Name: 外向きに見る:シアノバクテリア放出炭水化物ポリマーとタンパク質の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: 学ぶシアノバクテリアの放出炭水化物ポリマーとエクソプロテオームの単離法。高純度の多糖類とタンパク質を得られ、バイオテクノロジー応用に活用可能です。

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この作品は、コンペ2020-競争力と国際化のためのオペラプログラム(POCI)、ポルトガル2020、FCTを通じてポルトガルのファンドによって資金提供されたフンド・ヨーロッパ・デ・デセンボルヴィメント地域(FEDER)ファンドによって資金提供されました - フンダサン・パラ・シエンシアeテクノロジア/ミニステリオ・ダ・シエンシア、テクノロジア・エ・エンシノ・スーペリアは、プロジェクトPOCI-01-0145-FEDER-028779および助成金SFRH/BD/99715/2014(CF)の枠組みの中でスーペリア。

1. シアノバクテリア放出炭水化物ポリマー分離
<ol><li>
ポリマーの単離と汚染物質の除去
	<ol>
<li>標準的な条件下でシアノバクテリア株を栽培する[例えば、12h光の下で30°C(50 μE m-2s -1)/12 h暗いレジメン、150 rpmで軌道揺さぶりで]。標準プロトコル(例えば、730nm(OD730nm)の光学密度、クロロフィルa、乾燥重量等を用いて増殖を測定し、フェノール硫酸法16に従って放出された多糖類の産生を測定する。</li>
		<li>培養物を透析膜(分子量遮断の12~14kDa)に移し、連続撹拌で24時間の脱イオン水の最低10体に対して透析する。 注:透析および培地組成物に培養する培養量によっては、透析水を変更する必要がある場合がある。</li>
		<li>4°Cで15分間15,000 x gで培養を遠心分離します。上清を新しいバイアルに移し、ペレット(細胞)を捨てる。</li>
		<li>4°Cで15分間20,000 x gで再度遠心分離機を使用し、細胞壁の破片やリポ多糖類(LPS)などの汚染物質を除去します。</li>
		<li>上清をガラスビーカーに移し、ペレットを捨てます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ポリマーの沈殿
	<ol>
<li>上清に96%エタノールの2巻を加えます。</li>
		<li>懸濁液を4°C、少なくとも一晩でインキュベートする。</li>
		<li>ポリマー回収<ol>
<li>沈殿したポリマーの小さいまたは目に見えない量のために:4°Cで25分間13,000 x gで懸濁液を遠心分離する。上清を捨て、1 mLまたは2mLのオートクレーブド脱イオン水でペレットを再懸濁する。水性懸濁液をバイアルに移します。 注意:上清は簡単に再懸濁してしまう可能性がありますので、優しく廃棄する必要があります。</li>
			<li>可視/大量の沈殿ポリマーの場合:シ菌金属鉗子を使用して沈殿したポリマーをバイアルに集める。ポリマーを絞り、余分なエタノールを捨てます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>任意:必要なポリマー精製の程度に応じて、脱イオン水中のポリマーを再懸濁した後、96%エタノールで沈殿工程を繰り返す。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ポリマーの凍結乾燥
	<ol>
<li>沈殿したポリマーとバイアルを-80 °C、少なくとも一晩保管してください。</li>
		<li>少なくとも48時間のポリマーを凍結乾燥(凍結乾燥)する(凍結乾燥前に懸濁液を解凍させないようにする)。</li>
		<li>乾燥ポリマーを室温(RT)で保存し、さらに使用します。 注:ポリマーをデシケータに保存すると、時間の経過とともに水を吸収できるため、保存することをお勧めします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. シアノバクテリアエキソプロテオーム分離
<ol><li>
中濃度
	<ol>
<li>標準的な条件下でシアノバクテリアを培養する[例えば、12h光の下で30°C(50 μE m-2s -1)/12 h暗いレジメン、150 rpmで軌道揺さぶりで]。標準的な手順(例えば、OD730nm、クロロフィルa、乾燥重量など)を使用してチアノバクテリウム増殖を監視する。</li>
		<li>RTで10分間、4,000 x gで培養物を遠心分離します。</li>
		<li>上清をフラスコに移し、細胞ペレットを捨てます。</li>
		<li>0.2 μmの細孔サイズフィルターを通してデカントされた媒体をろ過する。 注:培地が4°Cに保たれている場合、プロトコルはここで短時間一時停止することができます。</li>
		<li>約500倍(濾過媒体の初期体積を考慮)、公称分子量カットオフ3kDaの遠心コンセントレータを用いて濃縮する。遠心分離は15°Cで4,000 x g(最大1時間/遠心分離ラウンド)で作動する必要があります。 注意:コンセントレータブランドの大半では、フィルタデバイスを使用前に超純水で遠心分離してすすいでください。フィルターが濡れたら乾かさないようにしてください。デバイスが使用されていない場合は、十分な流体をリザーバに残します。 注:遠心分離温度を4°Cに下げることは、タンパク質活性を研究することを目的としている場合に役立ちますが、サンプル濃度に必要な時間が増加します。培地が4°Cに保たれている場合、プロトコルは遠心分離ステップ間を短時間休止することができます。</li>
		<li>濃縮サンプルでフィルターデバイスサンプルリザーバの壁をすすいで、内容物をマイクロ遠心管に移します。</li>
		<li>オートクレーブ培養培地を用いたフィルターデバイスサンプルリザーバの追加洗浄工程を実行し、最大のエキソプロテオーム回収を確保する。 注: 回復の割合を定量化するには、特定の製造元の指示に従ってください。</li>
		<li>エキソプロテオームサンプルは、さらに使用するまで-20 °Cで保存します。 注:プロテアーゼ阻害剤の添加は、長期保存のために推奨されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
エキソプロテオームの分析
	<ol>
<li>メーカーの指示に従って96ウェルプレートでBCAタンパク質アッセイによるタンパク質含有量を定量します。</li>
		<li>ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動ナトリウム(SDS-PAGE)によってタンパク質を分離し、標準的な染色プロトコル(例えば、クーマシーブルー、銀染色)を使用します。</li>
		<li>目的のバンド/ゲル領域を切り取り、超純水の適切な量を含む異なるマイクロ遠心管でそれらを収集します。</li>
		<li>質量分析によるタンパク質の同定と分析を進めます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Pereira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexity+of+cyanobacterial+exopolysaccharides%3A+composition%2C+structures%2C+inducing+factors+and+putative+genes+involved+in+their+biosynthesis+and+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly.</a> FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).</li>
<li>Kanekiyo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+an+Antiviral+Polysaccharide%2C+Nostoflan%2C+from+a+Terrestrial+Cyanobacterium%2C+Nostoc+flagelliforme%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Natural+Products%22%5BJournal%5D)">Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme.</a> Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).</li>
<li>Løbner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+human+adaptive+immune+responses+by+administration+of+a+high-molecular-weight+polysaccharide+extract+from+the+cyanobacterium+Arthrospira+platensis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Food%22%5BJournal%5D)">Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis.</a> Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).</li>
<li>Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+polysaccharides+from+cyanobacteria+Nostoc+commune+and+their+antioxidant+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Polymers%22%5BJournal%5D)">Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities.</a> Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).</li>
