RLTへのβ-メルカプトエタノールの希釈は、ヒュームフードで行われるべきである。</li>
	<li>まず、無菌RNAseフリーPBSを1mLの菌組織粉砕機に添加します。充填したら、ティッシュグラインダーを氷の上に保管します。</li>
	<li>感染した肺から回収された細菌負荷を定量化するために使用される一連の無菌RNAEフリーシリアル希釈管を準備します。これは、各マイクロ遠心管に900μLの滅菌水をアリコートし、続いて病原体の接種をシリアル希釈することによって最も容易に達成される。 注:正確な病原体の列挙に必要な希釈管の数は、初期病原体の入力と感染期間によって異なります。これは経験的に決定されなければなりません。</li>
	<li>滅菌鉗子を使用して、準備されたティッシュ粉砕機に肺を移し、回転しながら台座を押すことによって組織を完全に均質化する。</li>
	<li>均質化されたサンプルの組織粉砕機とアリコート100 μLを、調製されたシリアル希釈チューブの最初に開きます。サンプルを連続的に希釈し、栄養寒天にメッキを施すことでCUを列挙します。CFOは、肺組織のCFO/mLまたはCFC/mL/mgとして記録することができる。 注:このステップでは、ウイルスRNAの精製のために均質化されたサンプルの追加の200 μLを除去するか(材料の表を参照)、または将来の分析のために-80°Cで保存することができます。</li>
	<li>CFU判定および/またはウイルスRNA単離のためにアリコートを除去した後、4,000 rpm(3724 x g)で遠心分離により粉砕台座とペレットを4°Cで10分間遠心分離して置き換えます。</li>
	<li>ピペットを使用して、ペレットサンプルから上清を取り出し、1.5mLのマイクロ遠心管に入れます。 注:上清は細菌を含んでおらず、可溶性宿主および分泌された病原体因子の分析のために-80 °Cで貯えることができる。</li>
	<li>700 μLの緩衝液RLT-mercaptoethanolでピペッティングまたはボルテックスにより均質化された組織ペレットを再懸濁し、無菌のRNAseフリー1.5mLマイクロ遠心分離管にサンプルを移します。 注:この時点でサンプルは数ヶ月間-80 °Cで貯えることができる。</li>
	<li>精製キットのメーカーのプロトコルにわずかな変更を使用してRNAを精製する(材料の表を参照)。Voyich et al. 200814を参照してください。<ol>
<li>均質化された肺スラリーを0.1mmのシリカビーズを含む2mLマイクロ遠心管に移し、6m/sで20秒のビーズビーターで処理します。</li>
		<li>サンプルを1,500 rpmで3分間遠心分離します。遠心分離後、上清を新しい1.5 mLマイクロ遠心管にピペットします。</li>
		<li>サンプルに96%~100%エタノールの350μLを加え、ピペッティングまたは反転によって完全に混合します。</li>
		<li>試料の700μLを2mL回収管に入れた精製カラムに移します。15 s の場合は ≥8,000 x gでサンプルを遠心分離し、フロースルーを破棄します。上記と同じ列を使用して、余分なサンプルを実行します。</li>
		<li>700 μL のバッファー RW1 と遠心分離機サンプルを 15 s の ≥ 8,000 x gでカラムを洗浄し、シリカ膜カラムを新しい 2 mL 回収チューブに移します。</li>
		<li>500 μL のバッファ RPE をカラムに適用します。15 s. フロースルーを破棄する ≥ 8,000 x gで遠心分離でカラムを洗います。</li>
		<li>RNeasy カラムにさらに 500 μL のバッファ RPE を適用し、8,000 x gで 2 分間フロースルーを破棄し、1 分間 ≥10,000 x gでカラムを遠心分離します。</li>
