Name: 蛍光相撲捕集タンパク質を用いた SUMO 修飾タンパク質の局在化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: 学ぶ蛍光相撲捕集タンパク質kmUTAGを用いたSUMO修飾タンパク質の抗体不要検出法。哺乳類培養細胞と線虫卵母細胞での可視化技術を解説し、がんや神経変性疾患におけるSUMOの役割理解に貢献します。

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我々は彼らのサポートのために Kerscher ラボのすべてのメンバーに感謝したい, 原稿の批判的な読書のためのナタリー・グエン, シーケンシングのためのリディア Epp.この作品は、コモンウェルス研究商業化ファンド MF16-034-LS に支持されています。W & M 学生の研究支援は、ベイリー・ヒューストン研究基金によって提供され、チャールズ・センターは RY と CH にフェローシップを表彰した。

1. 組換え KmUTAG-FL 相撲捕集タンパク質を用いた固定組織培養細胞における相撲検出
<ol><li>6ウェル TC プレートの 22 mm の丸カバースリップの組織培養細胞を 70% – 80% のコンフルエントになるまで成長させます。6ウェルプレートでステップ 1.2 ~ 1.8 を実行します。</li>
	<li>DPBS 1ml (ダルベッコ改変のリン酸緩衝生理食塩水) で細胞を簡単に洗浄する</li>
	<li>固定のために、4% パラホルムアルデヒド (PFA) 溶液 (DPBS で希釈) の新鮮な溶液を調製します。細胞を固定するには、各ウェルに DPBS の 2 mL 4% PFA を追加します。室温で20分間細胞をインキュベートします。注: PFA を使用するすべてのステップは、ラボの安全フードで実行する必要があり、PFA は適切に配置する必要があります。</li>
	<li>プレートを nutating ながら 1 mL DPBS で固定した細胞を3倍洗浄し、各洗浄を5分間行います。</li>
	<li>細胞を透過処理には、DPBS で 0.1% トリトン X-100 で15分間インキュベートします。</li>
	<li>プレートを nutating ながら 1 mL DPBS で細胞を3倍洗浄し、各洗浄は5分間</li>
	<li>10の s の 0.1 M のグリシン-HCL (pH 2.0) の500μ l の細胞をインキュベートし、その後、15倍の相撲プロテアーゼバッファー (SPB) の500μ l で pH を直ちに中和します。</li>
	<li>Nutating プレート、5分、各洗浄しながら、1 mL DPBS の細胞を3倍に洗います</li>
	<li>井戸からカバースリップを取り出し、湿度室に置きます。次に、カバースリップのインキュベーションを次のように進めます。<ol>
<li>UTAG-fl 染色のみ: 1 μ g UTAG を、チューブ内に 5mm TCEP を含む 1x SPB の100μ l で混合し、カバースリップ上の細胞にミックスをピペットで入れ、室温で湿度チャンバ内で1時間インキュベートします。</li>
		<li>必要に応じて、UTAG および抗 SUMO1 抗体共染色のために、以下を続行する。<ol>
<li>チューブ1μ g UTAG および0.5 μ l SUMO2/3 8A2 (開発研究ではハイブリドーマバンク9) を100μ l のブロッキングバッファーに入れ、ミックスをカバースリップにピペットで移し、室温で1時間インキュベートします。</li>
			<li>1回の洗浄で200μ l DPBS、5分間カバースリップで細胞を洗浄します。</li>
			<li>チューブ0.5 μ l 抗マウスアレクサ Fluor 488 共役抗体を100μ l ブロッキングバッファーに混合し、カバースリップに混合物をピペットで移し、室温で1時間インキュベートします。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>カバースリップを洗浄するには、各カバースリップにピペット200μ l の DPBS を入れ、10分間放置します。洗浄をさらに2回繰り返します。</li>
	<li>最後の洗浄からカバースリップを削除し、取り付け媒体の滴で、事前に洗浄された顕微鏡のスライド上にそれを反転させます (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>顕微鏡で見る前に-20 ° c のフリーザーで一晩保管してください。DAPI (DNA)、テキサス・レッド (kmUTAG)、および Alexa Fluor 488 (オプションの SUMO2/3 共染色が行われている場合) に適したフィルターセットを使用して、可視化します。</li>
</ol>2. UTAG を使用して固定線虫腺の相撲検出
<ol><li>成人 hermaphrodites を、ポリ L-リジンで被覆されたプラス帯電スライド上の8μ l 液滴の卵緩衝液14に移す。27.5 G 針を使用して、ワームから生殖腺を解放します。抗体ラベリングまたは UTAG-fl ラベリングを続行します。</li>
	<li>抗体標識サンプルについては、次の手順に従います。<ol>
<li>液体窒素中でサンプルを凍結クラックし、Coplin 瓶内で-20 ° c のメタノール中で一晩固定します。</li>
		<li>また、Coplin では、1個の PBS でスライドを3回洗浄し、その後、0.5% BSA および 0.1% トゥイーンスパンを含む PBS で20分間ブロックします。</li>
		<li>試料を覆う各スライドに30μ l の抗相撲6F2 抗体 (1:10) を加えます。4° c の湿度室で一晩インキュベートします。 注: 相撲6F2 はハイブリドーマバンク15の発達研究から得られた。</li>
		<li>Coplin 瓶の中で、1個の PBS で2分間スライドさせると、30μ l の DyLight 488 ヤギ抗マウス二次抗体 (1:200) を室温の湿度室で1.5 時間、試料を覆い、インキュベートします。</li>
		<li>Coplin の瓶で、1個の PBS で2分間スライドさせることで、dH20 で素早くディップし、取り付け媒体でスライドをマウントします (「材料の表」を参照)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>KmUTAG-fl ラベリングについては、次の手順に従ってください。<ol>
<li>細胞を固定するには、最終濃度 4% PF のサンプルに 8% PF のボリュームを1つ追加します。湿度室で10分間固定し、0.1 M グリシンを有する 1x PBS を含む Coplin 瓶に少なくとも5分間スライドを移して反応をクエンチする。</li>
		<li>Coplin 瓶では、細胞を 1x PBS で5分間洗浄し、その後、10分間 0.1% トリトン X を含む 1x PBS 中のサンプルを透過処理します。</li>
		<li>Coplin 瓶を 1x PBS で5分以上洗浄し、スライド上のサンプルに 0.1 M グリシン-HCl (pH = 2.0) の200μ l を10秒間添加します。すぐに pH を中和するために 10x SPB の200μ l を加えてください。</li>
		<li>スライドを Coplin 瓶に入れた 1x PBS で5分間洗浄します。</li>
		<li>ウォッシュとピペットからスライドを削除し、100μ l の 1x SPB + 5mM TCEP を線虫の UTAG の2μ g を含む、スライド上の虫に、揺れなしで1時間湿度室でインキュベートします。</li>
		<li>スライドを Coplin ジャーに戻し、1x PBS で15分間洗浄します。</li>
