Name: マウス肝臓における胆管密度の決定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 学ぶマウス肝臓における胆管密度の定量的評価法。免疫組織化学と蛍光顕微鏡を用いて、遺伝的要因と環境要因が胆道疾患に与える影響を評価する信頼性の高いアプローチです。

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著者らは、国立衛生研究所(NIH)(R01 GM084135およびR01 DK109982)、NIH P30 DK56338の下でテキサス医療センター消化器病センターからのパイロット/実現可能性賞、およびアラギル症候群アクセラレータ賞からの支援を認めます。医療財団

すべての動物は、施設の動物ケアと使用委員会のガイドラインと承認された動物プロトコルの下でベイラー医科大学のバリア動物施設に収容されました。
1. マウス肝組織の採取
<ol><li>
肝臓収穫のためのマウスの調製
	<ol>
<li>イソファランを使用してマウスを安楽死させる。</li>
		<li>死を確実にするために、マウスの頸部脱臼を行う。</li>
		<li>肋骨ケージの約1インチ下に横切開を行います。</li>
		<li>肝臓の腹部表面全体を露出させる。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
マウス肝臓の採取
	<ol>
<li>慎重に、小さなはさみで、肝臓を腹部の他の器官に接続する靭帯を切り取る。</li>
		<li>一般的なBDを切り取り、腸から肝臓を切り離す。</li>
		<li>慎重に胆嚢に保持することにより、肝臓を削除し、すぐに4%パラホルムアルデヒド(PFA)によって3分の1に充填された50 mLチューブに入れます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. パラフィンの肝臓の固定と埋め込み
<ol><li>
固定
	<ol>
<li>肝臓組織を4°Cで4%PFAで48時間固定します。</li>
		<li>4°Cで1時間70%EtOHでティッシュを洗います。</li>
		<li>組織を95%EtOHで2回洗い、4°Cで1時間ずつ洗います。</li>
		<li>4°Cで1時間100%EtOHでティッシュを2回洗います。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
クリア
	<ol>
<li>肝臓組織を浄化剤(材料の表)で3回、室温で30分間洗う。 注:肝臓は、3回目の洗浄に続いて硬く感じる必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
パラフィンへの埋め込み
	<ol>
<li>組織カセットをパラフィンワックスのティッシュカビに入れ、それぞれ30分間洗います。ワックスは60°Cに予熱する必要があります。</li>
		<li>組織金型をパラフィンワックスで3分の1の高さに充填し、60°Cで加熱ブロックに保管してください。</li>
		<li>肝臓をカビの中に入れ、腹部側を上に向けて置きます。</li>
		<li>加熱ブロックから金型を慎重に取り外します。</li>
		<li>カセットの上部を金型の上に置き、ホット液体パラフィンでトップオフします。</li>
		<li>金型とブロックを一晩室温まで冷やします。 注:組織ブロックは室温で貯えることができる。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 肝臓組織の切除
<ol><li>
断面化のためのブロックの準備
	<ol>
<li>金型からブロックを取り除く前に、5分間氷の上に金型を置きます。</li>
		<li>ブロックと氷の間に存在するラボティッシュペーパーで氷の上にブロックを置きます。</li>
		<li>最高の組織スライス結果を求めて断面しない場合は、氷の上にブロックを置いてください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
肝臓ブロックの断面
	<ol>
<li>マイクロトームを使用して、肝臓の表面的な、後部側を切り取ることから始める。断面は5 μmでなければなりません。</li>
		<li>解剖顕微鏡の下の表面的なセクションをチェックして、セクションがせき取られたり折られたりしていないことを確認してください。</li>
		<li>カウデートローブを含む肝臓のセクションを取る. 注:一部のブロックでは、同じティッシュスライス上に左、中間、右、およびコーデートローブがあります。</li>
		<li>4 つのローブがすべて同じスライド上に存在しないブロックの場合は、左、中間ローブ、右ローブが同じスライド上に存在するまでスライスを続けます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. wsCKおよびαSMAのための免疫組織化学
<ol><li>
免疫組織化学用スライドの処理
	<ol>
<li>分析する遺伝子型ごとに 1 つのスライドを選択します。</li>
		<li>シレンで15分間、100%EtOH、95%EtOH、最後に70%EtOH(各溶液で3 x 5分)を洗浄します。</li>
		<li>スライドを脱イオンH2 Oで5分間洗います。</li>
		<li>抗原検索溶液(トリスベース、高pH)にスライドを浸します。</li>
		<li>圧力鍋で圧力下で10psiで3分間熱します。</li>
		<li>スライドを室温(約35分)まで冷やします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
組織セクションを遮断する
	<ol>
<li>Pap ペンを使用して、スライド上のセクションの概要を説明します。</li>
		<li>リン酸緩衝生理食べ物(PBS)+0.1%の十二を塗布し、セクションを2回、それぞれ5分ずつ覆う。</li>
		<li>PBS + 0.3% トリトンで 1:50 で通常のヤギ血清 (NGS) を混合してブロッキング バッファーを作成します。ブロッキングと一次抗体の両方に十分なバッファーを持つためには、セクションあたり100 μLで十分です。</li>
		<li>セクションごとに100 μLのブロッキング溶液を適用します。</li>
		<li>ブロッキング溶液で覆われたスライドを4°Cで1時間インキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
wsCKおよびαSMAの染色
	<ol>
<li>希釈抗CK8および抗CK19抗体16(発達研究ハイブリドーマバンク、TROMA-IおよびTROMA-III)1:20をブロッキングバッファー中にwsCK用染色する。抗αSMA抗体17(材料表)を同じバッファー内で1:200に希釈する。</li>
		<li>3つの抗体をすべて含む希釈抗体溶液を100μLの各セクションに塗布する。</li>
		<li>抗体溶液で覆われたスライドを一晩4°Cでインキュベートする。</li>
		<li>PBS + 0.1% トリトンでスライドを3回、それぞれ5分ずつ洗います。</li>
		<li>希釈二次抗体(抗ラット-Alexa488および抗マウス-Cy5)1:200 PBS+ 0.3%トリトン。</li>
		<li>両方の二次抗体を含む二次抗体溶液の100 μLをスライドに適用します。</li>