		<li>精製RNAを溶出させるには、まずカラムを新しい1.5mL RNAEフリーマイクロ遠心分離管に移します。カラムのシリカゲル膜に直接トルナスフリー水のピペット50 μLを、1分間≥8000 x gで遠心分離機に直接入れます。 注: ELuted RNA を同じカラム上で再度実行して、RNA 歩留まりを高めることができます。</li>
		<li>精製されたRNAに50 μLのRNaseフリー水を加え、総体積を100 μLにするアリコット350 μL RLT-θ-メルカプトエタノールに続いて、96%~100%エタノールの250 μLをサンプルに加え、ピペッティングまたは反転によって完全に混合します。</li>
		<li>サンプルをコレクションチューブに置き、遠心分離機を ≥8000 x gで 15 s. フロースルーを破棄し、コレクションチューブを交換します。</li>
		<li>350 μL のバッファー RW1 を追加し、その後 15 s の ≥8000 x gで遠心分離を加えてカラムを洗浄します。</li>
		<li>10 μL の DNase ストック (750 クニッツ単位/mL) をバッファー RDD の 70 μL に加えることで、約 27 クニッツ単位を含む DNase ソリューションを調べります。80 μLのDNase溶液をシリカゲル膜に直接加え、室温で15分間インキュベートします。</li>
		<li>350 μL のバッファー RW1 と遠心分離機でカラムを 15 s の ≥8000 x gで洗浄し、フロースルーを破棄します。</li>
		<li>RNA を精製するには、手順 3.9.6 ~ 3.9.8 を繰り返します。 注: 3.9.9~ 3.9.10 および 3.9.6 ~ 3.9.8 (DNase ステップ 3.9.11~ 3.9.13 をスキップ) に従って、RNA クリーンアップ手順を繰り返すことをお勧めします。この追加のクリーンアップは、非常に高品質のRNAをもたらします。</li>
	</ol></li>
	<li>RNA歩留まりは、濃度を決定するための260 nMの測定値と純度のための260:280 nMの分光光度計を使用して定量することができます。RNA収率を得た後、各RNAサンプルの濃度を50ng/μLに標準化します。 注:RNAの劣化につながる凍結/解凍サイクルを避けるために、50 ng/μLの濃度で複数のアリコートを作ることをお勧めします。</li>
	<li>精製したRNAを-80°Cに保存するか、直ちに転写分析に使用してください。 注:以前の出版物では、3~5匹のマウスからのRNAを転写物分析のためにプールした。上記の技術の最適化を通じて、1匹のマウスからのRNAは、転写分析(80-120 ng/μL)に十分であると経験的に決定された。</li>
</ol>

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</ol>

著者は何も開示していない。

このモデルの使用は二次細菌の伝染を研究するために非常に有効で、再生可能な方法を提供する。病原体接種の送達を厳密に制御する能力は、各病原体の個々および組み合わせ効果のより正確な観察を可能にする。より一般的な鼻腔内点水経路の非効率性は、文献に存在する用量量と濃度の不一致に寄与している可能性が高い。二次細菌性肺炎を研究するための正確なマウスシステムの欠如は、肺共感染症の重症度に寄与する細菌特異的な応答を同定する所見を遅らせたのは妥当である。二次細菌感染時のウイルス発現を研究する再現可能なモデルを開発することは、これらの感染症を改善するためのワクチンまたは薬物標的の同定につながる可能性がある。
