Name: 細胞外小胞の保存性の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 学ぶ細胞外小胞の保存性評価プロトコル。グルクロニダーゼを外因性マーカーとして導入し、AF4を用いて精製と酵素活性測定を行う。異なる親細胞由来の小胞の保存安定性を比較し、治療応用への可能性を評価する。

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ドイツ連邦教育研究省からの NanoMatFutur ジュニア研究プログラム (グラント番号 13XP5029A) は、この作業をサポートしました。マクシミリアン・リヒターは、Studienstiftung ・デ・ Deutschen Volkes (ドイツのアカデミック奨学財団) によって、博士課程のフェローシップを通じてサポートされました。

1. 細胞培養と細胞馴化培地の製造
<ol><li>一般に、それぞれの細胞株に必要な個々の条件下で細胞を培養する。</li>
	<li>無血清条件下または EV 枯渇胎児ウシ血清 (FBS) を含む培地中で24-72 の細胞を培養する。 注: EV 枯渇 FBS を使用する場合、血清を効率よく枯渇させることが証明された方法を採用し、ウシ血清由来 EVs26による汚染を防止する。</li>
	<li>フラスコから培地を回収する。10分間 300 x gで遠心分離し、細胞をペレットにする。ペレット化された細胞を乱すことなく、慎重に細胞調節培地 (CCM) を収集します。好ましくは、CCM を直接使用したり、4° c で一晩保存したりする。 注: 新鮮な生産された CCM を使用することが常に好ましいです。長期間の保管を回避できない場合は、関連するすべてのパラメータを MISEV2018 ガイドライン26に従って記録し、得られた結果の潜在的なバイアスを考慮に入れる必要があります。</li>
	<li>HUVECs のプロトコルの例<ol>
<li>FBS および他のサプリメントを含む EGM-2 培地中で 120 h の HUVEC 細胞を培養する。</li>
		<li>EBM-2 基礎培地中の任意の追加のサプリメントのない 48 h の HUVEC 細胞を培養します。.</li>
		<li>フラスコから培地を回収し、上記に示したように遠心分離ステップを行う (ステップ 1.3)。通常は、1つの EV 分離に 100 mL の培地を使用します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. CCM の超遠心よる
<ol><li>超遠心よる (UC) の直前に、3000 x gおよび4° c で15分間、CCM を遠心分離して、細胞破片と大きな凝集体を除去します。</li>
	<li>慎重に上清を UC チューブに移します。固定角度ローターを使用している場合は、遠心分離機のチューブの向きをマークして、UC 後の EV ペレットの取り出しを容易にします。12万 x gで2時間遠心分離し、k ファクターの259.4 を用いた。</li>
	<li>UC の後に、血清学的 pipet を使用して上清を慎重に廃棄し、ペレット化された Ev の乱れを回避する。 注: ペレットは非表示になっている可能性があります。</li>
	<li>1番目のチューブに0.2 μ m のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 200 μ l を加え、PBS と残留上澄みを使用してペレットを上下にピペットで再懸濁します。得られた EV 懸濁液をそれぞれのサンプルの次のチューブに移し、再懸濁に使用します。この方法を進めて、サンプルのすべての Ev を、約300-350 μ l の最終容量に再懸濁ます。</li>
	<li>再懸濁後、ナノ粒子追跡分析 (NTA) によって粒子の存在を確認する。以下の設定など、特定の EV タイプに最適化された設定を使用します (ステップ 2.5.1)。 注意: ガーディナー et al.27および Vestad et al.28の論文には、ev を測定するためのパラメータを最適化する方法に関する貴重な情報が含まれている。<ol>
<li>以下に説明する結果を再現するために、グリーンレーザーを搭載した器具 (例えば、NanoSight LM14) を使用する。1.0 の画面ゲインと13のカメラレベルで30秒の3つのビデオを記録します。分析には、1.0 の画面ゲインと検出しきい値5を使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>可能であれば、ペレットをすぐに使用してください。それ以外の場合は、一晩4° c で保管してください。</li>
</ol>3. Ev へのグルクロニダーゼカプセル化
<ol><li>再懸濁したペレットに、1.5 mg/mL の最終濃度にβ-グルクロニダーゼ (PBS 中 10mg/mL) を加え、0.1 mg/mL の最終濃度にサポニン (h2o で 10Mg/ml) を加える。3 s のボルテックスでよく混ぜる。</li>
