Name: ヌクレアーゼフリー酸素スカベンジャープロトカテク酸プロトカテクエート3,4-ジオキシゲナーゼの発現と精製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 学ぼう、プロトカテクアート3,4-ジオキシゲナーゼ（PCD）の発現と精製法。E. coliを用いて高活性かつヌクレアーゼフリーの酵素を調製し、水溶液中の酸素スカベンジングに応用する実験手法を解説します。

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<ol><li>Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+single+fluorescent+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Detection of single fluorescent molecules.</a> Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).</li>
<li>Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+reactive+oxygen+species+to+the+photobleaching+of+organic+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores.</a> Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).</li>
<li>Ha, T., Tinnefeld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photophysics+of+fluorescent+probes+for+single-molecule+biophysics+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).</li>
<li>Dixit, R., Cyr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+damage+and+reactive+oxygen+species+production+induced+by+fluorescence+microscopy%3A+effect+on+mitosis+and+guidelines+for+non-invasive+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%3A+for+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy.</a> The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (2), 280-290 (2003).</li>
<li>Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+species+formed+on+proteins+exposed+to+singlet+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemical+%26+Photobiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen.</a> Photochemical & Photobiological Sciences. 3 (1), 17-25 (2004).</li>
<li>Sies, H., Menck, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Singlet+oxygen+induced+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Singlet oxygen induced DNA damage.</a> Mutation Research. 275 (3-6), 367-375 (1992).</li>
<li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oxygen+scavenging+system+for+improvement+of+dye+stability+in+single-molecule+fluorescence+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li>
<li>Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanochemical+coupling+in+actomyosin+energy+transduction+studied+by+in+vitro+movement+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay.</a> Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).</li>
<li>Shi, X., Lim, J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidification+of+the+oxygen+scavenging+system+in+single-molecule+fluorescence+studies%3A+in+situ+sensing+with+a+ratiometric+dual-emission+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe.</a> Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).</li>
<li>Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+analyses+of+designed+and+selected+mutants+of+protocatechuate+3%2C4-dioxygenase1%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1.</a> Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).</li>
<li>Senavirathne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+nuclease+contamination+in+commonly+used+oxygen-scavenging+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems.</a> Nature Methods. 12 (10), 901-902 (2015).</li>
<li>Senavirathne, G., Lopez, M. A. Jr, Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+nuclease-free+protocatechuate+3%2C4-dioxygenase+for+prolonged+single-molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging.</a> Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).</li>
<li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nature Communications. 7, 11409(2016).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cascading+MutS+and+MutL+sliding+clamps+control+DNA+diffusion+to+activate+mismatch+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair.</a> Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).</li>
</ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

酸素清掃システムは、光漂白を低減するために一般的に単一分子蛍光顕微鏡に含まれています。これらの顕微鏡法は、核酸1、13、14との核酸またはタンパク質相互作用を観察するためにしばしば使用される。ヌクレアーゼを含むOSSの汚染は、スプリアスの結果につながる可能性があります。
GODCATおよびPCDを含む市販のOSSは、有意なヌクレアーゼ汚染11を含むことが示されている。PCDを購入し、ヌクレアーゼ汚染物質11を除去するためにSECを採用することが可能です。しかし、あるベンダーから市販のPCDの価格は、その方法の公表に続い...

単一分子(SM)生物物理学は、生物現象の見方を変える急速に成長する分野です。この分野は、物理学と化学の基礎法則を生物学に結びつけるユニークな能力を持っています。蛍光顕微鏡は、SM感度を達成できる生物物理学的方法の1つです。蛍光は、生体分子を小さな有機蛍光体または量子ドット1に連結することによって検出するために使用される。これらの分子は、不可逆的に光脱白する前にレーザーで励起されると光子を放出することができる2.光脱色は、蛍光標識が所望の波長2、3で励起する能力を破壊する化学的損傷を受けたときに起こる。水性緩衝液中に活性酸素種(ROS)が存在することは、光脱色の主な原因である2、4である。さらに、ROSは生体分子に損傷を与え、SM実験5、6の誤った観察につながる可能性があります。酸化的損傷を防ぐために、酸素清掃システム(OSS)を3、7、8として用いることができる。グルコースオキシダーゼ/カタレーゼ(GODCAT)システムは酸素8を除去する上で効率的であるが、中間体として潜在的に有害な過酸化物を生成する。これらは、SM研究に関心のある生体分子に損害を与える可能性があります。
あるいは、プロトカテクテクテク酸3,4ジオキシゲナーゼ(PCD)は、その基質プロトカテク酸(PCA)7、9を用いて水溶液からO2を効率的に除去する。PCDは、非ヘム鉄を用いてPCAを配合し、溶解したO210を用いてカテコールリング開口反応を触媒する金属酵素である。この一歩反応は、SM実験7における蛍光性安定性を向上させるための全体的に優れたOSSであることが示されている。残念ながら、PCDを含む多くの市販のOSS酵素は、ヌクレアーゼ11を汚染して含有する。これらの汚染物質は、SM実験で使用される核酸系基質の損傷につながる可能性があります。この研究は、SMシステムにおける組換えPCDの使用のためのクロマトグラフィーベースの精製プロトコルを解明する。PCDは、ROSがデータ取得に必要な基板にダメージを与えているあらゆる実験に広く適用できます。