		<li>スライドを洗浄から取り出し、実験室用ワイプを使用してサンプルの周囲を乾燥させてから、5μ l の取り付け媒体 (材料の表を参照) でスライドを取り付けます。スライドは4° c で保管してください。DAPI (DNA)、テキサス・レッド (kmUTAG)、DyLight 488 (SUMO2/3) に該当するフィルター・セットを使用して可視化します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kerscher, O., Felberbaum, R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+proteins+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins.</a> Cell and Developmental Biology. 22, 159-180 (2006).</li>
<li>Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKerscher%2C+O+%22SUMOylation%22">SUMOylation</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. 1-11 (2016).</li>
<li>Hay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO%3A+a+history+of+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">SUMO: a history of modification.</a> Molecular Cell. 18 (1), 1-12 (2005).</li>
<li>Fu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+SUMO-specific+protease+2+induces+mitochondria+mediated+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Disruption of SUMO-specific protease 2 induces mitochondria mediated neurodegeneration.</a> PLoS Genetics. 10 (10), e1004579-e1004579 (2014).</li>
<li>Zhang, H., Kuai, X., Ji, Z., Li, Z., Shi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-expression+of+small+ubiquitin-related+modifier-1+and+sumoylated+p53+in+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+biochemistry+and+biophysics%22%5BJournal%5D)">Over-expression of small ubiquitin-related modifier-1 and sumoylated p53 in colon cancer.</a> Cell biochemistry and biophysics. 67 (3), 1081-1087 (2013).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-specific+protease+1+promotes+prostate+cancer+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">SUMO-specific protease 1 promotes prostate cancer progression and metastasis.</a> Oncogene. 32 (19), 2493-2498 (2013).</li>
<li>Karami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+SUMO-Protease+SENP7S+Regulates+%CE%B2-catenin+Signaling+and+Mammary+Epithelial+Cell+Transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Novel SUMO-Protease SENP7S Regulates β-catenin Signaling and Mammary Epithelial Cell Transformation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 46477(2017).</li>
<li>Pelisch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SUMO-Dependent+Protein+Network+Regulates+Chromosome+Congression+during+Oocyte+Meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A SUMO-Dependent Protein Network Regulates Chromosome Congression during Oocyte Meiosis.</a> Molecular Cell. 65 (1), 66-77 (2017).</li>
<li>Zhang, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-2%2F3+modification+and+binding+regulate+the+association+of+CENP-E+with+kinetochores+and+progression+through+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">SUMO-2/3 modification and binding regulate the association of CENP-E with kinetochores and progression through mitosis.</a> Molecular Cell. 29 (6), 729-741 (2008).</li>
<li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+crisis%3A+Blame+it+on+the+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+News%22%5BJournal%5D)">Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies.</a> Nature News. 521 (7552), 274-276 (2015).</li>
<li>Wang, Z., Prelich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+of+a+transcriptional+regulator+by+SUMO-targeted+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quality control of a transcriptional regulator by SUMO-targeted degradation.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (7), 1694-1706 (2009).</li>