	<li>チューブを静かにフリックして、連日混合して室温で10分間インキュベートします。インキュベーション後、サイズ排除クロマトグラフィー (SEC) によって直接精製する (第5項参照)。 注: 凍結による酵素の劣化を防ぐため、解凍後にグルクロニダーゼサンプルを refreeze しないでください。</li>
</ol>4. リポソーム生産
<ol><li>Ev との比較のためにリポソームを調製するには、1, 2-dimyristoyl-glycero-3-ホスホコリン (DMPC) と 1, 2-ジパルミトイルヒドロキシプロリン-GLYCERO-ホスホコリン (DPPC) クロロホルム中の2:3 モルの割合で、最終濃度5mm を溶解する。高性能液体クロマトグラフィー (HPLC) バイアルに 1 mL アリコートを準備し、一晩乾燥させて脂質膜を形成します。 注意: クロロホルムは毒性があり、cancerogenic が疑われます。取り扱いに際しては、適切な予防措置を講じます。</li>
	<li>1.5 mg/mL グルクロニダーゼを含む PBS 1 mL で脂質膜を水分補給する。42° c に加熱し、1分間渦をして押出機アセンブリを42° c に加熱し、200 nm のポリカーボネート膜を通して脂質懸濁11x を押し出します。SEC によって直接浄化されます (セクション5を参照)。</li>
</ol>5. SEC による浄化
<ol><li>次のプロトコルを使用して SEC 列を準備します。<ol>
<li>新鮮な精製水と新しく調製した緩衝液のみを使用してください。0.2 μ m の膜フィルターを通してすべてのバッファーを濾過し、カラム内の気泡の形成を防ぐためにそれらを脱気します。</li>
		<li>SEC カラムの調製には、アガロースゲル濾過ベースのマトリックス (例えば、セファロース Cl-2b) または別の SEC 媒体を使用して、タンパク質の不純物および過剰な酵素から EVs とリポソームを分離するのに適しています。まず、培地が保存されている 20% Etoh 中溶液を取り出し、カラム内の気泡形成を防止する。このため、SEC 培地を 3000 x gに10分間遠心し、etoh 中を除去し、脱気水に交換します。</li>
		<li>(内径 10 mm) のガラス柱に、SEC 培地を 15 mL マークに充填します。 注: 異なる寸法のカラムでは、ボリュームが異なります。ジェルが完全に落ち着くようにしてください。</li>
		<li>ランの前に、平衡化は PBS の少なくとも2つのカラム量を持つカラムを使用します。カラムを保存するには、まず1列の水量で洗浄し、その後に 20% の Etoh 中の少なくとも2つのカラム容量を続けます。保管後、PBS で平衡化する前にカラムを1列の水で最初に洗ってください。</li>
		<li>1回の分離で最大400μ l の EV またはリポソーム懸濁液を使用できます。1Ml の端数を収集します。SEC の後、精製された EVs を保存するか (セクション7を参照)、またはそれらをグルクロニダーゼアッセイに適用します (セクション6を参照)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>EVs とリポソームの混入タンパク質と遊離グルクロニダーゼの分離を確認します。この目的のために、収集されたフラクションの粒子濃度をタンパク質濃度およびグルクロニダーゼ活性と相関させる。<ol>
<li>NTA による粒子濃度の評価 (2.5 を参照)</li>
		<li>Bicinchoninic 酸 (BCA) アッセイまたは別の適切なタンパク質定量アッセイによってタンパク質含有量を評価します。メーカーのプロトコルに従ってアッセイを行ってください。</li>
		<li>グルクロニダーゼアッセイによってグルクロニダーゼ活性を評価します (セクション6を参照)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>必要に応じて、透過型電子顕微鏡 (TEM) および走査電子顕微鏡 (SEM) により EV 形態を評価する。<ol>
<li>TEM サンプルの調製のために、10μ l の EV 懸濁液を TEM グリッドに添加し、10分間インキュベートし、次いで、濾過紙を使用して余分な液体を除去する。10μ l の 4% パラホルムアルデヒドで10分間固定を行い、過剰をブロットします。水で3倍洗ってください。1% 蛍光体-tungstic 酸ハイドレートの30μ l で 20 s インキュベーションすることにより小胞を染色する。過剰を吸い取り、一晩で小胞を乾かす。TEM で可視化する。 注意: ホスホ-tungstic 酸は高度に苛性です。したがって、皮膚や目を保護します。</li>
		<li>SEM の場合は、あらかじめ用意されていた TEM サンプルをカーボンディスク上に固定し、50 nm 厚の金層でスパッタします。SEM による視覚化。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. グルクロニダーゼアッセイ