<li>Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+removal+of+cyanobacterial+exopolysaccharides+by+uronic+acid+content+and+monosaccharide+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Polymers%22%5BJournal%5D)">Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition.</a> Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).</li>
<li>Han, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emulsifying%2C+flocculating%2C+and+physicochemical+properties+of+exopolysaccharide+produced+by+cyanobacterium+Nostoc+flagelliforme%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biochemistry+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).</li>
<li>Leite, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanobacterium%E2%80%90Derived+Extracellular+Carbohydrate+Polymer+for+the+Controlled+Delivery+of+Functional+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Cyanobacterium‐Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins.</a> Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206(2017).</li>
<li>Estevinho, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+cyanobacterial+extracellular+polymeric+substance+in+the+microencapsulation+of+vitamin+B12%5BTitle%5D)+AND+%22Powder+Technology%22%5BJournal%5D)">Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12.</a> Powder Technology. 343, 644-651 (2019).</li>
<li>Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+polymeric+substances+%28EPS%29+from+cyanobacterial+mats%3A+characterisation+and+isolation+method+optimisation%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation.</a> Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).</li>
<li>Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+extraction+and+characterization+of+microalgal+and+cyanobacterial+exopolysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides.</a> Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).</li>
<li>Costa, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+systems+in+gram-negative+bacteria%3A+structural+and+mechanistic+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).</li>
<li>Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+outer+membrane+vesicle+biogenesis%3A+a+new+mechanism+and+its+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell%22%5BJournal%5D)">Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications.</a> Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).</li>
<li>Sergeyenko, T. V., Los, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+secreted+proteins+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+strain+PCC+6803%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803.</a> FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).</li>
<li>Oliveira, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatile+TolC-like+Slr1270+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).</li>
<li>Flores, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alternative+sigma+factor+SigF+is+a+key+player+in+the+control+of+secretion+mechanisms+in+Synechocystis+sp.+PCC+6803%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).</li>
<li>Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+method+for+determination+of+sugars+and+related+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Colorimetric method for determination of sugars and related substances.</a> Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).</li>
<li>Parikh, A., Madamwar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+characterization+of+extracellular+polysaccharides+from+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria.</a> Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).</li>
<li>Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+identify+the+unexplored+diversity+of+microbial+exopolysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 565(2015).</li>
<li>Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPathak%2C+J+%22Marine+Glycobiology%22">Marine Glycobiology</a>. , CRC Press. 343-358 (2016).</li>
<li>Nguyen, A. T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performances+of+different+protocols+for+exocellular+polysaccharides+extraction+from+milk+acid+gels%3A+Application+to+yogurt%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt.</a> Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).</li>
<li>Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+recovery+procedures+on+structural+and+rheological+properties+of+schizophyllan+produced+from+date+syrup%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).</li>
<li>Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+profiles+of+outer+membrane+vesicles+and+extracellular+matrix+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