<li>Li, S. J., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+protease+required+for+cell-cycle+progression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A new protease required for cell-cycle progression in yeast.</a> Nature. 398 (6724), 246-251 (1999).</li>
<li>Peek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO+targeting+of+a+stress-tolerant+Ulp1+SUMO+protease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">SUMO targeting of a stress-tolerant Ulp1 SUMO protease.</a> PLoS ONE. 13 (1), e0191391(2018).</li>
<li>Edgar, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+13+Blastomere+Culture+and+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 13 Blastomere Culture and Analysis.</a> Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).</li>
<li>Pelisch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+SUMO+modification+regulates+mitotic+chromosome+assembly+and+cell+cycle+progression+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Dynamic SUMO modification regulates mitotic chromosome assembly and cell cycle progression in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 5 (1), 769(2014).</li>
<li>Dillingham, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+single-stranded+DNA+binding+protein+as+a+probe+for+sensitive%2C+real-time+assays+of+helicase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fluorescent single-stranded DNA binding protein as a probe for sensitive, real-time assays of helicase activity.</a> Biophysical Journal. 95 (7), 3330-3339 (2008).</li>
<li>Ruckman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%27-Fluoropyrimidine+RNA-based+aptamers+to+the+165-amino+acid+form+of+vascular+endothelial+growth+factor+%28VEGF165%29.+Inhibition+of+receptor+binding+and+VEGF-induced+vascular+permeability+through+interactions+requiring+the+exon+7-encoded+domain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">2'-Fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165). Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20556-20567 (1998).</li>
<li>Hughes, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+specific+inhibitors+of+SUMO-1-+and+SUMO-2%2F3-mediated+protein-protein+interactions+using+Affimer+%28Adhiron%29+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Generation of specific inhibitors of SUMO-1- and SUMO-2/3-mediated protein-protein interactions using Affimer (Adhiron) technology.</a> Science Signaling. 10 (505), eaaj2005(2017).</li>
<li>Lopata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affimer+proteins+for+F-actin%3A+novel+affinity+reagents+that+label+F-actin+in+live+and+fixed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6572(2018).</li>
<li>Gilbreth, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoform-specific+monobody+inhibitors+of+small+ubiquitin-related+modifiers+engineered+using+structure-guided+library+design%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isoform-specific monobody inhibitors of small ubiquitin-related modifiers engineered using structure-guided library design.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7751-7756 (2011).</li>
<li>Berndt, A., Wilkinson, K. A., Heimann, M. J., Bishop, P., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+the+properties+of+SUMO1-specific+monobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of the properties of SUMO1-specific monobodies.</a> Biochemical Journal. 456 (3), 385-395 (2013).</li>
</ol>

