Name: マイクロインジェクションによる3D組織由来ヒトオルガノイド培養システムにおけるクリプトスポリジウム感染の研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: 学ぶ Cryptosporidium parvumのスポロゾイト精製とマイクロインジェクション技術を用いた3Dヒトオルガノイド感染モデルの構築方法。免疫染色による可視化と宿主病原体相互作用の研究に応用可能です。

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アリゾナ大学ツーソン校(アリゾナ州)の動物比較生物医学部のデボラ・A・シェーファー氏に感謝しています。我々はまた、孤立したオルガノイド卵胞のTEM調製およびイメージングのためにワシントン州立大学のフランチェスキ顕微鏡・画像センターとD.L.マレンドーアに感謝する。
D.D.は、オランダ科学研究機構(NWO-ALW, 016.Veni.171.015)からのVENI助成金の受領者です。I.H.は、オランダ科学研究機構(NWO-ALW,863.14.002)からのVENI助成金の受領者であり、欧州委員会(提案330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF)のマリー・キュリー・フェローシップによって支援されました。これらの結果につながる研究は、ERCアドバンスト補助金契約第67013号の欧州研究評議会から、およびR21 AT009174の下でNIH NIAIHからRMOに資金を受けています。この研究は、オランダ癌協会の一部が資金提供を受け、オランダ癌協会の助成金を受けたOncode研究所の一部です。

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<li>Heo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+Cryptosporidium+infection+in+human+small+intestinal+and+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids.</a> Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).</li>
<li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+Modeling+in+Stem+Cell-Derived+3D+Organoid+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li>
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<li>Wilke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+Antibodies+to+Intracellular+Stages+of+Cryptosporidium+parvum+Define+Life+Cycle+Progression+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro.</a> mSphere. 3 (3), (2018).</li>
<li>Vinayak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+of+the+diarrhoeal+pathogen+Cryptosporidium+parvum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum.</a> Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).</li>
<li>Dijkstra, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Tumor-Reactive+T+Cells+by+Co-culture+of+Peripheral+Blood+Lymphocytes+and+Tumor+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids.</a> Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

腸および気道オルガノイドにおけるクリプトスポリジウム寄生虫の培養は、宿主寄生虫相互作用10を研究するための正確なモデルを提供するが、他にも多くの用途を有する。例えば、遺伝子組み換えクリプトスポリジウム寄生虫を選択して伝播する現在の方法は、生体内感染に不可欠な改変を有する寄生虫の単離を許可しないマウス19の通過を必要とする。クリプトスポリジウムのオルガノイド培養は、この手順に代わるものである。しかし、我々は、電ポレートされたスポロゾイトが一緒に集まり、マイクロピペットをブロックすることを指摘しました。遺伝子組み換え寄生虫を選択する目的で、オルガノイドは、トランスフェクトされたスポロゾイツとの感染を可能にするために、分化条件下で2次元形式でコラーゲンコーティングトランスウェル上で成長することができ、その結果、遺伝子組み換えの卵胞子。トランスウェルは頂点および浴盤の表面へのアクセスを可能にし、長期間安定している。
現在、がん組織由来オルガノ...