細菌分泌機構をよりよく理解し、放出された製品を研究するためには、細胞外細菌環境に存在する生体分子の効率的な単離と分析を実証することが極めて重要です(放出など)炭水化物ポリマーおよびタンパク質)。
シアノバクテリア細胞外炭水化物ポリマーは、主にその組成1を構成する異なる単糖類の数および割合に起因する非常に複雑である。これらの高分子物質の単離に用いられる従来の方法は、これらの糖分が豊富な物質が水溶液に可溶性であり、有機溶媒(アセトンやエタノールなど)の添加によって沈殿できるという単純な概念に依存している9 、17、18.これは、ポリマーの水和シェルからの水分子の抽出に起因し、プロセスの効率は、ポリマーの分子量(より高い分子量の分画でより効率的)、化学構造、および濃度9,<sup cla...

シアノバクテリアは、有望なバイオテクノロジー/バイオメディカルアプリケーションを持つ天然物の多産源として広く認識されています。そのため、シアノバクテリアの分泌機構を理解し、抽出・回収方法の最適化を行うには、効率的な微生物細胞工場としてシアノバクテリアを実装することが不可欠です。
多くのシアノバクテリア株は、細胞外高分子物質(EPS)を産生することができ、主にヘテロ多糖類によって形成され、細胞表面に関連したままであるか、または培地1に放出される。これらの放出された炭水化物ポリマーは、他の細菌のものと比較して特徴があり、幅広い用途(例えば、抗ウイルス剤2、免疫刺激3、抗酸化4、抗酸化剤)に適しています。金属キレート5、乳化6、および薬物送達剤7、8)。これらのポリマーの単離のための方法論は、主に収率の向上に寄与するだけでなく、得られたポリマーの純度および特定の物理的特性の増加に寄与する9.ポリマーの単離のためのこれらの方法の大半は、ポリマーの強いアニオン性質9、10のために容易に達成される培養培地からの降水戦略に依存する。さらに、沈殿工程で使用される溶媒の除去は、蒸発および/または凍結乾燥によって迅速に達成することができる。予見された用途に応じて、トリクロロ酢酸(TCA)処理、濾過、またはサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を含む最終製品を調整するために、ポリマー沈殿後または前に異なるステップを結合することができます。列浄化10.
シアノバクテリアはまた、膜トランスポーター(古典的)11または小胞(非古典的)12に媒介される経路を介してタンパク質の広い範囲を分泌することができる。したがって、シアノバクテリアエキソプロテオームの分析は、シアノバクテリアタンパク質分泌機構を理解/操作し、これらのタンパク質の特異的な細胞外機能を理解するために不可欠なツールを構成する。分泌タンパク質の豊富さは比較的低いので、エキソプロテオームの信頼性の高い単離および分析は、細胞外milieuの濃度を必要とする。加えて、他の物理的または化学的ステップ(例えば、遠心分離、濾過、またはタンパク質沈殿)は、得られるエキソプロテオームの品質を最適化し、タンパク質含有量13を濃縮し、汚染物質の存在を回避し得る(例えば、顔料、炭水化物など)14歳,15またはサンプル中の細胞内タンパク質の優位性。しかし、これらのステップの一部は、検出可能なタンパク質のセットを制限し、偏った分析につながる可能性があります。
本研究では、シアノバクテリア培養培地から放出された炭水化物ポリマーとエキソプロテオームを単離するための効率的なプロトコルについて説明する。これらのプロトコルは、ここで説明する基本的な手順を維持しながら、研究の特定の目的とユーザーのニーズに簡単に適応できます。