		<li>室温で1時間インキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DAPI核染色と取り付け
	<ol>
<li>スライドを3回、それぞれ5分ずつ洗います。</li>
		<li>各セクションに 100 μL の DAPI (1:3000) を 10 分間適用します。</li>
		<li>スライドにアンチフェード取り付け媒体(材料のテーブル)を適用し、ティッシュセクションの上にガラスカバースリップを置きます。スライドは一晩4°Cのままにしておきます。次の日にスライドをシールします。</li>
		<li>スライドは4°Cで保管し、取り付けから1週間以内に画像を保存します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. BDのイメージングと定量
<ol><li>
イメージング肝臓セクション
	<ol>
<li>イメージングの前に、ラボメンバーの助けを借りてサンプルの遺伝子型に目がくらむ。すべてのイメージング ファイルに、動物/サンプル番号以外の遺伝子型やその他の特定の識別情報がないことを確認します。</li>
		<li>蛍光顕微鏡を使用して、各セクションの1倍ズームで20倍の画像を撮り、肝臓全体のすべてのPVが画像化されていることを確認します。左、中間、右、カウデートローブを含めます。 注:我々は通常、肝臓の大きさに応じて、動物あたり60-90ポータルの管を見つける。</li>
		<li>PVを同一視するには、αSMAとwsCK染色を探します。αSMA陽性であるがwsCK染色に欠けている構造は、ポータル構造ではない。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
BD の識別とカウント
	<ol>
<li>動物/サンプル番号、画像番号、PV数、および BD の数の列を含むスプレッドシートを作成します。</li>
		<li>各イメージを調、「イメージあたりの PV 数を特定して記録します。.</li>
		<li>定義可能な内膜を囲む胆管細胞(wsCK+)の存在によって、各画像の特許BDを識別する。構造体は、他のwsCK+細胞から間葉で分離する必要があります。</li>
		<li>各特許BDをカウントし、画像番号と同じ列に配置します。</li>
		<li>PVで撮影した画像ごとにこれを行います。</li>
		<li>肝臓サンプル内のすべての PV とすべての BD の合計を計算します。</li>
		<li>肝臓サンプルのBD対PV比を計算します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Zong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+controls+liver+development+by+regulating+biliary+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Notch signaling controls liver development by regulating biliary differentiation.</a> Development. 136 (10), 1727-1739 (2009).</li>
<li>Clotman, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+liver+cell+fate+decision+by+a+gradient+of+TGF%CE%B2+signaling+modulated+by+Onecut+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Control of liver cell fate decision by a gradient of TGFβ signaling modulated by Onecut transcription factors.</a> Genes & Development. 19 (16), 1849-1854 (2005).</li>
<li>Karpen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+the+etiologies+and+management+of+neonatal+cholestasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Perinatol%22%5BJournal%5D)">Update on the etiologies and management of neonatal cholestasis.</a> Clin Perinatol. 29 (1), 159-180 (2002).</li>
<li>Roskams, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nomenclature+of+the+finer+branches+of+the+biliary+tree%3A+canals%2C+ductules%2C+and+ductular+reactions+in+human+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Nomenclature of the finer branches of the biliary tree: canals, ductules, and ductular reactions in human livers.</a> Hepatology. 39 (6), 1739-1745 (2004).</li>
<li>Oda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+human+Jagged1+gene+are+responsible+for+Alagille+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in the human Jagged1 gene are responsible for Alagille syndrome.</a> Nature Genetics. 16 (3), 235(1997).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alagille+syndrome+is+caused+by+mutations+in+human+Jagged1%2C+which+encodes+a+ligand+for+Notch1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Alagille syndrome is caused by mutations in human Jagged1, which encodes a ligand for Notch1.</a> Nature Genetics. 16 (3), 243(1997).</li>
<li>Xue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+lethality+and+vascular+defects+in+mice+lacking+the+Notch+ligand+Jagged1%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the Notch ligand Jagged1.</a> Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).</li>
