Name: ヌクレアーゼフリー酸素スカベンジャープロトカテク酸プロトカテクエート3,4-ジオキシゲナーゼの発現と精製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 学ぼう、プロトカテクアート3,4-ジオキシゲナーゼ（PCD）の発現と精製法。E. coliを用いて高活性かつヌクレアーゼフリーの酵素を調製し、水溶液中の酸素スカベンジングに応用する実験手法を解説します。

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著者たちは何も開示する必要はない。

酸素清掃システムは、光漂白を低減するために一般的に単一分子蛍光顕微鏡に含まれています。これらの顕微鏡法は、核酸1、13、14との核酸またはタンパク質相互作用を観察するためにしばしば使用される。ヌクレアーゼを含むOSSの汚染は、スプリアスの結果につながる可能性があります。
GODCATおよびPCDを含む市販のOSSは、有意なヌクレアーゼ汚染11を含むことが示されている。PCDを購入し、ヌクレアーゼ汚染物質11を除去するためにSECを採用することが可能です。しかし、あるベンダーから市販のPCDの価格は、その方法の公表に続い...

単一分子(SM)生物物理学は、生物現象の見方を変える急速に成長する分野です。この分野は、物理学と化学の基礎法則を生物学に結びつけるユニークな能力を持っています。蛍光顕微鏡は、SM感度を達成できる生物物理学的方法の1つです。蛍光は、生体分子を小さな有機蛍光体または量子ドット1に連結することによって検出するために使用される。これらの分子は、不可逆的に光脱白する前にレーザーで励起されると光子を放出することができる2.光脱色は、蛍光標識が所望の波長2、3で励起する能力を破壊する化学的損傷を受けたときに起こる。水性緩衝液中に活性酸素種(ROS)が存在することは、光脱色の主な原因である2、4である。さらに、ROSは生体分子に損傷を与え、SM実験5、6の誤った観察につながる可能性があります。酸化的損傷を防ぐために、酸素清掃システム(OSS)を3、7、8として用いることができる。グルコースオキシダーゼ/カタレーゼ(GODCAT)システムは酸素8を除去する上で効率的であるが、中間体として潜在的に有害な過酸化物を生成する。これらは、SM研究に関心のある生体分子に損害を与える可能性があります。
あるいは、プロトカテクテクテク酸3,4ジオキシゲナーゼ(PCD)は、その基質プロトカテク酸(PCA)7、9を用いて水溶液からO2を効率的に除去する。PCDは、非ヘム鉄を用いてPCAを配合し、溶解したO210を用いてカテコールリング開口反応を触媒する金属酵素である。この一歩反応は、SM実験7における蛍光性安定性を向上させるための全体的に優れたOSSであることが示されている。残念ながら、PCDを含む多くの市販のOSS酵素は、ヌクレアーゼ11を汚染して含有する。これらの汚染物質は、SM実験で使用される核酸系基質の損傷につながる可能性があります。この研究は、SMシステムにおける組換えPCDの使用のためのクロマトグラフィーベースの精製プロトコルを解明する。PCDは、ROSがデータ取得に必要な基板にダメージを与えているあらゆる実験に広く適用できます。