気管内刺激ステップは、下気道感染および病原体の下流分析を正常に確立するために重要である。この技術を学ぶとき、感染性物質を投与する前に(方法で説明されているように)色素を使用して練習することが役立つかもしれません。色素を使用すると、気道への接種の直接可視化を可能にする。発生する可能性のある一般的な間違いは、気管ではなく食道に鈍い針を挿入することです。これは、肺ではなく胃に接種の配信になります。この間違いを修正するには、針を体から遠ざけて気管に渡します。一度習得すると、この手順は非常に効率的であり、多数のマウスで実験を行うために使用することができます。マウスを麻酔するバッチで作業し、気管内刺激はマウスあたり約30秒で完了することができる。さらに、肺の切除はマウス1匹につき2~3分で完了することができる。
感染した組織からの生存可能で純粋な細菌RNAの回収は、転写物分析に不可欠です。RNasesはユビキタスであり、すぐに実験15を台無しにすることができます.いくつかの方法は、RNase阻害剤を使用して含まれます;しかし、RLT-mercaptoethanolで-80°Cでサンプルを凍結するか、すべてのRNaseフリーチューブおよび試薬を用いてRNA単離のサンプルを直ちに処理することが、RNase汚染の低減に有効であることがわかった。さらに、一度に最大 6 つのサンプルを精製することをお勧めします。6つ以上のサンプルを含めると、RNAの劣化に終わる可能性のあるプロトコルステップ間の遅延が長くなる可能性があります。精製したら、不必要な凍結解凍サイクルを避けるためにも注意が必要です。したがって、1つのサンプルに対して複数の分析を行う場合は、-80°Cで保存するための精製RNAをアリコートすることをお勧めします。
本明細本で検討される技術に加えて、この方法は、肺16の切除および均質化の前に気管支肺胞洗浄を行うことによって補うことができる。これは、下気道全体の洗浄または縫合糸を使用して気管支の木の1つの分岐アームを制限し、残りの枝を通して洗浄することによって達成することができる。多くの場合、これは病原体負荷の回復の減少につながるが、乳酸脱水素酵素活性、細胞集団同一性、およびサイトカインプロファイルなどの情報が得られるサンプルを提供する16。これらのデータを組み合わせることで、二次細菌性肺炎の間に起こる宿主病原体相互作用をより完全に理解することができます。
議論された方法は二次細菌性肺炎の文脈の中にあったが、それらは下気道感染症の任意のマウスモデルに拡張するのに適している;具体的には、厳密に制御された配信とインストールされた接種の回復から利益を得るもの。さらに、他の多くの感染経路と同様に、気管内刺激は、治療および環境化合物12の投与などの非感染性用途で利用することができる。

インフルエンザ感染後の二次細菌性肺炎は、米国における主要な死因であり、研究1,2の活発な領域である。二次細菌性肺炎のマウスモデルを用いた数多くの研究にもかかわらず、病原体の注入および尋問に関する矛盾は3、4、5のままである。さらに、これまでの多くの取り組みは、二次細菌感染の影響を受けやすいインフルエンザの免疫調節効果に焦点を当ててきたが、より最近のデータは、細菌病原体のウイルス調節が等しいことを示唆している。病気の確立に向けた貢献者 6,7,8,9.これらの新しいデータは、病原体応答の調査を容易にする共感染のマウスモデルにおける二次細菌性肺炎を探索するより正確な方法を必要とする。
インフルエンザ共感染モデルに特有の宿主生物は、二次細菌剤の投与前に一次インフルエンザ感染によって意図的に免疫不全化される。ヒト宿主で観察される疾患病因を最もよく複製するためには、各感染剤の個体および組み合わせ効果を観察するように、一次剤と二次剤の両方の病原体負荷を制御することが不可欠である。最も一般的には、マウスの呼吸器感染症は、鼻腔内投与3、4、5、6、10を介して確立されている。このルートは技術的に単純であり、一部の単剤感染アプリケーションに適している点と同様に、点眼手順、用量量、および有効性は内で非常に可変であるため、共感染モデルには不向きです。出版文献3,4,5,6.