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<li>Hadchouel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paucity+of+interlobular+bile+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Diagnostic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Paucity of interlobular bile ducts.</a> Seminars in Diagnostic Pathology. 9 (1), 24-30 (1992).</li>
<li>Emerick, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+Alagille+syndrome+in+92+patients%3A+frequency+and+relation+to+prognosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Features of Alagille syndrome in 92 patients: frequency and relation to prognosis.</a> Hepatology. 29 (3), 822-829 (1999).</li>
<li>Poncy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+SOX4+and+SOX9+cooperatively+control+development+of+bile+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcription factors SOX4 and SOX9 cooperatively control development of bile ducts.</a> Dev Biol. 404 (2), 136-148 (2015).</li>
<li>Hofmann, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jagged1+in+the+portal+vein+mesenchyme+regulates+intrahepatic+bile+duct+development%3A+insights+into+Alagille+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Jagged1 in the portal vein mesenchyme regulates intrahepatic bile duct development: insights into Alagille syndrome.</a> Development. 137 (23), 4061-4072 (2010).</li>
<li>McCright, B., Lozier, J., Gridley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+Alagille+syndrome%3A+Notch2+as+a+genetic+modifier+of+Jag1+haploinsufficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A mouse model of Alagille syndrome: Notch2 as a genetic modifier of Jag1 haploinsufficiency.</a> Development. 129 (4), 1075-1082 (2002).</li>
<li>Andersson, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Model+of+Alagille+Syndrome+and+Mechanisms+of+Jagged1+Missense+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mouse Model of Alagille Syndrome and Mechanisms of Jagged1 Missense Mutations.</a> Gastroenterology. 154 (4), 1080-1095 (2018).</li>
<li>Loomes, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+duct+proliferation+in+liver-specific+Jag1+conditional+knockout+mice%3A+effects+of+gene+dosage%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Bile duct proliferation in liver-specific Jag1 conditional knockout mice: effects of gene dosage.</a> Hepatology. 45 (2), 323-330 (2007).</li>
<li>Brulet, P., Babinet, C., Kemler, R., Jacob, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+against+trophectoderm-specific+markers+during+mouse+blastocyst+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies against trophectoderm-specific markers during mouse blastocyst formation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (7), 4113-4117 (1980).</li>
<li>Skalli, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monoclonal+antibody+against+alpha-smooth+muscle+actin%3A+a+new+probe+for+smooth+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A monoclonal antibody against alpha-smooth muscle actin: a new probe for smooth muscle differentiation.</a> J Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2787-2796 (1986).</li>