組換え kmUTAG 試薬は、Kerafast.com を介して研究コミュニティに提供される。

ここでは、固定された哺乳動物細胞における相撲の機能研究のための組み換えタンパク質である kmUTAG の使用について紹介し、線虫生殖腺を解剖した。KmUTAG は、相撲をコンジュゲートしたタンパク質と相撲チェーンを認識し、トラップするストレス耐性の pan 相撲特異的試薬です。相撲の三次構造が高度に保存されているため、追加モデルや非モデル系からの相撲の変種を kmUTAG 試薬で分析できる可能性が高い。そのため、KmUTAG-fl は、従来の抗体染色プロトコルのための有用な代替または二次試薬を表すことができる。
炭水化物の検出のためのレクチンと同様にタンパク質のインビボ標識のためのアプタマーヌクレオチドおよび affimer ペプチドを含む非抗体代替の使用のための十分な前例があります16,17,18 、19。さらに、affime...

この方法の目的は、組換え相撲捕獲 UTAG (ULp ドメインタグ) タンパク質を用いて、相撲共役タンパク質の研究と分析を容易にすることである。以下に詳述するように、UTAG は、他の試薬の代わりに、相撲修飾タンパク質を精製、検出、および視覚化するためのアプローチを使用することができます。成長条件に応じて、細胞は、相撲または相撲の鎖で修飾された数百または数千のタンパク質を含むことができる (レビューのために Kerscher et al. 20061および Kerscher 20162を参照)。これは、特に特定の sumoylation の標的の一部分のみが実際に改変された3であるため、特定の相撲修飾タンパク質の機能解析にとってかなりの困難を表している。転写調節、タンパク質の恒常性、細胞ストレスへの反応、有糸分裂と減数分裂の間のクロマチンのリモデリングなどの重要な細胞プロセスにおけるそれらの役割に加えて、;現在では、相撲、相撲改変タンパク質、および相撲の経路構成要素も、癌や神経変性疾患などの病理のためのバイオマーカーとして可能性があることが十分に明らかになっています4,5,6 、7。これは、さまざまな細胞およびサンプルにおける相撲修飾タンパク質の検出と機能解析のための、堅牢で信頼性が高く、入手しやすいツールと革新的なアプローチの必要性を強調しています。
多くのシステムにおいて、相撲特異的抗体は、相撲修飾タンパク質8,9の検出、分離および機能分析のための選択の試薬です。しかしながら、いくつかの商業的に入手可能な相撲特異的抗体は、高価であり、量または可用性において制限され、乱暴に可変親和性および交差反応性を示す傾向があり、そしていくつかの例では再現性10を欠く。別のアプローチとしては、形質転換された細胞や生物におけるエピトープタグ付き相撲の発現があるが、エピトープタグを相撲に結びつけることは、タンパク質標的11への共役を人為的に下げる可能性がある。さらに、エピトープは、未変換の細胞または組織が評価される場合には有用ではない。
Ulp1 は、相撲前駆体と desumoylates 相撲共役タンパク質12の両方を処理するs. セレビシエから保存された相撲プロテアーゼである。UTAG 試薬は、Ulp1's 相撲加工における触媒性システイン (C580S) の変異が相撲の切断を防ぐだけでなく、相撲共役タンパク質を高いものとして偶然という観測に基づいて開発されました。アビディティ12.簡単にするために、我々は、UTAG (UD タグの略) として、このカルボキシ末端末端相撲トラッピング Ulp1 (C580S) 断片を言及しました。UTAG は、相撲修飾タンパク質の単離と検出に使用される、抗相撲抗体の有用な代替手段を表す組換え汎相撲の捕捉タンパク質である。重要なことに、それは具体的には、相撲の1つまたは複数のエピトープだけでなく、ネイティブに折り畳まれた相撲を認識しています。UTAG のタンパク質安定性と相撲の結合強度の両方を向上させるために、ストレス耐性酵母Kluyveromyces marxianus (Km) から UTAG の変種を生成した。KmUTAG は、相撲-コンジュゲートをナノモルアフィニティ13と緊密に結合します。さらに、kmUTAG は、高温 (42 ° c)、還元剤 (5 mM TCEP-トリス (2-carboxyethyl) 塩酸ホスフィン)、denaturants (最大 2 M 尿素)、酸化剤 (0.6% 過酸化水素)、および非イオン性洗剤に対して耐性があります。このストレス耐性は、過酷な浄化条件と長時間のインキュベーション時間の間に有益であり、その安定性と相撲捕獲活性を保証します。しかし、KmUTAG の相撲捕獲活動は、システイン修飾試薬やイオン性洗剤、完全に変性したタンパク質抽出物とは互換性がありません。KmUTAG の顕著な親和性および特性は、この試薬が複数の種に sumoylated タンパク質の研究のための標準的なレパートリーの一部となる可能性があることを示す。
ここでは、組換え蛍光 mCherry-KmUTAG 融合タンパク質 (kmUTAG) を使用して、哺乳動物細胞および線虫における相撲修飾タンパク質を検出する簡単な方法を提供します。