<table><tbody><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>&beta;ME</td></tr><tr><td>30% アクリルアミドおよびビスアクリルアミド溶液、29:1</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0156</td><td></td></tr><tr><td>酢酸、氷河認定 ACS</td><td>Fisherl Chemical</td><td>A38C-212</td><td></td></tr><tr><td>寒天、粒状</td><td>BD Biosciences</td><td>DF0145-17-0</td><td></td></tr><tr><td>AKTA FPLC システム</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>AKTA 清浄機: Box-900、pH/C-900、UV-900、P-900、Frac-920</td><td></td></tr><tr><td>アミコンウルトラ-2遠心フィルターユニット</td><td>EMDミリポア</td><td>UFC201024</td><td>10 kDa</td></tr><tr><td>MWCOアンモニウム鉄(II)硫酸塩六水和物</td>シ<td>グマF-2262</td><td></td><td></td></tr>過<tr><td>硫酸アンモニウム(APS)錠</td>アム<td>レスコ</td><td>K833-100TABS</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td>アム<td>レスコ</td><td>0339-25G</td><td></td></tr><tr><td>バクトトリプトン</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>DF0123173</td><td></td></tr><tr><td>BDバクト脱水培養培地添加物:ボトル酵母抽出物</td><td>VWR</td><td>90004-092</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRISプロパン、> = 99.0%(滴定)</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>B6755-500G</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>クーマシーブリリアントブルー</td><td>アムレスコ</td><td>0472-50G</td><td></td></tr><tr><td>共星96&ndash;まあフラット&ndash;ボトムEIAプレート</td><td>Bio-Rad</td><td>2240096EDU</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>P212121</td><td>SV-DTT</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 500ML</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td>PBS</td></tr><tr><td>臭化エチジウム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1302</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>G37-20</td><td></td></tr><tr><td>粒状LBブロス</td><td>ミラーEMDバイオサイエンス</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>高解像度標準アガロー</td>ス <td>AGTC バイオプロダクツ</td><td>AG500D1</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0250-250G</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Goldbio</td><td>I2481C25</td><td></td></tr><tr><td>ロイペプチン</td><td>ロシュ</td><td>11017128001</td><td></td></tr><tr><td>リゾチーム 鶏卵白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876-1G</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>Amresco</td><td>0288-1KG</td><td></td></tr><tr><td>の微量的な分光光度計、キュベットの機能</td><td>と サーモフィ</td><td>ッシャーND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>P212121</td><td>RP-S23020</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTAのスーパーフロー(100のml)</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>Novagen BL21のコンピテントな細胞EMD</td><td>のMillipore</td><td>69-449-3</td><td>SOC媒体を含んでいる</td></tr><tr><td>オレンジG</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>0-267</td><td></td></tr><tr><td>ペプスタチン</td><td>ゴールド</td><td>バイオテクノロジーP-020-25</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>アムレスコ</td><td>0754-25G</td><td></td></tr><tr><td>プロトカテク酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>ICN15642110 P212121</td><td>PCA</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td></td><td>CI-00270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M2マイクロプレートリーダー</td><td>分子デバイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PESメンブレン付き滅菌ディスポーザブルフィルターユニット > 250mL</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>09-741-04</td><td></td></tr><tr><td>PESメンブレン付き滅菌ディスポーザブルフィルターユニット > 500mL</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>09-741-02</td><td></td></tr><tr><td>スーパースース 12 10/300 GL</td><td>GE ヘルスケアライフサイエンス</td><td>17517301</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>アムレスコ</td><td>0761-25ML</td><td></td></tr><tr><td>トリス ウルトラピュア</td><td>ゴジラ ファインケミカルズ</td><td>UTS1003</td><td></td></tr><tr><td>台風 9410 可変モード蛍光イメージャー</td><td>GE ヘルスケア ライフサイエンス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td></td></tr></tbody></table>

ヌクレアーゼフリー酸素スカベンジャープロトカテク酸プロトカテクエート3,4-ジオキシゲナーゼの発現と精製

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

単一分子(SM)顕微鏡は、蛍光体標識生体分子の動的分子相互作用の研究にリアルタイムで使用されます。しかし、蛍光管は溶存酸素による光脱白による信号の損失を起こしやすい(O2)。光白化を防止し、蛍光を通す寿命を延ばすために、酸素清掃システム(OSS)がO2を低減するために採用されている。市販のOSSは、核酸を損傷または分解するヌクレアーゼによって汚染され、実験結果の解釈を混同し得る。ここでは、検出可能なヌクレアーゼ汚染のない高活性シュードモナスプチダプロトカテクテネート-3,4-ジオキシゲナーゼ(PCD)の発現および精製のためのプロトコルを詳述する。PCDは、基質プロトカテク酸(PCA)を3-カルボキシシス、シスムコン酸に変換することにより反応性O2種を効率的に除去することができる。この方法は、O2がデータ取得に有害な役割を果たす任意の水性システムで使用できます。この方法は、市販のPCDと比較して、非常に活性の高いヌクレアーゼフリーPCDを製造する上で有効である。

市販の酸素捕捉剤PCDは、DNAヌクレアーゼで頻繁に汚染される。ヌクレアーゼ活性を汚染すると、蛍光研究、特にDNAまたはDNA相互作用タンパク質を分析する研究において、スプリアスの結果につながる可能性があります。組換えPCDは、ヘキサヒスチジンタグ付きpcaHおよびpcaGのヘテロ二量体であり、大腸菌で発現され得る(図1)。ヘテロ二量体は、まずニッケルアフィニティークロマトグラフィーにより精製される(図2)。PCDは、イミダゾール濃度の2ステップで溶出される。クロマトグラフィー分画はSDS-PAGEによって分析される。ほぼ純粋なPCDの端数は、SECによって濃縮され、さらに精製される(図3)。SEC画分は、PCA酸化活性とヌクレアーゼ活性の両方について個別に分析される(図4)。高い酸化活性を示し、明らかなヌクレアーゼ活性を示さない画分は...