<ol><li>粒子数と酵素活性とを相関させることによって異なるサンプルと貯蔵条件との間の比較を可能にするために、まず NTA による試料の粒子濃度を測定する (ステップ2.5 を参照)。</li>
	<li>フルオレセイン-β-D-グルクロニドの実用的なソリューションを調製する化合物の1μ l (H2o/mL で 10ML) PBS の199μ l を添加します。この溶液の25μ l を精製 EVs の125μ l に加え、8.3 μ g/mL の最終濃度を得る。サンプルを黒の96ウェルプレートに Pipet ます。480 nm を励起と 516 nm を発光波長として使用し、プレートリーダーで時間点 0 h を測定します。</li>
	<li>蒸発を最小限に抑え、37° c で 18 h の暗所でインキュベートするために、プレートをしっかりと覆います (例えば、PCR プレートに使用される透明なプラスチック箔で)。ステップ6.2 にリストされているプレートリーダーのパラメータを使用して、フルオレセイン生産を測定します。</li>
</ol>EVs およびリポソームの貯蔵
注: すべての保管目的のために、吸着による EV 損失を低減するために、低結合チューブを使用することをお勧めします。
<ol><li>以下の代表的な結果を再現するには、このセクションのパラメータに従ってください。400μ l の EV 懸濁液からなるサンプルを使用します。<ol>
<li>4° c または-80 ° c で保管するか、下記の手順に進んでください。</li>
		<li>Ev を Lyophilize。<ol>
<li>最後の濃度 4 mg/mL までのトレハロース (40 Mg/Ml の h2o) を精製された ev に添加します。サンプルを1時間以上-80 ° c で凍らせます。</li>
			<li>次のパラメータを使用してサンプルを Lyophilize します。主乾燥のために、棚温度を15° c に設定し、圧力 0.180 mbar に 46 h のために乾燥するためにサンプルを残してください。最終的な乾燥のためには、棚温度を25° c に、圧力を 0.0035 mbar に設定し、サンプルを2時間乾燥させたままにしておきます。凍結乾燥したサンプルを4° c で保管してください。</li>
			<li>サンプルを水分補給するには、最初に存在する EV 懸濁液の量 (通常は400μ l) に等しい h2o を追加します。水分補給のためにバッファを使用しないでください。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. 保管後の分析
<ol><li>酵素活性を評価するために、まず、貯蔵中に EVs から漏出した可能性のある遊離グルクロニダーゼを除去する。SEC (ステップ5参照) または非対称フローフィールドフロー分別 (AF4) によって行われる精製の追加ステップによってこれを達成してください (ステップ8.1.2 を参照)。 注: 両方の方法は、EV サンプルの希釈につながることをお勧めします。したがって、NTA 定量化限界を下回るのを避けるために、保管前に十分な EV 濃度を使用してください。秒または AF4 による粒子の1:10 希釈を期待してください。<ol>
<li>SEC の精製については、前述のプロトコルに従ってください (セクション5を参照)。</li>
		<li>AF4 精製を行う。<ol>
<li>350μ m スペーサーと 30 kD 分子量カットオフセルロース膜を備えた小型チャンネルを使用して装置をセットアップします。HPLC ポンプと AF4 チャネルの間に0.1 μ m の細孔サイズフィルターを設置します。新規に調製した0.1 μ m フィルタ PBS を移動相として使用し、光散乱検出器の粒子負荷とノイズを低減します。</li>
			<li>280 nm に設定された UV 検出器を使用してタンパク質を検出します。粒子を検出するには、レーザーを 658 nm に設定したアングル光散乱を使用します。</li>
			<li>次の run メソッドを使用します。1ミリリットル/分のフォーカスフローで1分間プレフォーカス;その後、0.2 mL/min のレートでサンプルの300μ l を注入し、焦点フローを10分間維持します。注射後、8分間にわたって 2 mL/min から 0.1 mL/min に減少するクロスフローを適用しながら、1 mL/min でサンプルを溶出します。クロスフローなしでさらに10分溶出します。12.5 分後に開始し、27分まで継続1ml の端数を収集します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>上述のようにグルクロニダーゼアッセイを実施する (第6項参照)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>サイズおよび濃度を評価するために、上述のように NTA を使用する (ステップ2.5 を参照)。</li>
	<li>任意に、貯蔵後の Ev の形態を評価するために TEM および SEM を実行する (5.3 を参照のこと)。</li>
</ol>