<li>Kamath, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+longitudinal+study+to+identify+laboratory+predictors+of+liver+disease+outcome+in+Alagille+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Gastroenterology+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">A longitudinal study to identify laboratory predictors of liver disease outcome in Alagille syndrome.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 50 (5), 526(2010).</li>
<li>Mouzaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+life+predictive+markers+of+liver+disease+outcome+in+an+International%2C+Multicentre+Cohort+of+children+with+Alagille+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+International%22%5BJournal%5D)">Early life predictive markers of liver disease outcome in an International, Multicentre Cohort of children with Alagille syndrome.</a> Liver International. 36 (5), 755-760 (2016).</li>
<li>Shiojiri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+differentiation+of+bile+ducts+in+the+mammalian+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Development and differentiation of bile ducts in the mammalian liver.</a> Microsc Res Tech. 39 (4), 328-335 (1997).</li>
<li>Crawford, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+intrahepatic+biliary+tree%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Liver+Dis%22%5BJournal%5D)">Development of the intrahepatic biliary tree.</a> Semin Liver Dis. 22 (3), 213-226 (2002).</li>
<li>Kaneko, K., Kamimoto, K., Miyajima, A., Itoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+remodeling+of+the+biliary+architecture+underlies+liver+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Adaptive remodeling of the biliary architecture underlies liver homeostasis.</a> Hepatology. 61 (6), 2056-2066 (2015).</li>
<li>Schaub, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+formation+of+the+biliary+system+by+TGFbeta-mediated+hepatocyte+transdifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">De novo formation of the biliary system by TGFbeta-mediated hepatocyte transdifferentiation.</a> Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).</li>
<li>Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+regulates+formation+of+the+three-dimensional+architecture+of+intrahepatic+bile+ducts+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice.</a> Hepatology. 51 (4), 1391-1400 (2010).</li>
<li>Tanimizu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrahepatic+bile+ducts+are+developed+through+formation+of+homogeneous+continuous+luminal+network+and+its+dynamic+rearrangement+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice.</a> Hepatology. 64 (1), 175-188 (2016).</li>
<li>Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-dimensional+resin+casting+and+imaging+of+mouse+portal+vein+or+intrahepatic+bile+duct+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system.</a> J Vis Exp. (68), e4272(2012).</li>
<li>Popper, H., Kent, G., Stein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ductular+cell+reaction+in+the+liver+in+hepatic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mt+Sinai+Hosp+N+Y%22%5BJournal%5D)">Ductular cell reaction in the liver in hepatic injury.</a> J Mt Sinai Hosp N Y. 24 (5), 551-556 (1957).</li>
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</ol>