<table><tbody><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>&beta;ME</td></tr><tr><td>30% アクリルアミドおよびビスアクリルアミド溶液、29:1</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0156</td><td></td></tr><tr><td>酢酸、氷河認定 ACS</td><td>Fisherl Chemical</td><td>A38C-212</td><td></td></tr><tr><td>寒天、粒状</td><td>BD Biosciences</td><td>DF0145-17-0</td><td></td></tr><tr><td>AKTA FPLC システム</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>AKTA 清浄機: Box-900、pH/C-900、UV-900、P-900、Frac-920</td><td></td></tr><tr><td>アミコンウルトラ-2遠心フィルターユニット</td><td>EMDミリポア</td><td>UFC201024</td><td>10 kDa</td></tr><tr><td>MWCOアンモニウム鉄(II)硫酸塩六水和物</td>シ<td>グマF-2262</td><td></td><td></td></tr>過<tr><td>硫酸アンモニウム(APS)錠</td>アム<td>レスコ</td><td>K833-100TABS</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td>アム<td>レスコ</td><td>0339-25G</td><td></td></tr><tr><td>バクトトリプトン</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>DF0123173</td><td></td></tr><tr><td>BDバクト脱水培養培地添加物:ボトル酵母抽出物</td><td>VWR</td><td>90004-092</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRISプロパン、> = 99.0%(滴定)</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>B6755-500G</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>クーマシーブリリアントブルー</td><td>アムレスコ</td><td>0472-50G</td><td></td></tr><tr><td>共星96&ndash;まあフラット&ndash;ボトムEIAプレート</td><td>Bio-Rad</td><td>2240096EDU</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>P212121</td><td>SV-DTT</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 500ML</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td>PBS</td></tr><tr><td>臭化エチジウム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1302</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>G37-20</td><td></td></tr><tr><td>粒状LBブロス</td><td>ミラーEMDバイオサイエンス</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>高解像度標準アガロー</td>ス <td>AGTC バイオプロダクツ</td><td>AG500D1</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0250-250G</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Goldbio</td><td>I2481C25</td><td></td></tr><tr><td>ロイペプチン</td><td>ロシュ</td><td>11017128001</td><td></td></tr><tr><td>リゾチーム 鶏卵白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876-1G</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>Amresco</td><td>0288-1KG</td><td></td></tr><tr><td>の微量的な分光光度計、キュベットの機能</td><td>と サーモフィ</td><td>ッシャーND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>P212121</td><td>RP-S23020</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTAのスーパーフロー(100のml)</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>Novagen BL21のコンピテントな細胞EMD</td><td>のMillipore</td><td>69-449-3</td><td>SOC媒体を含んでいる</td></tr><tr><td>オレンジG</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>0-267</td><td></td></tr><tr><td>ペプスタチン</td><td>ゴールド</td><td>バイオテクノロジーP-020-25</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>アムレスコ</td><td>0754-25G</td><td></td></tr><tr><td>プロトカテク酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>ICN15642110 P212121</td><td>PCA</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td></td><td>CI-00270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M2マイクロプレートリーダー</td><td>分子デバイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PESメンブレン付き滅菌ディスポーザブルフィルターユニット > 250mL</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>09-741-04</td><td></td></tr><tr><td>PESメンブレン付き滅菌ディスポーザブルフィルターユニット > 500mL</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>09-741-02</td><td></td></tr><tr><td>スーパースース 12 10/300 GL</td><td>GE ヘルスケアライフサイエンス</td><td>17517301</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>アムレスコ</td><td>0761-25ML</td><td></td></tr><tr><td>トリス ウルトラピュア</td><td>ゴジラ ファインケミカルズ</td><td>UTS1003</td><td></td></tr><tr><td>台風 9410 可変モード蛍光イメージャー</td><td>GE ヘルスケア ライフサイエンス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td></td></tr></tbody></table>