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作者は何も開示することはありません。

本稿では、異なる貯蔵条件下での Ev の安定性を研究するための包括的なプロトコルを紹介する。機能読み出しと EVs の物理化学的なパラメータの評価としてカプセル化されたグルクロニダーゼの組み合わせにより、プロトコルは、EVs の簡単な保存安定性評価と異なるセルからの EVs の比較を可能にします行。SEM および TEM は相補的な方法として、単粒子レベルでの EVs の変化についての洞察を可能にする。ここで示した結果は、凍結保護剤のない凍結乾燥により Ev とリポソームを凝集させる傾向があった (図 6)。しかし、これは SEM 実験でのみ観察された。この凍結保護剤はトレハロースで保存されたサンプルでは行われなかったが、この文献では実際に EVs29の凝集が減少する可能性があることを示唆している。また、特定の貯蔵条件が EV サイズ、回収率および封入された分子に影響する場合は、評価することも可能です。このような効果は、HUVEC Ev について得られた結果によって例示される (図 1)。4° c および-80 ° c の...

EVs は、ほぼすべてのセルタイプによって生成される膜結合ナノ粒子です。哺乳類細胞の場合、EVs は、異なる生産経路1、2を持つ2つの主要なグループに細分化することができます。膜小胞は、およそ100〜 1000 nm の大きさの範囲で、細胞膜からの直接出芽によって産生される。エキソソームは、サイズが 30-200 nm で、その後、細胞膜と融合して一度に複数のエキソソームを放出するエンドソームに、内側の出芽によって形成された多体に由来する。これらの小胞の主な機能は、細胞3間の情報の輸送である。この目的のために、RNA、DNA、タンパク質などの貨物が積極的に選別されます。EVs は、健康と病気の状態の両方の影響で、ターゲットにさまざまな効果を伝えることができます。一方では、組織再生、抗原提示、または抗生物質効果などのポジティブな効果を媒介し、治療薬としての開発の目標となります4,5.反対側では、EVs は、腫瘍血管新生6を促進し、ストレス応答7において傍観効果を誘発し、そして自己免疫疾患8および炎症性疾患9において役割を果たす可能性がある。したがって、彼らは多くの病理学的効果をよりよく理解するための重要なコンポーネントであるかもしれません。しかし、癌10、11、12および心血管障害13などのマニホールド疾患における変化した ev の存在、および血液および尿におけるそれらの容易なアクセス性は、それらを理想的にするバイオ マーカー。最後に、それらの良好な生体適合性14およびその固有のターゲティング能力は、薬物送達15についての EVs も興味深いものにする。本稿では、哺乳動物細胞由来の Ev の保存性を評価するためのプロトコールについて説明するが、未だ検討されていない重要な特性である。
Ev の臨床開発のために、彼らの治療効果、生産、精製、およびストレージ17の評価を含む16を乗り越えるために、まだ多くの障害があります。80° c は EV ストレージ18の金本位として広く見られているが、必要な冷凍庫は高価であり、生産から患者への要求されるコールドチェーンを維持することは困難である可能性がある。さらに、一部の報告では、-80 ° c のストレージはまだ最適に EVs を保持していないし、ev 機能19、20の損失を誘導することを示しています。凍結乾燥21、22 、または噴霧乾燥23などの他の方法が、ev の冷凍保存に潜在的な代替物として提案されている。
貯蔵安定性を評価する最適な方法は、機能アッセイまたは特定のマーカーの評価 (例えば、それらの抗菌活性19) で EVs をテストすることであろう。これは、小胞の所望の効果が知られており、EVs の1つの異なるグループが検討されるときに可能です。異なる細胞源からの EVs を比較する場合 (例えば、薬物封入のため)、または既知の機能的読み出しがない場合、ストレージによる変化を直接的に評価することはもはや不可能である。
一方、最近の特許20で示されているように、単にサイズ、粒子回収、タンパク質濃度などの物理化学的パラメータの変化を評価するだけでは、EV 活性の変化を予測するとは限らない。
ここでは、EVs の貨物のためのサロゲートとしてカプセル化されたβ-グルクロニダーゼ酵素の活性と組み合わせるそれらの物理化学的パラメータを評価することにより、EVs の保存安定性を測定するための容易に適用可能なプロトコルを提供します。酵素の装填はサポニンインキュベーションによって行われ、異なる供給源21、24、25から EVs を用いて確立される穏やかな方法である。サポニンは、EV 膜中の一過性の細孔を形成し、小胞への酵素取り込みを可能にする。不利な保管条件にさらされた場合、酵素はその活性を失う傾向があるので、それらは EVs の機能的な貨物の保存の評価のための理想的サロゲートです。
我々は、ヒト間葉幹細胞 (MSCs)、ヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVECs)、およびヒト腺癌肺胞上皮細胞 (A549) 由来の EVs へのこのプロトコルの適用が実際に大きな差異をもたらすことを実証した。異なる細胞株間の貯蔵安定性は、EV ソース21を選択する際に考慮されるべきである。