<table><tbody><tr><td>16% パラホルムアルデヒド (ホルムアルデヒド) 水溶液</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェル 細胞培養プレート</td><td>ジェネシー サイエンティフィック/オリンパス プラスチック</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>アレクサ フルーア 488 アフィニピュア ヤギ 抗マウス IgG (H+L)</td> <td>ジャクソン イムノリサーチ</td><td>115-545-003</td><td>マウス モノクローナル抗体 DPBS の二次抗体として使用</td></tr><tr><td>、カルシウムなし、なしマグネシウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>Gibco 14190144</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 488 コンジュゲート アフィニピュア ヤギ アンチムー IgG (H+L)</td> <td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-485-146</td><td>マウスモノクローナル抗体の二次抗体として使用</td></tr><tr><td>成長用フィッシャーブランド カバーグラス</td> フィ<td>ッシャーブランド</td><td>12545101</td><td></td></tr><tr><td>FLUORO-GEL II と DAPI</td><td>、電子顕微鏡 Sciences</td><td>50-246-93)</td><td>ステップ1.11の封入剤</td></tr><tr><td>FLUORO-GEL with DABCO</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17985-02</td><td>with DAPI added to 1 & micro;g/mL;ステップ 2.2.5</td></tr><tr><td>Glycine-HCl</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP3815</td><td></td></tr><tr><td>Glycine-HCl</td><td>ACROS Organics</td><td>6000-43-7</td><td></td></tr><tr><td>KmUTAG-FL</td><td>Kerafast</td><td></td><td>KmUTAG 試薬は、Kerafast.com</td></tr><tr><td>Oneblock Western-CL ブロッキングバッファー</td><td>Prometheus</td><td>20-313</td><td></td></tr><tr><td>PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution</td><td>Fisher で入手できますBioReagents</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>PNT2細胞株</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95012613</td><td>正常な前立腺上皮はSV40で不死化しました。</td></tr><tr><td>pSPOT1</td><td>(ChromoTek GmbH)</td><td>ev-1</td><td>https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf</td></tr><tr><td>SUMO 6F2</td><td>DSHB</td><td>SUMO 6F2</td><td>SUMO 6F2 は、Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2)</td></tr><tr><td>SUMO protease buffer [10x]</td><td></td><td></td><td>500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl</td></tr><tr><td>SUMO-2 抗体 8A2</td><td>DSHB</td><td>SUMO-2 8A2 によって DSHB に寄託されました。</td><td>SUMO-2 8A2 は Matunis, M. によって DSHB に寄託されました (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2)</td></tr> <tr><td>TCEP-HCL</td><td>GoldBio</td><td>51805-45-9</td><td>5mM</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>9002-93-1</td><td>DPBS/PBS の 0.1% での透過処理に使用 (ワーム用)</td></tr></tbody></table>