ヌクレアーゼフリー酸素スカベンジャープロトカテク酸プロトカテクエート3,4-ジオキシゲナーゼの発現と精製

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

単一分子(SM)顕微鏡は、蛍光体標識生体分子の動的分子相互作用の研究にリアルタイムで使用されます。しかし、蛍光管は溶存酸素による光脱白による信号の損失を起こしやすい(O2)。光白化を防止し、蛍光を通す寿命を延ばすために、酸素清掃システム(OSS)がO2を低減するために採用されている。市販のOSSは、核酸を損傷または分解するヌクレアーゼによって汚染され、実験結果の解釈を混同し得る。ここでは、検出可能なヌクレアーゼ汚染のない高活性シュードモナスプチダプロトカテクテネート-3,4-ジオキシゲナーゼ(PCD)の発現および精製のためのプロトコルを詳述する。PCDは、基質プロトカテク酸(PCA)を3-カルボキシシス、シスムコン酸に変換することにより反応性O2種を効率的に除去することができる。この方法は、O2がデータ取得に有害な役割を果たす任意の水性システムで使用できます。この方法は、市販のPCDと比較して、非常に活性の高いヌクレアーゼフリーPCDを製造する上で有効である。

市販の酸素捕捉剤PCDは、DNAヌクレアーゼで頻繁に汚染される。ヌクレアーゼ活性を汚染すると、蛍光研究、特にDNAまたはDNA相互作用タンパク質を分析する研究において、スプリアスの結果につながる可能性があります。組換えPCDは、ヘキサヒスチジンタグ付きpcaHおよびpcaGのヘテロ二量体であり、大腸菌で発現され得る(図1)。ヘテロ二量体は、まずニッケルアフィニティークロマトグラフィーにより精製される(図2)。PCDは、イミダゾール濃度の2ステップで溶出される。クロマトグラフィー分画はSDS-PAGEによって分析される。ほぼ純粋なPCDの端数は、SECによって濃縮され、さらに精製される(図3)。SEC画分は、PCA酸化活性とヌクレアーゼ活性の両方について個別に分析される(図4)。高い酸化活性を示し、明らかなヌクレアーゼ活性を示さない画分は...

プロトカテクテク酸3,4-ジオキシゲナーゼ(PCD)は、その基質プロトカテク酸(PCA)を使用して水系から遊離した二原子酸素を酵素的に除去することができる。このプロトコルは、この酸素清掃酵素の発現、精製、および活性分析について説明する。

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

当社のプロトコルは、検出可能なヌクレアーゼから解放された非常に活性なPCDを生み出し、水性酸素が汚染物質であるあらゆる溶液に使用することができます。私たちが使用する技術は複製が容易で、製品にヌクレアーゼ汚染物質が存在しないようにします。まず、pVP91A-pcaHG PCD発現プラスミドの1マイクロリットルと、市販の大腸菌BL21の20マイクロリットルをチューブに組み合わせます。チューブをフリックして混ぜ、チューブを氷の上に5分間置きます。変換反応を継続するには、チューブを摂氏42度の水浴に30秒間置き、氷の上に2分間置きます。SOC培地を80マイクロリットル加え、225rpmと37°Cで1時間振ります。次に、変換反応混合物をLBアンピシリン寒天に注ぎ、プレートスプレッダーを使用して混合物を広げる。蓋でプレートを覆い、16〜18時間摂氏37度でプレートをインキュベートします。その後、プレートからコロニーを1つ選び、250ミリリットルのエルレンマイヤーフラスコで50マイクロリットルのLBアンピシリンを接種する。フラスコを225rpmのシェーカーに置き、摂氏37度で16~18時間インキュベートします。次いで、インキュベート培養物20ミリリットルをLB-アンピシリン1リットルで満たされた4リットルフラスコに移す。摂氏37度で225rpmで振ります。1時間ごとに、培養物の1ミリリットルをキュベットに引き込み、光量計で600ナノメートルで光学密度を測定する。培養光学密度が0.5近く増加するにつれて、測定の頻度を15分ごとに増加させ、OD600が0.5に達するまで。その後、4リットルフラスコを氷のビンに移します。氷浴中のフラスコを旋回して培養温度を下げる。4リットルのフラスコを摂氏17度と180rpmのインキュベーターに移します。OD600を20分ごとに監視し続けます。0.7 OD600で、IPTGと硫酸アンモニウムの六水和物のストック溶液を加え、それぞれ0.5ミリモルおよび1リットル当たり10ミリグラムの最終濃度に達する。180 rpm、17°Cで18時間振ります。インキュベーション後、培養フラスコを氷の中に2分間入れます。誘導細胞を1.5ミリリットルのポリプロピレンマイクロ遠心分離管で1ミリリットル収穫し、SDS-PAGE分析を行います。次に、細菌培養物をボトルに注ぎ、各ボトルに500ミリリットル、遠心分離を行う。4°Cで培養し、20分間3,000グラムペレット。上清をデカントします。ピペットはペレットを再懸濁し、それぞれ12.5ミリリットルの冷たいPBSで、2つの再懸濁液を50ミリリットルの円錐管に組み合わせます。以前のように再び細胞をペレット。次いで、上清を捨て、ピペットを用いて各チューブに10ミリリットルのライシスバッファーを加えて細胞を再懸濁させる。誘導細胞