二次細菌性肺炎の病因をより完全に理解するためには、宿主と病原体の両方の寄与を考慮する必要があります。そのために、感染した肺から生存可能な細菌や病原体RNAを回収するための簡単で再現性の高いアプローチを開発しました。この方法は、簡略化された非侵襲的な気管内注入手順を使用し、その後細菌RNAを単離する。ここに記載される気管内点水手順は、前述の方法と同様であり、病原体送達11、12、13に限定されない。この特定の手順の使用は、低コストであることから利益を得て、カニューレ、ガイドワイヤー、光ファイバケーブルなどの特殊な機器を使用する必要はありません。さらに、この手順は非侵襲的であるため、マウスの被験者に対するストレスを最小限に抑え、接種力学からの炎症反応を最小限に抑え、複数の被験者の感染に対する効率的な送達経路を提供する。簡単に言えば、イソファラン麻酔マウスは切開部から懸濁される。鉗子は舌を穏やかに握るために使用され、その後、あらかじめ荷を積まれた曲がり、鈍い先端、21ゲージの針を気管に挿入し、病原体負荷を送達する。この手順の検証は、肺コンパートメントに均等に分布する色素の視覚的確認および細菌負荷の回収によって実証される。次に、感染した肺から生存可能な黄色ブドウ球菌(S.aureus)を回復する方法を示し、高品質の病原体RNAを分離する再現可能な方法を説明する。

<table><tbody><tr><td>Lysing Matrix B</td><td>MP Biomedicals</td><td>6911100</td><td>本文中では「0.1 mm シリカビーズ」と呼ばれています。</td></tr><tr><td>21 ゲージの鈍い針</td><td>SAI</td><td>B21-150</td><td>1.5" をお勧めします。</td></tr><tr><td>RNase-Free DNase Set</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>添付テキストで使用されているDNase。</td></tr><tr><td>FastPrep-24 Classic Instrument</td><td>MP Biomedicals</td><td>116004500</td><td>FastPrep FP120 は販売を終了しました。本文中では「Bead Beater」</td></tr><tr><td>TaqMan AIV-Matrix Reagents</td><td>Applied Biosystems</td><td>4405543</td><td>Influenza A M-segment qRT-PCR kit.</td></tr><tr><td>挿管スタンド</td><td>ケント・サイエンティフィック</td><td>ETI-MES-01</td><td>本文では「挿管プラットフォーム」と呼ばれています。添付のビデオで使用されている挿管プラットフォームは社内で製造されました。</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>RNA 精製キット。RNeasy カラム、Buffer RLT、Buffer RW1、Buffer RPE</td></tr><tr><td>QIAamp Viral RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>52904</td><td>ウイルス RNA 精製キットが含まれています。</td></tr><tr><td>ティッシュグラインダー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-542-08</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール (&beta;-メルカプトエタノール)</td><td>Calbiochem</td><td>UN2966</td><td></td></tr></tbody></table>

二次細菌性肺炎のマウスモデルに対する精密病原体送達と回復システム

A Precise Pathogen Delivery and Recovery System for Murine Models of Secondary Bacterial Pneumonia

インフルエンザ感染後の二次細菌性肺炎は、米国の主要な死因トップ10に常にランク付けされています。今日まで、共感染のマウスモデルは、一次感染と二次感染の両方の病理を探索するために開発された主要なツールであった。このモデルの普及にもかかわらず、点点手順、用量量、および有効性に関するかなりの不一致は、研究の間で一般的です。さらに、これらの取り組みは、病原体が感染後の疾患進行に直接影響を及ぼす可能性のある方法に対処する上で、ほとんど不完全であった。本明細書では、二次細菌性肺炎のマウスモデルに使用される病原体送達、回収、および分析の正確な方法を提供する。我々は、気管内注入により、制御された体積を下気道に直接均等に効率的かつ正確に送達することを実証する。肺は、病原体の負担を回復し、定量するために駆除することができる。感染した肺の切除後、その後の転写分析のために高品質の病原体RNAを抽出する方法について述べた。この手順は、専門の実験装置を使用せずに非外科的な送達方法であることから利益を得て、二次細菌性肺炎への病原体の寄与を調査するための再現可能な戦略を提供する。