<table><tbody><tr><td>1,2 ジミリストイル-sn グリセロ-3-ホスホ-コリン (DMPC)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P2663-25MG</td><td></td></tr><tr><td>1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン (DPPC)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4329-25MG</td><td></td></tr><tr><td>225 cm&sup2; 細胞培養フラスコ</td><td>Corning</td><td>431082</td><td>25 ml の培地</td></tr><tr><td>30 kDa 再生セルロース膜</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td>1854</td><td></td></tr><tr><td>350 &micro;m スペーサー</td><td>ワイアットテクノロジーヨーロッパ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>自動フラクションコレクター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ベータグルクロニダーゼ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>G7646-100KU</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>C/4966/17</td><td></td></tr><tr><td>カラムオーブン</td><td>日立ハイテクノロジーズヨーロッパ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-トレハロース二水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9531-10G</td><td></td></tr><tr><td>DAWN HELEOS II, マルチアングル光散乱検出器</td><td>&nbsp;Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>デュラポア メンブレンフィルター、PVDF,&nbsp; 0,1&nbsp;&マイクロ;メートル、47&nbsp;mm</td><td>Merck</td><td>VVLP04700</td><td>AF4</td></tr><tr><td>EBM-2</td><td>Lonza Verviers, S.p.r.</td>のバッファーの調製に使用<td>CC-3156</td><td>内皮細胞 増殖基礎培地、HUVEC細胞の無血清培養に使用</td></tr><tr><td>Eclipse dualtec</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGM-2</td><td>Lonza Verviers, S.p.r.</td><td>CC-3162</td><td>内皮細胞増殖培地、HUVEC細胞の正常培養に使用される</td></tr><tr><td>ELISAプレートシーラーR</td><td>&グル</td><td>クロニダーゼアッセイ用の96ウェルプレートのシーリングに使用される</td>Dシステム<td>DY992</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>フィッシャー科学</td><td>E / 0665DF / 17</td><td></td></tr><tr><td>ホルダー/加熱ブロック付き押出機セット</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000-1EA</td><td></td></tr><tr><td>フィルターサポート</td><td>リポソーム調製に使用される</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610014-1EA</td></tr> フル<tr><td>オレセインジ-&ベータ;-D-グルコロニド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>F2915</td><td></td></tr><tr><td>Gibco PBS錠剤+CA10:F36</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>ヘティッヒ ユニバーサル 320 R</td><td>アンドレアス・ヘティヒ GmbH & Co.KG</td><td></td><td>300 g で細胞をペレット化するために使用</td></tr><tr><td>ヘティヒ・ロティナ 420 R</td><td>アンドレアス・ヘティヒ GmbH & Co.KG</td><td></td><td>3000 g HUVEC細胞でより大きな破片をペレット化するために使用</td></tr><tr><td></td><td>ロンザ・ヴェルヴィエ、S.p.r.