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Biochemistry

生物化学

採用した安定同位体標識のワークフロー...

採用プロテアーゼ及び酸触媒ラベリングワークフロー<sup&gt; 18</sup&gt; O-濃縮水

我々は、過酸化水素の光触媒生成のためのプロトコルを記述 - 酸化的変換のための補因子です。...

光駆動酵素的脱炭酸

私たちは、Saccharomyces cerevisiaeの指向性進化キャンペーンのための突然変異体ライブラリを構築し、スクリーニングするための詳細なプロトコルを提示します。...

指向進化方法で<em&gt;サッカロマイセス・セレビシエ</em&gt;：変異体ライブラリーの作成およびスクリーニング

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ここで、紹介タグの付いていない人間の活動の効率的な単一ステップ浄化のためのプロトコル 10 11 転流 2 (TET2) イオン交換クロマトグラフィーと液体クロマトグラフィー-タンデム質量を使用しての試金を使用して 5-メチルシトシン ジオキシゲナーゼ分析...

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ここで嫌気性蛋白質の浄化、嫌気性蛋白質濃度、酸素電極システムを使用して後続の速度論的解析のためのプロトコルを提案する.DesB...

嫌気性蛋白質の浄化および DesB ジオキシゲナーゼ活性と抑制の勉強用酸素電極による速度論的解析

ここ生体内で、生体内および共焦点顕微鏡による植物組織のイメージング nanoceria 清掃合成と ROS (活性酸素種) のセリウム酸化物ナノ粒子 (nanoceria) の特性のプロトコルを提案します。nanoceria ROS...

植物活性酸素種体内はアニオン性セリウム酸化物ナノ粒子の触媒の清掃

我々は、参照されていない太平洋カキ標本からのRNAサンプルを使用する方法の戦略を説明し、公に利用可能なゲノムデータと比較して遺伝物質を評価し、事実上配列されたcDNAライブラリーを生成する。...

参照されていない太平洋カキからの仮想配列cDNAライブラリの生成のための収束戦略

ここで提示されるのは、HJ分解能を研究するために単分子フェルスター共鳴エネルギー伝達を行うためのプロトコルである。解離定数を決定するために、2...

GEN1によるホリデイ接合分解能のリアルタイム調査のための単分子フェルスター共鳴エネルギー伝達法

ここでは、タンパク質ポリマーを制御された配列で形成する酵素によってタンパク質モノマーを結合し、単一分子力分光研究のために表面に固定化するプロトコルを提示する。...

OaAEP1-媒介酵素合成と単分子力分光法のための重合タンパク質の固定化

この記事では、C41(DE3)発現系で毒性ヌクレアーゼである組換えNsp15を過剰発現し、その後、アフィニティーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを使用してタグ付きタンパク質を精製する方法論について説明します。これらのプロトコルは、他の困難な有毒タンパク質にも適応できます。...

大腸菌からの有毒ヌクレアーゼの過剰発現と精製

学ぼう、プロトカテクアート3,4-ジオキシゲナーゼ（PCD）の発現と精製法。E. coliを用いて高活性かつヌクレアーゼフリーの酵素を調製し、水溶液中の酸素スカベンジングに応用する実験手法を解説します。

ヌクレアーゼフリー酸素スカベンジャープロトカテク酸プロトカテクエート3,4-ジオキシゲナーゼの発現と精製

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