プロトカテクテク酸3,4-ジオキシゲナーゼ(PCD)は、その基質プロトカテク酸(PCA)を使用して水系から遊離した二原子酸素を酵素的に除去することができる。このプロトコルは、この酸素清掃酵素の発現、精製、および活性分析について説明する。

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

当社のプロトコルは、検出可能なヌクレアーゼから解放された非常に活性なPCDを生み出し、水性酸素が汚染物質であるあらゆる溶液に使用することができます。私たちが使用する技術は複製が容易で、製品にヌクレアーゼ汚染物質が存在しないようにします。まず、pVP91A-pcaHG PCD発現プラスミドの1マイクロリットルと、市販の大腸菌BL21の20マイクロリットルをチューブに組み合わせます。チューブをフリックして混ぜ、チューブを氷の上に5分間置きます。変換反応を継続するには、チューブを摂氏42度の水浴に30秒間置き、氷の上に2分間置きます。SOC培地を80マイクロリットル加え、225rpmと37°Cで1時間振ります。次に、変換反応混合物をLBアンピシリン寒天に注ぎ、プレートスプレッダーを使用して混合物を広げる。蓋でプレートを覆い、16〜18時間摂氏37度でプレートをインキュベートします。その後、プレートからコロニーを1つ選び、250ミリリットルのエルレンマイヤーフラスコで50マイクロリットルのLBアンピシリンを接種する。フラスコを225rpmのシェーカーに置き、摂氏37度で16~18時間インキュベートします。次いで、インキュベート培養物20ミリリットルをLB-アンピシリン1リットルで満たされた4リットルフラスコに移す。摂氏37度で225rpmで振ります。1時間ごとに、培養物の1ミリリットルをキュベットに引き込み、光量計で600ナノメートルで光学密度を測定する。培養光学密度が0.5近く増加するにつれて、測定の頻度を15分ごとに増加させ、OD600が0.5に達するまで。その後、4リットルフラスコを氷のビンに移します。氷浴中のフラスコを旋回して培養温度を下げる。4リットルのフラスコを摂氏17度と180rpmのインキュベーターに移します。OD600を20分ごとに監視し続けます。0.7 OD600で、IPTGと硫酸アンモニウムの六水和物のストック溶液を加え、それぞれ0.5ミリモルおよび1リットル当たり10ミリグラムの最終濃度に達する。180 rpm、17°Cで18時間振ります。インキュベーション後、培養フラスコを氷の中に2分間入れます。誘導細胞を1.5ミリリットルのポリプロピレンマイクロ遠心分離管で1ミリリットル収穫し、SDS-PAGE分析を行います。次に、細菌培養物をボトルに注ぎ、各ボトルに500ミリリットル、遠心分離を行う。4°Cで培養し、20分間3,000グラムペレット。上清をデカントします。ピペットはペレットを再懸濁し、それぞれ12.5ミリリットルの冷たいPBSで、2つの再懸濁液を50ミリリットルの円錐管に組み合わせます。以前のように再び細胞をペレット。次いで、上清を捨て、ピペットを用いて各チューブに10ミリリットルのライシスバッファーを加えて細胞を再懸濁させる。誘導細胞でチューブを超音波処理した後、細菌のリゼートを冷やされたポリカーボネートボトルに注ぎます。遠心分離機は120、000回gと摂氏4度で60分間、冷たい50ミリリットルの円錐管に上清を注ぎます。ニッケルを帯電した樹脂カラムでFPLC装置を準備した後、サンプルを1分間に0.15ミリリットルでカラムにロードします。20ミリモルイミダゾールで20ミリリットルのニッケルバッファーでカラムを洗います。分析のために50ミリリットルのチューブに洗浄を保持します。次に、125ミリモルイミダゾールで15ミリリットルのニッケルバッファーでカラムを洗浄します。各0.8ミリリットルの19画分で溶出を収集します。100%ニッケルバッファーBの15ミリリットルで再度カラムを洗い、さらに75分の0.2ミリリットルを集めます。PCDの存在を確認するために12%SDS-PAGEゲルで収集された分率の分析を続けます。まず、1.5ミリリットルのポリプロピレンマイクロ遠心分離チューブに35マイクロリットルの反応バッファーを加えます。チューブ内で、ピーククロマトグラフィー画の5マイクロリットルと3キロベースペアのスーパーコイルプラスミドpXbaの500ナノグラムを組み合わせます。