クリプトスポリジウム感染の治療および予防のための薬剤またはワクチンの開発は、ヒト1,2における生体内状況を正確に模倣するインビトロシステムの欠如によって妨げられている。現在利用可能なシステムの多くは、短期的な感染(<5日)のみを許可するか、寄生虫3、4の完全なライフサイクルをサポートしていません。寄生虫の完全な発達を可能にする他のシステムは、ヒトの生理状況を忠実に要約しない不死化細胞株または癌細胞株に基づいている5,6,7.オルガノイドまたは「ミニ臓器」は、様々な組織特異的成長因子を補完する細胞外マトリックスで成長する3D組織由来の構造である。オルガノイドは、様々な臓器や組織から開発されています。それらは遺伝的に安定しており、その起源の器官のほとんどの機能を要約し、長期間培養中に維持することができる。腸と呼吸器クリプトスポリジウムに関連する宿主寄生虫相互作用の研究のための正確なインビトロモデルを提供するクリプトスポリジウムでヒトの腸および肺オルガノイドを感染させる方法を開発した8 ,9,10,11,12,13.他の公表された培養モデルとは対照的に、オルガノイド系は、実際の宿主寄生虫相互作用を代表し、寄生虫のライフサイクルのすべての段階を研究できるようにライフサイクルを完了し、寄生虫の伝播を維持することができます。最大28日間10.
クリプトスポリジウムパルバムは、呼吸器および腸管の上皮に感染し、長期の下痢疾患を引き起こすアピコンプレミカン寄生虫である。耐性環境段階は、汚染された食品および水14に見られる卵胞である。一度摂取または吸入すると、卵嚢胞は上皮細胞に付着する4つのスポロゾイトを放出する。スポロゾイテスは宿主細胞上を滑走し、宿主細胞受容体を従事させるが、寄生虫は細胞に完全に侵入せず、宿主細胞を誘発して15を巻き込むように見える。寄生虫は、細胞内の内部に内在するが、細胞外のクラスタ内に残り、細胞の頂点に残り、寄生虫の真空中で複製する。それは無性生殖の2ラウンドを受ける - メロゴニーと呼ばれるプロセス。メロゴンの間に、新しい細胞に侵入するために放出される8つのメロゾイトを含むI型メロンが発達する。これらのメロゾイトは新しい細胞に侵入し、4つのメロゾイトを含むII型メロンに発展する。これらのメロゾサイトは、放出されると、細胞に感染し、マクロガモントおよびマイクロガモントに発症する。マイクロガメテスが放出され、成熟したザイゴットを産生するマクロガメテスを受精させる。成熟した卵胞は、その後内膜に放出される。卵嚢胞は、上皮を再感染させる直ちに排泄物を放出する薄い壁であるか、または次の宿主14に感染するために環境に放出される厚い壁である。クリプトスポリジウムライフサイクルのすべての段階は、我々のグループ10によって以前に開発されたオルガノイド培養システムで同定されている。
ヒトオルガノイドはヒト組織9、11、13を忠実に複製し、クリプトスポリジウム10のすべての複製段階をサポートするので、それらは研究する理想的な組織培養システムであるクリプトスポリジウム生物学と宿主寄生虫相互作用ここでは、クリプトスポリジウム卵胞子と排泄されたスポロゾイツの両方でオルガノイドに感染し、この組織培養システムで産生される新しい卵胞を分離する手順について説明する。