著者は利害の対立を持っていません。

マウスにおけるBDの発達と修復の解析は、胆嚢障害の病因およびメカニズムを研究する上で重要なツールである。さらに、新しい治療法の開発は、再生可能で好ましくは定量化可能な表現型の確立に部分的に依存する。マウスモデルにおける現在の表現型は、通常、血清化学、肝臓組織学および細胞型特異的マーカーの免疫染色を伴う。これらの技術は胆道系の構造と機能に関する貴重な情報を生成するが、それらは、特定の遺伝子操作がBDの数に及ぼす影響の直接的な尺度を提供しない。解剖病理学において、ヒト患者におけるBDの貧弱性は、生検セクション9におけるBD対PV比の分析を通じて決定される。臨床医は、ALGSおよび他の胆嚢疾患における胆嚢炎および肝疾患の重症度を決定するために血清化学分析を採用しているが、マウスモデルにおける組織学的評価は、両方の理解にとって重要であるBD開発に対する疾患修飾子の影響と、正常なダクト開発の回復に対する治療法の有効性これは、マウスが特許BDの数を大幅に減少させることができるが、依然と...

胆汁の木は哺乳類の肝臓の重要な部分であり、肝細胞から腸への胆汁の通過を可能にする。肝内胆管(BD)は、ノッチおよびTGFβシグナル伝達1、2を介して二電位肝芽細胞と区別する胆管状細胞によって形成される。成熟したCDへの胆管細胞とその組み立ての適切な仕様とコミットメントは、肝内胆樹の開発のために重要です。肝臓が発達中または臓器再生時に成長するにつれて、胆汁器系は適切な胆汁の排液を確保するために肝臓に沿って発達する必要がある。さらに、多くのシンドロミックおよび非シンドロミック疾患は、肝内BDs3の貧弱をもたらす。さらに、多くの急性および慢性肝疾患は、胆汁マーカーを発現するが、必ずしも胆汁細胞または形態から生じるとは限らないかなりの数の細胞の存在として定義される、肝臓のいわゆる管反応を引き起こす。特許BDs4.多系統障害アラギル症候群(ALGS)では、ノッチリガンドギザギザギザ(JAG1)のハプロインの充足は、BD形成およびコレスタ症5、6の不十分なBD形成をもたらす。我々の研究室は最近、以前に生成されたJag1ヘテロジゴウスマウスライン7がALGS8におけるBDポーシティの動物モデルであることを実証した。ALGSのこのマウスモデルでは、胆管細胞はまだ存在する。しかし、彼らは成熟した特許BDs8に組み込むことを約束することができません。したがって、BDの貧弱のモデルにおける肝臓の分析は、胆管細胞の明らかな存在または不在以上のものを必要とする。成熟したCDが肝臓に存在する程度を正確に評価することが重要です。
解剖病理学では、BDのポーシティが存在するかどうかを評価するための受け入れられた定量的方法が9である。例えば、ヒト患者におけるALGSに関する研究は、肝生検9、10当たり少なくとも10のポータル血管を分析することによって、BDからポータル静脈(PV)比を定量することが多い。特許BDの形状および全体的な有無の分析は、血清化学と組み合わせることで、マウス11、12、13におけるBD発達に関する貴重な情報を提供することができる。しかし、マウスは、血清ビリルビンレベル8のわずかな増加でかなりの数のBDを失う可能性があります。したがって、PV当たりの存在するBDの数を評価する定量的方法は、マウスにおけるBDのポーシティの程度をより直接的に測定することができる。最近の報告では、我々はすべての肝葉全体のPVあたりのBDの数を定量化し、Jag1+/–動物8のBD対PV比の有意な減少を報告した。 我々の分析の過程で、炎症反応および管反応の程度に有意な変動があるにもかかわらず、BD対PV比は大きな変動性8を示さない。さらに、BDとPV比の定量化により、Jag1+/でグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子Poglut1のコピーを1部除去することで、動物のBDの貧弱性を有意に改善できることを実証することができました。 Jag1+/+の背景では、血管平滑筋細胞におけるPoglut1の条件付き損失は、BD数の漸進的な増加をもたらす(20-30%)P7で、大人8で顕著になります.繰り返しますが、この技術は、P7でも、これらの動物のBD密度の増加が統計的に有意であることを示すことを可能にした。なお、生後4ヶ月のこの遺伝子型におけるBD密度の増加は、樹脂鋳造解析を通じて検証された。8これらの観測値および異なるALGSマウスモデル14、15におけるBD密度を測定した他の報告は、様々な変異体の胆汁欠損を分析するための全体的な戦略にこの方法を組み込むことを促したトランスジェニックマウス。
ここでは、肝疾患のマウスモデルにおけるBD罹患率を調べるために使用できる簡単な手法を詳述する(図1)。この方法では、コランゴサイトマーカーサイトケラチン(CK)8およびCK19(以下、広スペクトルCK、wsCK)との共染色を用いて、マウス肝臓におけるBDsおよび非組み込み胆管細胞を可視化する。α平滑筋アクチン(αSMA)に対する抗体を標識容器に染色する。すべての肝葉をカバーするセクションにおけるBDとPV比の系統的分析は、各遺伝子型について多数のPVが分析されることを保証する。我々の方法は、2D画像におけるBDとPVの定量化に依存しているため、胆樹の3D構造や小さな胆管の完全性に対する特定の変異の影響を調べたりするのに適していません。それにもかかわらず、それはマウスの胆道の発達を評価するために研究者のための簡単で客観的な戦略を提供する。