蛍光相撲捕集タンパク質を用いた sumo 修飾タンパク質の局在化

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

ここでは、哺乳動物細胞および線虫卵細胞におけるタンパク質およびそのサブ細胞局在の sumoylation を研究する新規な方法を提示している。この方法は、組換え改変された相撲捕集タンパク質断片を利用し、kmUTAG は、ストレス耐性出芽酵母Kluyveromyces marxianusの Ulp1 相撲プロテアーゼに由来する。我々は、抗体を使用せずに様々なモデルシステムで sumoylation を研究する目的で、kmUTAG の特性を適応してきた。相撲の研究のために、KmUTAG は抗体ベースのアプローチと比較するといくつかの利点があります。このストレス耐性の相撲捕集試薬は、組換えに生産され、多くの種から天然の相撲アイソフォームを認識し、かつ市販の抗体とは異なり、自由で非抱合型相撲に対する親和性の低下を示す。ここに示された代表的な結果は、哺乳動物組織培養細胞および線虫卵子における相撲コンジュゲートの局在を含む。

KmUTAG-fl は、組み換え、mCherry タグ付きの相撲トラッピングタンパク質です。KmUTAG を作製するために、コドン最適化された mCherry kmUTAG を pSPOT1 細菌過剰発現プラスミドにクローニングした (図 1)。誘導後、kmUTAG タンパク質をスポットトラップ上で精製し、溶出し、さらに使用するまで凍結した。KmUTAG の相撲捕獲活動を確実にするために、SUMO1 に結合したビーズと、相撲猫融合タンパク質の沈殿 (図には示されていないが、前の作業13を参照してください) への拘束力を確認しました。
固定 PNT2 細胞と共にインキュベートされた KmUTAG は、適切なフィルターセット (クロマ) と、Epifluorescent ツァイス Axioplan 顕微鏡上の100x 油浸目的 (<strong cl...

相撲は必須で高度に保存された、小さなユビキチンのような修飾タンパク質です。このプロトコルでは、ストレス耐性組換え相撲捕捉タンパク質 (kmUTAG) を使用して、ネイティブ、タグなしの相撲コンジュゲート、およびさまざまな種類の細胞での局在を可視化することを説明しています。