チューブを摂氏37度の水浴に1時間置きます。原稿に従ってアガロースゲルを調製した後、ゲル内のウェルに各反応の30マイクロリットルを加える。周囲温度で10ボルト/センチメートルで約1時間のエレクトロフォレス。オレンジ色のG染料がゲルの終わりに達しました。すぐに、蛍光スキャナーを使用して、ゲルの臭化エチジウム信号を画像化します。強度と画像ピクセルサイズの機能を使用して、スーパーコイル、リニア、ニックされた円などのさまざまなDNA種のピクセル体積を決定します。各DNA種の割合を求めるには、単一のDNA種のピクセル量を、個々の種の総ピクセル量で割ります。SDS-PAGE分析は、第2の溶出ピークは、ほぼ純粋なPCDヘテロダイマーを表し、検出不可能なヌクレアーゼ活性を最小限にする最小限のタンパク質汚染を含み示しています。したがって、さらに分析するために、2番目のPCD溶出からこれらの10画分を5ミリリットルの円錐管に組み合わせます。PCDのサイズ排除クロマトグラフィー精製後、摂氏4度の冷たい部屋で、マイクロ遠心チューブに適切な塩化ナトリウム、塩酸塩トリス塩酸塩、塩化マグネシウム、ジチオスレイトール、PCA、およびスーパーコイルプラスミドpXbaを組み合わせて5倍のストックを作ります。氷の上に96ウェルの平底プレートを置き、組み合わせた5X溶液の10マイクロリットルを井戸に移します。分析の直前に、個々のPCD SEC画分の各ウェル10マイクロリットルに加えます。プレートリーダーを37°Cの内部温度に設定し、96ウェルプレートをプレートホルダーに移します。プレートホルダーを機器に引き込み、20秒間隔で290ナノメートルで吸光度を1時間測定します。各読み取りの5秒前にプレートを振るように計器を設定します。1時間後、各ウェルに10マイクロリットルの停止溶液を加えて反応を終了します。PCD SEC画分に対してゲル電気泳動を行います。吸収度の低下とヌクレアーゼ汚染の観察がない場合に示される、PCAの酸化活性が最も多い画分を選択します。280ナノメートルで吸光度を測定し、吸光度と吸光係数に基づいてPCD濃度の合計を計算します。選択した分数を長期保存用にマイナス80°Cで保存します。本実験では、ヘキジスチジンタグ付きpcaHおよびpcaGのヘテロダイマーである組換えPCDが大腸菌で発現していることが分かった。ヘテロ二級体を、ニッケル親和クロマトグラフィーにより最初に精製した。吸光度は青色で示され、ニッケル緩衝液Bのパーセント濃度は赤で示される。フロースルーは、ニッケル樹脂に結合しなかった可溶性細菌タンパク質を示す。一部のPCDは125ミリモルイミダゾールの存在下で溶出したが、タンパク質の大部分は250ミリモルイミダゾールで溶出した。代表的なSDS-PAGE分析は、溶出ステップからの分数が汚染物質を含まないことを示している。ヌクレアーゼアッセイのアガロースゲルは、タンパク質を添加しない陰性対照とDNAヌクレアーゼで汚染された陽性対照と比較して汚染を明らかにする。アガロースゲルヌクレアーゼアッセイで観察された様々なDNA種の定量は、29〜38の分数が組み合わされ、濃縮され、SECによってさらに精製されるように選択されたヌクレアーゼ活性がほとんどなかったことを示している。この手順に従って、精製されたPCDを使用し、所望の酸素清掃システムで最適化することができる。これにより、システムに必要な正確な PCD 量が決まります。この技術は、単一分子顕微鏡実験で蛍光体の寿命を延ばすために使用され、データ収集の期間が長くなっています。使用される超遠心分離機は危険です。回転する前に、遠心分離機のバランスが適切であることを確認してください。臭化エチジウムは有害な試薬です。個人用保護具を着用して接触を避け、適切に処分してください。

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大腸菌からの有毒ヌクレアーゼの過剰発現と精製

学ぼう、プロトカテクアート3,4-ジオキシゲナーゼ（PCD）の発現と精製法。E. coliを用いて高活性かつヌクレアーゼフリーの酵素を調製し、水溶液中の酸素スカベンジングに応用する実験手法を解説します。

ヌクレアーゼフリー酸素スカベンジャープロトカテク酸プロトカテクエート3,4-ジオキシゲナーゼの発現と精製

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