<table><tbody><tr><td>Isothesia(イソフルラン)</td><td>Henry Schein</td><td>11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Bel-Art</td><td>16-800-552</td><td></td></tr><tr><td>10% PFA</td><td>電子顕微鏡 Sciences</td><td>15712</td><td></td></tr><tr><td>50 mL</td>チューブ <td>ThermoScientific</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2401</td><td></td></tr><tr><td>95% Ethanol</td><td>Decon研究所</td><td>2801</td><td></td></tr><tr><td>100% エタノール</td><td>デコン研究所</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>HistoChoice</td><td>VWR ライフサイエンス</td><td>H103-4L</td><td>清算剤</td></tr><tr><td>オムニセット 組織カセット</td><td>フィッシャー ヘルスケア</td><td>15-197-710E</td><td></td></tr><tr><td>マクロセット</td><td>インポート</td><td>M512</td><td></td></tr><tr><td>パラプラスト X-TRA</td><td>マコーミック 科学</td><td>39503002</td><td>パラフィン</td></tr><tr><td>組織モールド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>62528-32</td><td></td></tr>ミ<tr><td>クロトーム</td><td>マイクロム</td><td>HM 325</td><td></td></tr>スーパー<tr><td>フロストプラス顕微鏡スライドフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>C8H10</td><td></td></tr><tr><td>トリスベースの抗原賦活化</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td>H-3301</td><td></td></tr><tr><td>圧力炊飯器</td><td>インスタントポット</td><td>ラックスミニ</td><td></td></tr><tr><td>ミニパップペン</td><td>ライフ</td><td>テクノロジー8877</td><td></td></tr><tr><td>ポリオキシエチレン20ソルビタンモノラウレート(Tween-20)</td><td>JTベイ</td><td>カーX251-07</td><td></td></tr><tr><td>オクチルフェノールエトキシレート(Triton-X-100)</td><td>JTベイ</td><td>カーX198-07</td><td></td></tr><tr><td>ノーマルヤギ血清</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>抗CK8</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>TROMA-I</td><td>抗体レジストリID AB531826</td></tr><tr><td>抗CK19</td><td>Developmental Studies ハイブリドーマバンク</td><td>TROMA-III</td><td>抗体レジストリID AB2133570</td></tr><tr><td>anti-&alpha;SMA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2547, Clone 1A4</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat-Alexa488</td><td>ThermoFisher</td><td>A21208</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse-Cy5</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>715-175-151</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>22 x 50 mm2マイクロカバーガラス</td><td>VWRライフサイエンス</td><td>48393 059</td><td></td></tr>蛍光<tr><td>顕微鏡</td>ライ<td>カ</td><td>DMI6000 B</td><td></td></tr><tr><td>キムワイプキ</td><td>ムテックサイエンス</td><td>05511</td><td></td></tr>ベ<tr><td>クタシールド</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td>H-1000</td><td>退色防止封入剤</td></tr></tbody></table>