図1は、0.1%の重量/体積のクーマッシー・ブリリアントブルーの溶液を使用して、気管内インスティレーションが下気道内で直接均等に接種を行うことを実証しています。図2は、バクテリア(S.aureus)CFCが均質化された肺組織から直接回復したことを示す。図3は、個々のマウスからの入力および回復CFOをプロットすることにより、下気道における接種の正確な送達および回復のためにこのシステムを使用することを示す。図4は、細菌ハウスキーピング遺伝子gyrBのqRT-PCR増幅曲線を示し、細菌RNAが最小限のDNA汚染で感染した肺組織から直接抽出できることを実証する。図5は、感染した肺組織から直接抽出できるウイルスRNAを実証するインフルエンザAウイルスMセグメントのqRT-PCR増幅を用いた標準曲線の構築を示す。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59566/59566fig01.jpg"> 図1:気管内注入により、下気道への分布も可能にする。(A, B)未感染の肺は、無菌PBSの気管内刺激に続いて健康なマウスから切除し、(A)背部および(B)腹部の視点から撮影した。(C,D)0.1%のクマシーブリリアントブルー溶液の50μLを、気管内投与を介して麻酔マウスに投与した。 (C)ドーサル。(D)腹部。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59566/59566fig01large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59566/59566fig02.jpg"> 図2:感染した肺同質からの細菌CFEの代表的な回収肺はS.アウレウスとの1日後の挑戦後に切除された。均質化に続いて、肺スラリーの100μLを連続的に10-6で希釈した。回収したCFOを列挙するために、10μL滴を10-5及び10-6希<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59566/59566fig02large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59566/59566fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59566/59566fig03large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59566/59566fig04.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59566/59566fig04large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59566/59566fig05.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59566/59566fig05large.jpg" target="_blank"></a>

ここでは、病原体の回復と転写解析に続いて下気道への浸入経路を非侵襲的に提供することにより、二次細菌性肺炎研究を改善する方法を提示する。これらの手順は再現可能で、カニューレ、ガイドワイヤー、光ファイバケーブルなどの特殊な機器なしで実行できます。

Secondary bacterial pneumonias following influenza infections consistently rank within the top ten leading causes of death in the United States. To date, ...

この手順の全体的な目標は、下気道への細菌接種の単純で非侵襲的な経路を提供し、続いて転写物分析のためのRNAの細菌回収および精製を提供することによって、二次細菌性肺炎研究を強化することである。これは、最初にマウスを深く麻酔し、上顎切歯から垂直に吊り下げられたマウスの気管にプリロードされた鈍い先端の曲がった針を挿入することによって達成される。第二に、成功した感染に続いて、細菌コロニー形成ユニットは、肺の切除および均質化によって回収される。得られた肺ホモゲン酸は、コロニー形成単位を列挙するために栄養寒天に連続的に希釈し、メッキされる。最後に、RNAは肺ホモジネートから精製される。この手順の利点は、下気道への直接制御された送達を可能にすることです。これにより、病原体の組み合わせと個々の貢献の両方を病気の結果に向けて見ることができます。