化学遺伝子解析で作られた皮質間ニューロン前駆体を早期産後マウス脳に移植
August 26th, 2019
ここでは、初期産後マウスの皮質に移植された皮質間ニューロン前駆体の活性を操作するために化学遺伝学的ツールを使用するように設計されたプロトコルを提示する。
この方法により、皮質インターニューロン前駆体の成熟に対する内在活性の影響を研究することができる。この技術は、大多数の科学界がアクセスできる皮質インターニューロン前駆物質の細胞特性を標的にして操作するための効率的な方法を提供する。このプロトコルは、サンプルと機器の細心の注意を払って処理を伴い、視覚的なデモンストレーションで最もよく理解することができます。
防水ペンを使用して、6つの35ミリメートルペトリ皿の底面の底部の中央に直線を描きます。PBSの液体4%低ゲル化アガロースの10ミリリットルを35ミリメートルのペトリ皿の2つに加え、アガロースに3〜4個の解剖された脳を埋め込み、嗅球が1皿あたりを下に向け、各サンプルの間に3〜5ミリメートルのスペースを残します。すべての脳が埋め込まれたら、アガロースが3つの脳を凝固させ、アガロースの単一のブロックに彫り込み、サンプルの端の周りに約3ミリメートルのゲルを残すために、皿を摂氏4度に置きます。
ミクロトームベースの表面にブロックを接着し、外科用ブレードを使用して、各組織サンプル間のブロックの底部を切り取り、3つの独立したブロックを得ます。次に、振動ブレードミクロトームを使用して、氷冷クレブス溶液のブロックを250マイクロメートルの厚いスライスに切り離し、曲がった平らなマイクロスパチュラを使用して、内側または尾根神経節性エミネンスを含むスライスのみを収集します。次に、個々のポリスチレンセンターウェル臓器培養皿の最小必須培地に浮かぶ個々の13マイクロメートルの直径、8マイクロメートルの孔サイズフィルター膜に各セクションを置きます。
すべての切片が得られたら、1時間摂氏37度の二酸化炭素組織培養インキュベーターに皿を入れる。焦点DNA注入の前に、1ミリメートルの直径、10ミリメートルの長いアガロースカラムをガラス長225ミリメートル、2ミリリットル容量のガラスピペットで氷の冷たいクレブス溶液に入れます。外科用ブレードを使用して、エレクトロポレーション電極の表面に収まるように1つの小さなアガロース片を切断し、焦点DNA注射のベースとして使用する1つの大きな部分を切断する。
次に、アガロースブロックを氷冷クレブス溶液に入れる。注射の場合、発現および制御ベクターDNAを各ベクターのマイクロリットル濃度あたり1マイクログラムで混合し、1~10回目の希釈で高速グリーンストック溶液を追加します。引っ張られた0.5ミリメートルの内径、1ミリリットルの外径ガラスマイクロピペットに10マイクロリットルのDNA混合物を充填し、マイクロピペットを空気圧ピコポンプインジェクターにロードします。
アガロースの大きなブロックをステレオ顕微鏡の下に置き、注射するスライスをアガロースの部分に置きます。次いで、スライスの選択された内側神経節または尾膜神経節性の有数体領域に25〜50ナノリットルの体積を注入する。注入の直後に、ペトリ皿電極に小さなアガロースブロックを置き、平らなエンドマイクロスパチュラを使用してアガロースカラムを移動式カバー電極に取り付けます。
注射したスライスを支持膜をアガロースブロックに移し、スライスの選択領域の上にアガロースカラムを持つ上部電極を置きます。次に、500ミリ秒離れた125ボルトの2つの5ミリ秒パルスで領域を電気ポレートします。エレクトロポレーションの後、支持膜を持つスライスを保持皿に戻し、皿を組織培養器に戻します。
1時間後、最小必須培地を一次神経細胞培養に適した基本的な培地に置き換え、スライスを一晩インキュベーターに戻します。これらのエレクトロポレーション実験では、約50%のGFP陽性ニューロンがRFP陽性注入タンパク質を同時発現し、したがって、GFP陽性RFP陰性集団が注入されたDNAリガンドの効果に対する内部制御として役立った。クロザピンおよび酸化物投与は、これらの新生児コロナ組織切片における活性依存性タンパク質c−Fosの発現によって示されるように、トランスフェクトRFP陽性細胞の活性を選択的に増加させる。
クロザピンおよび酸化物処理はまた、投与されたごみ類に比べてGFP陽性RFP陰性細胞の数に対するGFP陽性RFP陽性細胞の割合の増加をもたらす。この手順は、宿主の循環可塑性および脳機能に及ぼす活動変調移植性インターニューロンの影響を研究するために使用することができる。
概要
この研究は、早期出生後のマウスにおいて、化学遺伝学的ツールを使用して皮質間脳神経前駆細胞の活性を操作するプロトコルを提示します。この方法により、研究者はこれらの間脳神経前駆細胞の成熟における固有の活性の影響を探索し、皮質機能のより深い理解に貢献することができます。
研究の主要な構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 皮質発達
- 化学遺伝学
背景
- 皮質間脳神経は脳機能において重要な役割を果たします。
- それらの成熟を理解することで、神経学研究に情報を提供できます。
- 化学遺伝学は神経活動の精密な制御を提供します。
- 出生後のマウスは皮質発達を研究するための適切なモデルとして機能します。
研究の目的
- 移植された皮質間脳神経前駆細胞の活性を操作すること。
- 間脳神経の成熟における固有の活性の影響を調査すること。
- 研究者向けに広くアクセス可能なプロトコルを提供すること。
使用された方法
- 操作のために、早期出生後のマウスからex vivo脳切片を準備しました。
- 生物学的モデルには、移植された皮質間脳神経前駆細胞が含まれていました。
- 重要なステップには、アガロースへの組織埋め込みと、標的DNAの注入に続く電気ポレーションが含まれました。
- 操作後、切片は培養され、ニューロンの活動反応について分析されました。
主要な結果
- 約50%のニューロンがGFPとRFPの共発現を示し、操作の成功を示しました。
- クロザピンと酸化物処理により、RFP陽性細胞の活性が向上し、c-Fosの発現が増加しました。
- この方法は、移植された間脳神経が宿主脳機能にどのように影響するかについての洞察を提供します。
結論
- この研究は、間脳神経前駆細胞を操作するための効果的なプロトコルを示し、皮質可塑性におけるそれらの役割のさらなる調査を可能にします。