<table><tbody><tr><td>透析メンブレン</td><td>Medicell Membranes Ltd&nbsp;</td><td>DTV.12000.07</td><td>ビスキングチューブサイズ7、直径23.8 mm、幅39-41 mm 30mロール&nbsp;</td></tr><tr><td>エタノール96%</td><td>AGA - &Aacute;lcool e G&eacute;ネロス・アリメンタレス S.A.</td><td>4.000.02.02.00</td><td>発酵エチルアルコール96%AGA</td></tr><tr><td>PESフィルター0.2&mu;m</td><td>フィッシャーサイエンティフィック、LDA</td><td>15206869</td><td>シリンジフィルターポリスチレン 33MM 0.2&micro;M STR&nbsp;</td></tr><tr><td>アミコンウルトラ15、ウルトラセル3K</td><td>メルクミリポア株式会社</td><td>UFC900324</td><td>公称分子量カットオフが3 kDaの遠心フィルター</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp;Pierce BCA Protein Assay</td><td>Fisher Scientific, Lda</td><td>10741395</td><td>総タンパク質濃度を測定するためのグリーンからブルーへの精密な界面活性剤適合アッセイ試薬</td></tr><tr><td>Brillant Blue G Colloidal Concentrate&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ・クイアキュート;マイカ SL</td><td>B2025-1EA</td><td>クーマシーブルー&nbsp;</td></tr></tbody></table>

外向きに見る:シアノバクテリア放出炭水化物ポリマーとタンパク質の単離

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

シアノバクテリアは、ヘテロ多糖やタンパク質などの細胞外環境に幅広い生体分子を積極的に分泌することができます。これらの生体分子の同定と特徴付けは、それらの分泌経路に関する知識を改善し、それらを操作するのに役立ちます。さらに、これらの生体分子のいくつかは、バイオテクノロジーの応用の面でも興味深い。ここで説明するシアノバクテリア放出炭水化物ポリマーおよびタンパク質の容易かつ迅速な単離のための2つのプロトコルがある。放出された炭水化物ポリマーの単離方法は、有機溶媒を用いた水溶液中の多糖類の従来の沈殿技術に基づいている。この方法は、ポリマーの特性を保持し、同時に細胞破片および培養培地からの汚染物質の存在を回避する。プロセスの終わりに、凍結乾燥ポリマーは、使用または特徴付けされる準備ができているか、または最終意図された使用に応じて、更なる精製のラウンドを受けることができる。シアノバクテリアエキソプロテオームの単離に関して、この技術は遠心分離および濾過による主要な汚染物質の除去後の無細胞培地の濃度に基づいている。この戦略は、膜トランスポーターまたは外膜小胞を介して細胞外のmilieuに達するタンパク質の信頼性の高い単離を可能にします。これらのタンパク質は、その後、標準的な質量分析技術を使用して同定することができる。ここで提示されるプロトコルは、幅広いシアノバクテリアだけでなく、他の細菌株にも適用することができる。さらに、これらの手順は、製品の最終使用、必要な純度、および細菌株に応じて容易に調整することができます。

シアノバクテリア培養物から放出された炭水化物ポリマーを抽出するために記載された方法の概略表現が図1に示されている。中等度のEPS生産者シアノバクテリウムシネコシスティススティスsp.PCC 6803および効率的なEPS生産者シアノテスsp. CCY 0110からの沈殿ポリマーは、図2に示されている。図3では、汚染度の異なる凍結乾燥ポリマーを示し、最終製品の純度に対する遠心分離ステップの重要性を強調する。図4は、シアノバクテリアエキソプロテオームの単離方法を図示する。明確な無細胞培地濃縮サンプル(すなわち、異なる成長相の培養物および低いカロテノイド産生を有するシアノバクテリア株から得られる)を図5に示す。2つの形態的に異なるシアノバクテリア株からのエキソプロテオームサンプル、単細胞シアノバクテリアシネ...