マウス肝臓における胆管密度の決定

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

マウスは、胆汁病を研究するためのモデル生物として広く使用されています。胆道系の発達と機能を評価するために、血清化学、組織学的分析、特定マーカーの免疫染色など、様々な技術が用いられる。これらの技術は胆道系に関する重要な情報を提供することができますが、多くの場合、肝臓全体にわたって胆管(BD)発達欠陥の全体像を提示しません。これは、胆汁の発達に著しい障害を持つ動物においても胆汁を排出するマウス肝臓の堅牢な能力に起因する。ここでは、変異型/トランスジェニックマウスのすべてのローブをカバーするセクションで、各ポータル静脈(PV)に関連する平均BD数を計算する簡単な方法を示す。この方法では、肝臓は、様々なゲノムと実験条件間の比較を容易にするために、ステレオタイプ的な方法で取り付けられ、切除される。BDは、シトケラチン染色胆管細胞の光顕微鏡検査によって同定され、その後、肝臓部に存在するPVの総数でカウントされ、除算される。一例として,この方法が野生型マウスとアラギル症候群のマウスモデルを明確に区別する方法を示す.ここで提示する方法は、胆樹の三次元構造を可視化する技術に代わるものとはならない。しかし、それは定量的にBDの発達およびマウスの管反応形成の程度を定量的に評価する容易で直接的な方法を提供する。

我々は以前にJag1+/–動物、ALGS8のマウスモデルで胆汁欠損を文書化した。BDとPV比を決定するために、P30マウスの肝臓を切り離し、血管マーカーαSMAと共にCK8およびCK19(wsCK)のためにそれらを共染色した。その後、各肝葉のすべてのPVを画像化しました。図2Aに示すように、PVを隣接するwsCK染色(矢印)を持つαSMA染色容器として定義した。wsCKを含まないαSMA染色構造は中央静脈であり、分析(矢印)に含めるべきではありません。
PVが同定されると、その特徴的な形状で特許BDを同定した。図3に示すように、特許ダクトはwsCK+胆管に囲まれた明らかに定義可能な内包を有する。ダクトは通常、近くのダクトまたはコランゴサイトから間葉(矢印)によって分離さ...

マウス肝臓における胆管密度を正確に定量するための、かなりシンプルで敏感な方法を提示する。この方法は、遺伝的および環境修飾子の効果と胆汁病のマウスモデルにおける潜在的な治療法の有効性の決定に役立ちます。