</td><td>C2517A</td><td></td></tr><tr><td>キンブル&nbsp;FlexColumn 1X30CM</td><td>Kimble</td><td>420401-1030</td><td></td></tr>凍結<tr><td>乾燥機 ALPHA 2-4 LSC</td><td>Christ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tubes, Polypropylene</td><td>VWR international</td><td>525-0255</td><td>the tubes used for all EV-handling, found than more favor than comparable products from other suppliers about particle recovery</td></tr><tr><td>Nanosight LM14 equipped with a green laser</td><td>Malvern Pananalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanosight-ソフトウェアバージョン3.1</td><td>Malvern Pananalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nucleopore 200 nmトラックエッチングポリカーボネート膜</td><td>Whatman/GE リ</td><td>ポソーム調製に使用される</td><td>110406</td></tr><tr><td>PEEKインラインフィルターホルダー</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphotungstic acid hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79690-25G</td><td></td></tr><tr><td>超遠心分離用ポリカーボネートボトル</td><td>ベックマン・コールター</td><td>355622</td><td></td></tr><tr><td>QuantiPro BCAアッセイキット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>QPBCA-1KT</td><td></td></tr><tr><td>サポニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>走査型電子顕微鏡 Zeiss EVO HD 15</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sepharose Cl-2b</td><td>GE Healthcare</td><td>17014001</td><td></td></tr><tr><td>SEM 銅カーボンフィルム付きグリッド</td><td>プラノ</td><td>S160-4</td><td></td></tr><tr><td>小型AF4チャンネル</td><td>ワイアットテクノロジー ヨーロッパ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スパッタコーター Q150R ES</td><td>クォーラムテクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ズ 透過型 電子顕微鏡 JEOL JEM 2011</td><td>オックスフォード・インスツルメンツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>タイプ45 チタン 超遠心ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>339160</td><td></td></tr><tr><td>アルティメット3000 Dionexオートサンプラー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 Dionexアイソクラティックポンプ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 Dionexオンライン真空脱気装置</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超遠心分離機 OptimaTM L-90 K</td><td>ベックマンコールター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV検出器</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman 0.2 & マイクロ;m細孔径混合セルロースフィルター</td><td>Whatman/GE Healthcare</td><td>10401712</td><td>EVおよびSECで使用されるすべてのバッファーのろ過に使用されます</td></tr></tbody></table>

細胞外小胞の保存性の評価

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

現在の研究では、細胞外小胞 (Ev) が有望な標的であり、薬剤、薬剤、担体、バイオマーカーとして利用されている。臨床開発のためには、その医薬品の活動だけでなく、その生産を評価する必要があります。この文脈では、研究は、EVs の分離、その特徴付け、およびそれらのストレージに焦点を当てています。本稿では、遺伝子操作や特定の機能アッセイを行わずに、さまざまな貯蔵条件が EVs に及ぼす影響を評価するための容易な手順を提供することを目的としています。これにより、所定の貯蔵条件下での Ev の安定性の第一印象を迅速に得ることができ、異なるセル源に由来する EVs を容易に比較することができる。安定性の測定は EVs (サイズ、粒子の集中および形態) の物理化学的な変数および彼らの貨物の活動の保存に基づいている。後者は、Ev への酵素β-グルクロニダーゼのサポニン媒介封入によって評価される。グルクロニダーゼはサロゲートとして機能し、蛍光レポーター分子の切断によって容易に定量化することができます。本プロトコルは、臨床応用に向けた EV 研究を進めるために EV 特性を最適に保持する保存条件を探索する研究者のためのツールとなりうる。