蛍光相撲捕集タンパク質を用いた SUMO 修飾タンパク質の局在化

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

このプロトコルの意義は、様々な真核細胞におけるタンパク質修飾体のSUMOの検出に新しい蛍光SUMOトラップUTAGタンパク質を用いることが重要である。この技術の主な利点は、哺乳類組織培養および線虫性腺を含む様々な細胞におけるSUMOの抗体を含まない検出のための簡単なプロトコルである。SUMOはがんや神経変性疾患において重要な役割を果たしており、SUMO改変タンパク質の検出と機能解析のための堅牢で信頼性の高いツールの必要性を強調しています。SUMOは高度に保存されているため、蛍光SUMOトラップUTAGタンパク質を使用して、多くの異なる生物で共役スモを標識することができます。このビデオは、哺乳類細胞での使用を示しています。また、全文は線虫の卵母細胞での使用について説明する。この技術の視覚的なデモンストレーションは、染色およびSUMO検出前の細胞の治療のための重要なヒントを提供する。まず、70〜80%コンフルエントまで6ウェルTCプレートの22ミリメートルの丸いカバースリップで選択した組織培養細胞を成長させます。1ミリリットルのDPBSで細胞を短時間洗います。細胞を固定するには、新鮮な4%PFAとDPBSの2ミリリットルを各ウェルに加えます。室温で20分間細胞をインキュベートする。固定細胞を1ミリリットルのDPBSで5分間3回洗浄し、プレートを仕上げながら洗浄します。細胞を透過し、DPBSで1%トリトンX-100で15分間インキュベートする。前のように、細胞をもう一度洗います。500マイクロリットルの1モルグリシンHCL pH2を10秒間インキュベートします。次に、10X SUMOプロテアーゼバッファー、またはSPBの500マイクロリットルですぐにpHを中和します。以前のように細胞を洗浄した後、ウェルからカバースリップを取り除き、湿度チャンバーに入れます。UTAG-FL染色の場合のみ、チューブ内に5ミリモルTCEPを含む1X SPBの100マイクロリットルとUTAG-FLの1マイクログラムを混合してください。次いで、カバースリップ上の細胞にピペットを混ぜ、湿度チャンバ内で1時間室温でインキュベートする。カバースリップを洗浄するには、各カバースリップに200マイクロリットルのDPBSをピペットし、10分間所定の位置に残します。さらに2回洗い流します。最後の洗浄からカバースリップを取り外し、取り付け媒体の滴で事前に洗浄された顕微鏡スライドに反転します。顕微鏡で見る前に、サンプルを摂氏20度の冷凍庫に一晩保管してください。DAPI とテキサスレッドの適切なフィルター セットを使用してセルを視覚化します。SUMO と固定線虫腺のラベル付け方法に関するプロトコルの全文を参照してください。哺乳類細胞の標識は非常に簡単ですが、線虫卵母細胞を標識するには、生殖腺解剖の事前トレーニングが必要です。固定PMT2細胞をインキュベートしたKmUTAG-FLは、明確な核染色を示した。拡散核染色と明確な核病巣の両方が見えました。核局在化はDAPIとの共染色を用いて確認した。KmUTAG-FLのSUMO捕捉活性と一致して、核局在パターンはSUMO23染色を連想させる。抗SUMO23 8A2抗体による共染色により、SumO23シグナルによるKmUTAG-FLの共局在化が確認された。これは、哺乳動物細胞におけるSUMO23を検出するKmUTAG-FLの有効性を検証する。卵母細胞産生成人雌雄同体cから単離された生殖腺。エレガンス線虫は抗SUMO抗体で標識した。以前の報告と一致して、抗SUMO抗体は、初期筋性気相卵母細胞の核プラスムに最初に局在した。その後、核封筒が分解し、染色体がメタフェーズプレートに向かってコングレスされると、ペアのホモログの中央環複合体に再配布されました。並行して、KmUTAG-FLで標識された生殖腺も同様のパターンを明らかにした。KmUTAG-FLは、卵母細胞が始まり、核エンベロープ分解のプロセスを完了するにつれて、核内皮の標識から環状複合体に集中することに移行した。これらの結果は、Cの筋症およびSUMO関連プロセスの分析に役立つツールとしてKmUTAG-FLを検証する。エレガンスとおそらく他の線虫。固定を行う間、新鮮なパラホルムアルデヒドと短い固定時間を使用して、SumOをネイティブに折りたたんでKmUTAGで認識できるようにしておくことが重要です。SUMOの三次構造は高度に保存されているため、追加モデルおよび非モデル系のSUMO変異体をKmUTAG-FL試薬で解析できる可能性が非常に高い。現在、この新しい蛍光相撲捕捉UTAGタンパク質を用いて、細胞ストレス時のSUMOの機能を研究しています。最後に、固定パラホルムアルデヒドを使用するすべてのステップは、実験室の安全フードで行われるべきであり、この試薬は適切に処分されなければならないことに注意してください。

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単一の膜タンパク質生きた哺乳類細胞の細胞内小器官のマルチカラー ローカリゼーション顕微鏡

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蛍光相関分光法を用いたタンパク質凝集の検出

学ぶ蛍光相撲捕集タンパク質kmUTAGを用いたSUMO修飾タンパク質の抗体不要検出法。哺乳類培養細胞と線虫卵母細胞での可視化技術を解説し、がんや神経変性疾患におけるSUMOの役割理解に貢献します。

蛍光相撲捕集タンパク質を用いた SUMO 修飾タンパク質の局在化

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