この分野における最近の進歩は、細菌遺伝子調節が感染の結果を決定する上で大きな役割を持つ可能性があることを実証している。この技術は、細菌CFUsとRNAの両方を回収する能力から恩恵を受ける。RNAが単離されると、特定の毒性遺伝子が感染に対する寄与を評価することができます。さらに、この技術は非外科的であることから利益を得る。これにより、この手順で使用される動物に最小限のストレスを与え、即時回復を可能にします。この手順は、カニューラ、ガイドワイヤまたは光ファイバーケーブルの任意のタイプを使用せずに一般的な実験室の機器を使用することで利点があります。この技術に新しい個人は、気管を通して実際のインストールに最初に苦労する可能性があります。.この技術が概念化されると、マウス宿主内の二次細菌性肺炎を尋問する簡単で効果的な手順となる。手順を開始する前に、次の供給でワークスペースを準備します:挿管プラットフォーム、無菌1 mLシリンジ、無菌鈍チップ鉗子、無菌21ゲージの鈍い先端針、および注射器および鉗子を格納するための2つの円錐管。病原体の接種を準備して、所望の最終濃度が50マイクロリットルの体積で得られるようにして、処置を開始する。次に、滅菌手袋を使用して、1〜1.5インチ21ゲージの鈍い先端針を約35度の角度に曲げることによって準備する。注射器に針を固定した後、100マイクロリットルのエアクッションを引き、続いて感染因子の50マイクロリットルを引き出す。100マイクロリットルのエアクッションはスポイトが落ち込んだ後の病原体負荷の完全な配達を保障する。ロードされた針と注射器を、支配的な手で簡単にアクセスできる場所に置きます。麻酔室からマウスを取り出して麻酔し、上顎切歯から挿管プラットフォーム上でマウスを中断します。鈍い先端の鉗子を使用して、穏やかに舌をつかんで伸ばします。鉗子から非支配的な手の親指と人差し指に舌を移す。非支配的な手で舌を保持したまま、プリロードされた注射器を拾います。針の曲がった端を体から離します。針を口腔に挿入します。舌の根元で手首を優しく傾け、針を体から離します。このアクションは、針が食道ではなく気管に挿入されることを保証します。ゆっくりと針を気管に下ろします。針がボーカルフォールドを通過すると、多くの場合、わずかなダニが感じられます。針がカリナに遭遇するとわずかな抵抗が感じられるまで、気管を通して針を通します。わずかに上向きの方向に針を持ち上げて、カリーナの上の針を吊り下げます。これにより、一次気管支への配送が可能になります。感染性負荷を供給するために、注射器プランジャーを完全に落ち込ませる。気管から針を取り出し、捨てます。ゴムバンドを押し下げて挿管プラットフォームからマウスを取り外しますが、マウスを直立した位置に保持します。ナレスの上に指を置くことによって鼻道を妨げる。この位置を約1分間、または複数の深呼吸が観察されるまで保持します。この最後のステップは、総接種量が下気道に送達されることを保証する。動物をケージに戻し、麻酔からの迅速な回復があることを確認してください。選択された時点で、感染した肺を切除して、二次細菌性肺炎に関連する罹患率の増加に対する細菌の寄与を定量化し、評価することができる。スケールと無菌の重量を量るボート、解剖のプラットホーム、はさみおよび鉗子および無菌ガーゼを含んでいる解剖キットは次の項目とワークスペースを準備しなさい。このデモンストレーションの目的のために、肺の切除はベンチトップで行われます。しかし、この手順を通して無菌性を維持するためには、肺切除を層流フード内で行うことを推奨する。CO2または同様のIACUC承認の安楽死方法で感染したマウスを安楽死させる。解剖プラットフォーム上に感染したマウスを配置し、保護します。作業面での無菌性を維持するために、マウスにエタノールをスプレーします。臍帯から始まり、ペア鉗子を使って皮膚を持ち上げ、喉頭に向かって切開を行う。最初の切開の両側の皮膚をつかみ、皮膚を体から引き離し、組織の接続を切断します。胸部領域の多くを明らかにするために皮膚全体の横切りを行うことを助けることができます。.xiphoidプロセスの基部から始めて、横隔膜を穿刺するつもりで小さな切開を行う。これは、胸腔の圧力の増加をもたらし、肺を引き込む原因となる。肺を引き込んだまま、切開を続けて横隔膜を解放する。両側に切開を行うことで肋骨を取り除きます。これは、胸腔と肺を露出します.切除するには、肺は鉗子で心臓の基盤をつかみ、上方に持ち上げます。肺の後ろにはさみを置き、心臓を上に持ち上げ続けながら、組織の接続を通して小さな切開を開始します。肺を切除したら、生殖不能ガーゼの上に置き、肺から離れ、残りの組織接続を切断することによって心臓を取り除きます。肺を事前タール計量ボートに移し、質量を記録する。肺の重量を量った後、肺を無菌リン酸緩衝生理食塩水に移し、一時的に氷の上に貯蔵する。肺が切除され、計量された今、細菌は病因に対する役割を決定するために回復することができる。細菌回収に備えて、組織粉砕機、無菌RNaseフリーPBS、β-メルカプトエタノールを添加したバッファRLT、および1.5 mL RNaseフリーマイクロ遠心チューブが必要です。