図 1は、HUVECs から分離された EVs のストレージ特性を示しています。EVs は、UC によって単離され、グルクロニダーゼは封入され、SEC の後、精製された EVs は NTA による物理化学的特性の評価を受けました。小胞のサンプルをその後 AF4 精製に供し、グルクロニダーゼ活性を測定した。
次いで、小胞体を4° c または-80 ° c で 7 d、凍結乾燥形態で4° c で保存し、後者の場合は 4% のトレハロースを添加した。貯蔵後、小胞は NTA によって再び測定され、AF4 後、粒子ごとの残りのグルクロニダーゼ活性が評価された。
AF4 の動作原理は、層流と AF4 チャネルの下部にある多孔質膜を通る直交 crossflow の組み合わせに基づいており、そのサイズに応じて粒子に影響を与えます (図 2)。より大きな粒子は膜の近くに位置する傾向があり、より小さい粒子はチャネルのさらに上に配置されます。層流の放物線状...

ここでは、細胞によって産生される天然ナノ粒子の群である細胞外小胞の貯蔵安定性を評価するために容易に適用可能なプロトコルを提示する。小胞は、モデル酵素としてグルクロニダーゼを搭載し、異なる条件下で保存されます。保存後、それらの物理化学的パラメータおよび封入酵素の活性が評価される。

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

細胞外小胞の貯蔵安定性は、その前向きの治療的使用のための重要なパラメータである。当社のプロトコルは、ストレージが小胞に与える影響を評価するための容易に適用可能なツールを提供します。我々の技術の主な利点は、外因性マーカーとしてグルクロニダーゼを導入することにより、異なる親細胞に由来する細胞外小胞がそれらの安定性に関して容易に比較されることである。非対称流量流分画(AF4)は、非常に感受性の高い化合物に対するサイズ排除クロマトグラフィー精製に対する軽度の代替物である。化合物は、チャネルで少ない純粋なストレスに遭遇するため.グルクロニダーゼは敏感な酵素であるため、居住する品質は、徹底的な計画を立て、精製と分析のステップを繰り返し実行することから利益を得ます。これらの細胞の標準的な条件に従って目的の細胞株を培養した後、上清を無血清または余分な細胞小胞枯渇培地に置き換え、細胞を細胞培養インキュベーターにさらに24〜72時間戻します。インキュベーションの終わりに、各フラスコからスーパーナタンを回収し、サンプルを遠心分離して細胞を沈降させる。ペレットを邪魔することなく、細胞調整培地を慎重に収集します。そして、再び遠心分離機を使用して、細胞の破片および大きな凝集物を除去する。その後、慎重に超遠心チューブに上清を転送します。固定角度ローターを使用する場合は、遠心分離機のチューブの向きをマークして、遠心分離後の細胞外小胞ペレットの検索を容易にします。超遠心分離の終わりに、細胞外小胞ペレットを乱すことなく慎重に上清を廃棄するために血清ピペットを使用してください。0.2マイクロメートルの200マイクロリットルで、第1の超遠心管の残留上清にPBSを濾過した。ペレットを再懸濁した後、得られた細胞外小胞懸濁液を次のチューブに移し、その後のペレットの再懸濁液を、全ての細胞外小胞ペレットが再懸濁されるまで行う。最終再懸濁ペレット溶液にβグルクロニダーゼを加え、1ミリリットル当たり1.5ミリグラムの最終濃度にします。そしてサポニンは1ミリリットル当たり0.1ミリグラムの最終濃度に。その後、3秒間ボルテックスでよく混ぜ、断続的に穏やかなフリックで10分間室温で反応を置きます。グルクロニダーゼが封入されたら、その後の精製ベシクル評価ステップをすべて同じ日に実行し、不偏な貯蔵安定性の結果を得るようにしてください。サイズ排除クロマトグラフィーカラムを、サポニンインキュベーションの直後にペレットを精製する準備ができてPBSの少なくとも2つのカラム容量と平衡化した。精製するには、最大400マイクロリットルの細胞外小胞懸濁液をカラムに加えます。その後、溶出物の1ミリリットル分を収集します。汚染タンパク質と遊離グルクロニダーゼからの細胞外小胞の分離を適合させるために、製造業者の指示に従ってビチンチオン酸アッセ