ここで、シアノバクテリア放出炭水化物ポリマーの単離およびエキソプロテオームの単離に関するプロトコルが記載されている。両方の手順は、さらなる分析または用途に使用できる高純度のポリマーまたはタンパク質を得るための重要なステップを具体化します。それらはまた特定のユーザーの必要性に従って容易に合わせることができる。

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

我々が開発したこれらのプロトコルは、シアノバクテリアとその放出産物、すなわち細胞外炭水化物ポリマーおよびタンパク質の分泌メカニズムを研究するために重要である。生成された知識は、我々はいくつかのアプリケーション、すなわちバイオテクノロジーとバイオメディカルアプリケーションのためにこれらの製品をカスタマイズすることができます。これらのプロトコルは非常に簡単です。それらは生産生物、ユーザーの必要性、およびプロダクトの最終的な適用に従って合わせることができる。これらのプロトコルの主な利点は、他の生物系、特に他の細菌に容易に適応できることである。これらのプロトコルは簡単です。しかし、細菌株または必要な純度に応じて、いくつかの変化を導入する必要があるかもしれません。まず、シアノバクテリア株を標準的な条件下で栽培する。標準プロトコルを使用して成長を測定します。次に、培養液を透析膜に移し、連続撹拌しながら24時間、最低10容量の脱イオン水に対して透析を行う。摂氏4度で15,000倍gの培養物を15分間遠心する。上清を新しいバイアルに移し、ペレットを捨てます。遠心分離機は、細胞壁の破片またはリポ多糖類などの汚染物質を除去するために、摂氏4度で20,000倍のgで再び15分間行った。遠心分離後、上清をガラスビーカーに移し、ペレットを捨てる。ポリマーを沈殿させるために、上清に96%エタノールの2つのボリュームを加え、一晩摂氏4度で懸濁液をインキュベートする。沈殿ポリマーの少量または目に見えない量の場合、25分間摂氏4度で13,000倍gの懸濁液を遠心分離する。上清を静かに捨て、ペレットをオートクレーブ脱イオン水の1~2ミリリットルで再懸濁する。水性懸濁液をバイアルに移します。目に見える、大量の沈殿ポリマーについては、滅菌金属鉗子を介して沈殿させたポリマーをバイアルに集める。ポリマーを絞り、余分なエタノールを捨てる。凍結乾燥と呼ばれる凍結乾燥プロセスを実行するには、沈殿したポリマーを一晩マイナス80度に保ちます。ポリマーを少なくとも48時間凍結乾燥する。次いで、乾燥したポリマーを、さらに使用するまで室温でデシケータに保管する。培地を濃縮するために、まず、標準的な条件下でシアノバクテリアを栽培する。シアノバクテリウムの成長を標準的な手順で監視します。次いで、室温で4,000倍gの培養物を10分間遠心する。上清をフラスコに移し、細胞ペレットを捨てる。次に、0.2ミクロンの細孔サイズフィルターを介してデカン化された培地をフィルター処理します。培地を約500倍に濃縮するには、3キロダルトンから遠心分離器4、000倍g、摂氏15度の公称分子量カットオフを有する遠心濃縮器を、1回の遠心分離ラウンドあたり最大1時間使用する。遠心分離後、フィルター装置サンプルリザーバーの壁を濃縮サンプルでリンスし、その内容をマイクロ遠心チューブに移します。オートクレーブ培養培地を用いてフィルター装置サンプルリザーバの追加洗浄工程を行い、最大エキソプロテオーム回収を確実に行う。次に、エキソプロテオームサンプルをマイナス20°Cで保存し、さらに使用するまで保管します。エタノールは、ポリマー沈殿と収率を最適化するために精力的に添加する必要があります。沈殿したポリマーを遠心分離した後、上清の廃棄は、フラスコの壁に緩やかに付着し得るペレットの再懸濁を避けるために慎重に行われるべきである。手動でろ過を行う場合は、フィルター膜を壊さないように優しくする必要があります。沈殿したポリマーの中には、主にシネコシスティスのEPSの場合など、フラスコの壁部に比べ、遠心分離後にのみ見ることができるものがあります。他の場合には、シアノテーゼポリマーのような、沈殿直後にガラスビーカーに浮遊するポリマー塊を見ることができる。ポリマーの色素沈着(通常は白色または薄茶色)を変えるので、一部の汚染は、ポリマー凍結乾燥後にマクロ的に容易に検出することができる。オレンジ色のポリマーは、カロテノイドまたはこれらの顔料を含む構造で汚染されています。例えば、緑色のポリマーは、細胞の破片およびクロロフィルで汚染される。エキソプロテオームは、細菌株によって大きく異なる場合があります。例えば、単細胞シアノバクテリウムからのエキソプロテオームと糸状株からのエキソプロテオームを参照してください。エキソプロテオーム濃縮サンプル中の多糖類の多量は、エキソプロテオーム分析を妨げる可能性があります。例えば、タンパク質の分離を遅らせ、タンパク質のマスクを少なくすることができます。ユーザーは、組成物、物理的/化学的特性、試験ポリマー生物学的活性、または改変ポリマー成分の観点からポリマーを特徴付けることができます。タンパク質同定のために、ゲルおよび質量分析におけるタンパク質の分離を行うことができる。そして、小胞の分離のために、エキソプロテオームの超遠心分離を行う必要があります。我々のグループでは、これらのプロトコルは、バイオレメディエーションや抗腫瘍剤または薬物送達剤など、異なる分野におけるシアノバクテリア分泌機構または細胞外炭水化物ポリマーの応用を解明する道を既に開いている。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