- 活動調節された間脳神経のメカニズムを理解することで、神経科学における知識を前進させることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Genetic and chemogenetic manipulation of cortical interneuron progenitors enables precise interrogation of neuronal maturation mechanisms, supporting early-stage target validation in neurodevelopmental research. This approach provides predictive confidence for understanding how intrinsic activity and environmental factors influence integration and function of inhibitory circuits. The protocol's ability to dissect gene-environment interactions in a controlled, transplantable system positions it as a valuable tool for de-risking neurobiological targets in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of interneuron maturation and integration in disease-relevant neural circuits.
- Supports mechanistic de-risking by isolating genetic and environmental contributions to neuronal development.
- Facilitates predictive assessment of target modulation effects on inhibitory network assembly.
Screening & Assay Development
- Provides a validated system for quantitative measurement of neuronal activity and gene expression in engineered progenitors.
- Enables reproducible manipulation and tracking of transplanted cell populations using fluorescent reporters.
- Supports assay standardization for evaluating chemogenetic tool efficacy and specificity in neural tissue.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling in situ analysis of activity-dependent protein expression (e.g., c-Fos).
- Offers continuity from discovery to preclinical validation by modeling integration of engineered cells in host brain circuits.
- De-risks advancement decisions by providing quantitative readouts of graft function and host response.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol bridges early discovery and preclinical research by enabling genetic manipulation, transplantation, and functional analysis of interneuron progenitors in a single workflow.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on gene-environment interactions in interneuron maturation.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs for evaluating chemogenetic modulation in neural tissue.
- Analytics: Provides molecular and cellular readouts (e.g., co-expression of fluorescent proteins, c-Fos induction) for comparative analysis.
- Translational Research: Models integration and function of engineered cells in vivo, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for testing diverse genetic constructs and activity modulators in neural progenitors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in neuronal development.
- Operational Value: Standardizes manipulation and analysis of neural progenitors for scalable, reproducible studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing robust, quantitative data on engineered cell integration and function.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurodevelopmental targets and interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in ex vivo electroporation, transplantation, and chemogenetic manipulation of neural tissue.
- Demands access to specialized instrumentation for tissue sectioning, microinjection, and fluorescence imaging.
- Necessitates cross-team standardization of protocols for reproducibility and data comparability.
- Adaptation may be needed for different interneuron subtypes or host models.
- Potential limitations include variability in graft integration and chemogenetic tool specificity.