まず、滅菌RNaseフリーPBSの1mLを組織グラインダーに加えます。充填したら、組織グラインダーを氷の上に保管します。次に、一連の無菌RNaseフリーシリアル希釈チューブを調製し、感染した肺から回収された細菌負荷を定量化します。準備された組織グラインダーに肺を移し、回転しながら台座を押し下げて組織を完全に均質化する。組織粉砕機と均質化サンプルのアリコート100マイクロリットルを、調製したシリアル希釈管の最初に開く。サンプルとプレートを栄養寒天で連続して希釈し、コロニー形成単位を列挙する。CFUsは、肺組織のミリグラム当たり、mL当たりまたは1mL当たりのCFUsとして記録することができる。100マイクロリットルのアリコートを取り除いた後、粉砕台座と遠心分離機を4,000rpmで摂氏4度で10分間交換します。遠心分離が完了したら、ペレット化したサンプルから上清を取り除く。上清は、後日さらに分析するためにマイナス80°Cで保存し、保存することができます。700マイクロリットルのRLT β-メルカプトエタノールで均質化された組織ペレットを再中断し、サンプルを無菌RNase-free 1.5 mL遠心分離管に移します。この時点で、サンプルはマイナス80度で保存できます。RNAは、1ミリシリカビーズを含む2mLマイクロ遠心分離チューブにサンプルをロードすることによってRLT肺ホモジネートスラリーから精製し、毎秒6メートルで20秒間ビーズビーターを介して処理することができます。RNAは、Voyich等で報告されたRNeasy法の適応を用いて直ちに精製される。分子生物学における方法"2008、およびこのビデオに付随する原稿に記載されている。精製後、分光光度計を用いてRNA収率を定量することができる。一度定量化すると、得られたRNAをマイクロリットル当たり50ナノグラムの複数のアリコートに希釈することが有益である。これにより、サンプルからのRNAを複数の凍結融解サイクルの対象とすることなく、複数の分析に使用できます。この技術を使用すると、制御された病原体負荷を下気道に直接設置することができます。この配信システムの効率は、1%Coomassieブリリアントブルーソリューションのインストールによって実証することができます。一番上の行は、コントロールとして機能する未感染の肺のペアを表示し、一番下の行は、気管内設置を通じて1%クマシー鮮青色染料の50マイクロリットルを受け取った肺のペアを表示します。この色素の使用は、気管内設置が左右の肺に対する病原体負荷の均等な分布を提供する方法を示す。感染すると、病原体の負荷を回復し、肺組織の切除および均質化によって気管内設置後の様々な時点で分析することができる。この回収技術の効率を実証するために、3匹のマウスをそれぞれ含む2群が黄色ブドウ球菌の低用量および高用量で感染した。細菌の入力は、CFUsを列挙するために栄養寒天にメッキされた。気管内設置後1時間、マウスを安楽死させ、肺を切除し、組織粉砕機で均質化した。ホモジナイズ組織を連続的に希釈し、栄養寒天にメッキしてCFUsを列挙した。均質化された肺組織から単離されたRNAを逆転写酵素PCRで調べ、標的遺伝子の相対的な転写量を定量化するために使用することができる。バックグラウンドDNA汚染を最小限に抑えるために、逆転写酵素を添加せずにPCR反応をqRT-PCR反応と一緒に実行することをお勧めします。細菌の負荷に加えて、この技術は、ウイルス負荷のインストールおよび分離に拡張することができます。肺組織の均質化に続いて、ウイルスRNAを単離して、ウイルス遺伝子の産物の豊富さを測定するか、またはウイルス定量のための標準的な曲線を構築するために使用することができる。このシステムの使用は二次細菌性肺炎を研究するために非常に能率的で再生可能なシステムを提供する。一度習得すると、この手順は大規模な実験で使用することができます。マウスを安楽死させるためにバッチで働いて、気管内設置はマウスあたり30秒以内に起こり得る。これが完了した後、肺の切除に移り、これはマウス1匹につき約2〜3分で完了することができる。ここで説明する方法は二次細菌感染の文脈の範囲内であったが、接種の制御された送達および回復が必要なあらゆる処置に向けて拡張することができる。ここに記載されている方法に加えて、この手順は、肺の切除前に気管支肺胞洗浄の添加によって補足することができる。これはしばしば病原体負荷の回復を減少させるが、サイトカイン分析、乳酸脱水素酵素活性、および異なる細胞集団の同定などのデータを得る利点がある。病因の病態をより完全に理解するためには、宿主と病原体の両方に疾患への寄与を問い合わすることが重要になります。このビデオの目的は、マウスホスト内の二次細菌性肺炎を探索するための簡単で効率的な方法を提供することであった。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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