出典: Shivaiah、K.、 et al。植物葉組織とシアノバクテリアからのプラストグロブ脂滴の単離 J. Vis. 経験。...

光合成細菌からのプラストグロブレスの抽出と精製

出典: Shivaiah、K.、 et al。 植物葉組織とシアノバクテリアからのプラストグロブ脂滴の単離 J. Vis. 経験。...

シアノバクテリアプラストグロビュの密度勾配精製

出典: Jiang, H., Ho, M. シアノバクテリアにおける無傷のフィコビリソームの単離と特性評価。J. Vis.

バイオマス生産のためのシアノバクテリア培養物の調製

ここでは、シアノバクテリア細胞のグリコーゲン含有量を測定するための信頼性の高い簡単なアッセイを提示します。この手順は、沈殿、選択可能な解重合、およびグルコース残渣の検出を必要とする。この方法は、野生型および遺伝子操作された株の両方に適しており、シアノバクテリアの代謝工学を促進することができる。...

シアノバクテリアにおけるグリコーゲン含有量の測定

ここでは、定量的阻害吸光光度法によるシアノ バクテリアのフィコビリタンパク質の内容を決定するためのプロトコルを提案する.抽出手順でした; 他のシアノ...

シアノ バクテリア阻害のフィコビリタンパク質の吸光光度定量

現在のプロトコルは、不連続なスクロース密度勾配を介して遠心分離によってシアノバクテリアからのフィコビリソームの分離を詳述する。77K蛍光発光スペクトルとSDS-PAGE分析により、インタクトなフィコビリソームの画分が確認されます。得られたフィコビリソーム画分は、TEMの陰性染色および質量分析分析に適しています。...

シアノバクテリアにおけるインタクトフィコビリソームの分離と特徴付け

本プロトコールは、シアノバクテリア培養物からの細胞外小胞の単離、濃縮、および特性評価に関する詳細な説明を提供する。異なるスケールの培養物から小胞を精製するためのアプローチ、方法論間のトレードオフ、およびフィールドサンプルを扱うための考慮事項についても議論する。...

シアノバクテリア細胞外小胞の単離と特性評価

様々な光合成生物に関連するプラストグロビュール脂肪滴を単離するための迅速かつ効率的なプロトコルが提示されています。単離されたプラストグロビュールの調製を成功させることは、プロテオミクス解析やリピドミック解析などの詳細な分子調査に先立つ重要な第一歩です。...

プラストグロビュール 植物葉組織およびシアノバクテリアからの脂肪滴分離

我々は、XY平面における糸状シアノバクテリアの可視化のための簡単でアクセスしやすい方法を提示する。低融点のアガロースマトリックスを使用し、垂直方向で分裂に関与するタンパク質の画像を取得できるようにしました。したがって、この方法論は、任意の糸状生物および異なる種類のタンパク質に適用することができる。...

糸状シアノバクテリアのタイムラプス顕微鏡分析のための垂直固定化法

ここでは、シアノファージ(およびその宿主)を単離するための海洋および淡水生態系のユーフォティックゾーンからのサンプリング方法と、単一の遺伝子型を濃縮し、ウイルスと宿主の相互作用ダイナミクスを特徴付けるサンプリング後のプロセスについて説明します。...

光合成微生物とそのウイルスの環境サンプリング:フィールドからラボまで

学ぶシアノバクテリアの放出炭水化物ポリマーとエクソプロテオームの単離法。高純度の多糖類とタンパク質を得られ、バイオテクノロジー応用に活用可能です。

外向きに見る:シアノバクテリア放出炭水化物ポリマーとタンパク質の単離

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