evaluation-of-the-storage-stability-of-extracellular-vesicles

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

これは、肝臓から組織外細胞小胞(EV)を分離するためのプロトコルです。このプロトコルは、コラゲナーゼ灌流を含む2段階のプロセスを記述し、その後、肝臓組織EVを分離するための差動超遠心分離を行う。...

肝臓からの組織外細胞小胞の分離

プロトコルでは、小さな細胞小胞 (EV) の表面の抗原を検出する細胞培養上清を使用のために設計された再現可能な方法について説明します。それは、CD63 と CD81 CD9、表面抗原を認識する抗体が結合したビーズを用いた特定の EV...

フローサイトメトリー法による細胞小胞細胞調節されたメディアからの解析します。

本報告書は、ミクログリアまたは血液マクロファージからの細胞外小胞(EV)単離に関する時系列的要件を強調している。ミクログリア由来EVは神経突起の伸長因子として評価され、血液マクロファージ由来EVはインビトロアッセイにおけるC6グリオーマ細胞浸潤の制御で研究された。目標は、これらのEV機能を特定の微小環境における免疫メディエーターとして理解することです。...

細胞外小胞由来免疫細胞由来の特徴と細胞環境への機能的影響の研究

ここでは、変形性関節症のモデルとして使用される軟骨外植の移動および取り込みをモニタリングするために、血小板リセート由来の細胞外小胞にラベルを付けるプロトコルを提示する。...

軟骨外植木における移動と取り込みモニタリングのための細胞外小胞の標識

本プロトコールは、シアノバクテリア培養物からの細胞外小胞の単離、濃縮、および特性評価に関する詳細な説明を提供する。異なるスケールの培養物から小胞を精製するためのアプローチ、方法論間のトレードオフ、およびフィールドサンプルを扱うための考慮事項についても議論する。...

シアノバクテリア細胞外小胞の単離と特性評価

我々は、癌性尿路上皮細胞に由来する細胞外小胞(EV)の単離および凍結破砕のためのプロトコルを提示する。凍結破壊技術は、EVの直径と形状、そしてユニークな特徴としてEV膜の内部組織を明らかにしました。これらは、EVがレシピエント膜とどのように相互作用するかを理解する上で非常に重要です。...

細胞外小胞分析のための凍結破壊電子顕微鏡

本プロトコルは、末梢血および固体組織から細胞外小胞を抽出し、その後表面抗原およびタンパク質カーゴのプロファイリングを行う方法を記載している。...

血漿および固体組織からのトレーサブルおよび機能化された細胞外小胞の単離と分析

このプロトコルは、間葉系間質細胞によって放出される細胞外小胞(EV)の選別について詳細に説明しています。特に、機器の設定と選別条件の最適化に焦点を当てています。目標は、細胞外小胞の特性を維持しながら選別することです。...

細胞外小胞単離のための適切なソーティングの設定

ここでは、Echinococcus granulosusからのin...

Echinococcus granulosusからの小さな細胞外小胞の単離と樹状細胞の取り込み

ここでは、ヒト被験者の涙や唾液などの生体液から採取された細胞外小胞(EV)の特性評価法を示します。この方法で使用されるスキャナーは、サンプルの1μLからEVの表現型、サイズ、および総粒子数を検出することができます。...

体液からの細胞外小胞の特性評価

学ぶ細胞外小胞の保存性評価プロトコル。グルクロニダーゼを外因性マーカーとして導入し、AF4を用いて精製と酵素活性測定を行う。異なる親細胞由来の小胞の保存安定性を比較し、治療応用への可能性を評価する。

細胞外小胞の保存性の評価

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