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

このプロトコルは、研究者が肝臓病のマウスモデルにおける胆管の発達を定量化することを可能にする。また、胆管の開発に対する遺伝的修飾剤の影響を評価することを可能にする。この技術の利点は、胆管の開発の直接評価のための簡単で、敏感で、定量的な方法であるということです。まず、皮膚を鉗子で張り付けて、小さなはさみを使って、安楽死させたマウスの肋骨ケージの約1インチ下に横断切開を行います。肝臓の腹側表面全体を露出させます。小さいはさみを使用して、肝臓と腹部の他の器官をつなぐ靭帯を慎重に切断します。次いで、共通の胆管を切断し、肝臓を腸から切り離す。胆嚢につかまって、慎重に肝臓を取り除きます.すぐに4%パラホルムアルデヒドで充填50ミリリットルチューブを4分の3に入れます。肝臓組織を固定するには、4%PFAを摂氏4度で48時間インキュベートする。一連のエタノール洗浄後、クリア剤で肝臓を室温で30分間3回洗浄します。埋め込みを開始するには、組織カセットを組織モールドで3回30分間、摂氏60度に予熱したパラフィンワックスで洗浄します。その後、パラフィンワックスで組織モールドを4分の3の高さに充填し、摂氏60度の加熱ブロックに保管します。腹側を上に向けて、肝臓を型に入れます。慎重に加熱ブロックから金型を取り外した後、カセットの上部を金型の上に置きます。熱い液体パラフィンを上にして、一晩室温まで冷却させます。肝臓ブロックを型から取り出した後、ミクロトームを使用して肝臓の表面的な後側を切り離し、5マイクロメートルの切片を作ります。解剖顕微鏡の下の表面的なセクションをチェックして、セクションがせせられたり折り畳まれたりしていないことを確認してください。免疫検査用のスライドを処理するには、分析する遺伝子型ごとに1つのスライドを選択し、キシレン、100%エタノール、95%エタノール、そして最後に70%エタノールで15分間洗浄します。スライドをイオン化水に洗浄した後、トリスベースの高pH抗原検索溶液に浸漬する。その後、圧力鍋で圧力を受けて1平方インチあたり10ポンドで3分間加熱します。スライドを室温まで冷やした後、PAP ペンを使用してスライドのセクションの概要を説明します。PBS Tweenで洗浄した後、セクションあたり100マイクロリットルのブロッキング溶液を加えて組織切片をブロックし、摂氏4度で1時間覆われたインキュベートを行います。3つの一次抗体すべてを含む希釈抗体溶液の100マイクロリットルを各セクションに塗布し、一晩摂氏4度でインキュベートします。スライドを洗浄した後、二次抗体を含む2次抗体溶液の100マイクロリットルを加え、室温で1時間インキュベートする。最後に、取り付け媒体とカバースリップをスライドに適用します。蛍光顕微鏡を使用して、各セクションの1倍ズームで20倍の画像を撮影します。肝臓全体のすべての門脈が画像化されていることを確認します。次の列を使用してスプレッドシートを作成します:動物/サンプル番号、画像番号、ポータル静脈の数と胆管の数。各画像の画像ごとのポータルの静脈の数を識別し、記録します。次に、各画像の特許胆管を、定義可能な内腔を取り囲む胆管の存在によって同定する。これらの構造は、他の広域スペクトルサイトケラチン陽性細胞から区別され、間質によって分離されるべきである。この技術の主な課題の1つは、特許胆管の同定です。パテントダクトが何であるかを決定するには、ダクトの形状と内腔を取り巻く細胞の分析が必要です。各特許胆管をカウントし、画像番号と同じ列に配置し、各ポータルの静脈画像について繰り返します。最後に、肝臓サンプル内のすべての門脈と胆管の合計を計算し、肝臓サンプルの胆管と門脈の比率を計算します。P30マウス肝臓は、CK8およびCK19について、血管マーカーと共に切除し、共染色し、α-SMA、BD対PV比を決定した。各肝葉のすべての門脈が画像化されると、門脈は隣接する広域スペクトルサイトケラチン染色を有するα-SMA染色血管として定義された。広域スペクトルサイトケラチンを含まないα-SMA染色構造は、分析から除外された中央静脈であった。パテントダクトは、広いスペクトルのサイトケラチン陽性胆管数減少に囲まれた明確に定義可能なルーメンを有し、通常は近くの管または雑管から間線葉によって分離される。定義可能な内腔を有しない広域シトケラチン陽性細胞は、胆管の総数にカウントされない。野生型動物由来の肝臓部は、いくつかの非法人細胞と共に完全特許ダクトに関連する門脈を示す。JAG1ヘテロ接動物由来の代表的な肝切れ目は、3つの門脈の周囲に特許胆管が存在しない。ここですべての広域スペクトルサイトケラチン陽性細胞は非法人であり、したがって、カウントされるべきではありません。3つの野生型および3つのJAG1ヘテロ接合動物のBD対PV比の分析は、胆管数に基づいて2つの遺伝子型を容易に区別する方法を示している。胆管のすべての門脈を評価することが重要です。肝臓全体にフェオチの変動がある場合は、胆管密度を決定するために特に重要です。.この技術は、ヘルガソンのマウスモデルにおける胆道表現型の遺伝的抑制剤を同定するために使用された。したがって、胆道疾患の動物モデルの治療様式を評価するのに有用であり得る。

determining-bile-duct-density-in-the-mouse-liver

Research

JoVE Journal

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マウス肝臓における胆管密度の決定

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