<table><tbody><tr><td>基底膜抽出物(細胞外マトリックス)</td><td>amsbio</td><td>3533-010-02</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Crypt-a-Glo抗体(オーシスト特異的抗体)</td><td>Waterborne, Inc</td><td>A400FLR-1X</td><td>最終濃度=2-3滴/スライドを使用</td></tr><tr><td>Crypto-Grab IgM coated Magnetic</td><td>beads Waterborne, Inc</td><td>IMS400-20</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dynamag 15ラック</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12301D</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dynamag 2ラック</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12321D</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EMDミリポア&nbsp;イソポアポリカーボネートメンブレンフィルター-3&micro;m</td><td>EMD-ミリポア</td><td>TSTP02500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ファストグリーン染料</td><td>SIGMA</td><td>F7252-5G&nbsp;&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Femtojet 4i マイクロインジェクター</td><td>エッペンドルフ</td><td>5252000013</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td></td> <td>φ1mmガラスキャピラリー</td></tr><tr><td>マトリゲル(細胞外マトリックス)</td><td>コーニング</td><td>356237</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>マイクロチューブ 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>T9661-1000EA</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>マイクロローダーチップ</td><td>Eppendorf</td><td>612-7933</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー P-97</td><td>シャッター計</td>器 <td>P-97</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ノーマルロバ セラム</td><td>バイオ・ラッド</td><td>C06SB</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ペンストレップ</td><td>ギブコ</td><td>15140-122</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>次亜塩素酸ナトリウム(5%使用)</td><td>クロロックス</td><td>50371478</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>スーパースティックスライド</td><td>ウォーターボーン社</td><td>S100-3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Swinnex-25 47 mmポリカーボネートフィルター</td><td>ホルダーEMD-Millipore</td><td>SX0002500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>タウロコール酸ナトリウム塩水和物</td><td>SIGMA</td><td>T4009-5G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>メルク</td><td>8221840500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ベクタシールド用封入剤</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Scientific industries, Inc</td><td>SI0236</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Adv+++ (DMEM+ペンストレップ+グルタマックス+ヘペス)</td><td>&nbsp;</強い></td><td><強い>&nbsp;</td><td>最終量</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>12634-010</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Penstrep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td> 5 <td>mL in 500 mL DMEM</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>500 mL DMEM</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630056</td><td>500 mL DMEM</td></tr> <tr><td>に 5 mL のストック 腸オルガノイド培地-OME(拡張培地)</td><td>&nbsp;</強い></td><td><強い>&nbsp;</td><td>最終濃度</td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939-50mg</td><td>0.5 &micro;M</td></tr><tr><td>ADV+++</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>100mLまで作る</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td>1x</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>Gastrin</td><td>Tocris</td><td>3006-1mg</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>NAC</td><td>Sigma</td><td>A9125-25G</td><td>1.25 mM</td></tr><tr><td>NIC</td><td>Sigma</td><td>N0636-100G</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Noggin CM</td><td>社内*</td><td>&nbsp;</td><td>10%</td></tr><tr><td>P38阻害剤(SB202190)</td><td>Sigma</td><td>S7076-25 mg</td><td>10 &micro;M</td></tr><tr><td>PGE2</td><td>Tocris</td><td>2296/10</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td>1 mL/500 mL 培地</td></tr><tr><td>RSpoI CM</td><td>社内*</td><td>&nbsp;</td><td>20%</td></tr><tr><td>Wnt3a CM</td><td>社内*</td><td>&nbsp;</td><td>50%</td></tr><tr><td>社内* - 細胞株はご要望に応じて提供されます</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>腸オルガノイド培地-OMD(分化培地)</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>オルガノイドを分化するために、拡大する小腸オルガノイドをWntリッチ培地で分裂後6〜7日間増殖させた後、分化培地で増殖させました(Wnt、ニコチンアミド、SB202190の回収)、分化培地での増殖(Wntリッチ培地またはOMEからのWnt、ニコチンアミド、SB202190、プロスタグランジンE2の回収)</td></tr><tr><td>LUNG ORGANOID MEDIA- LOM(分化培地)</td><td>&nbsp;</強い></td><td><強い>&nbsp;</td><td>最終濃度</td></tr><tr><td>Adv++</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>100mLまで作る</td></tr><tr><td>ALK-I A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939-50mg</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td>0.0763888889</td></tr><tr><td>FGF-10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>FGF-7</td><td>Peprotech</td><td>100-19</td><td>25 ng/mL</td></tr><tr><td>N-アセチルシステイン</td><td>Σ</td><td>A9125-25G</td><td>1.25 mM</td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td>Σ</td><td>N0636-100G</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>Noggin UPE</td><td>U-Protein Express</td><td>直接会社に連絡する</td><td>10%</td></tr><tr><td>p38 MAPK-I</td><td>Sigma</td><td>S7076-25 mg</td><td>1 &micro;M</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td>1:500</td></tr><tr><td>RhoKI Y-27632</td><td>Abmole Bioscience</td><td>M1817_100 mg</td><td>2.5 &micro;m</td></tr><tr><td>RSPO UPE</td><td>U-Protein Express</td><td>直接</td><td>10%</td></tr><tr><td>Reducing buffer (注射用オーシストおよびスポロゾイトの再懸濁用)</td><td>&nbsp;</強い></td><td><強い>&nbsp;</td><td>最終濃度</td></tr><tr><td>L-グルタチオン還元</td><td>Σ</td><td>G4251-10MG</td><td>0.5 &mu;g/&mu;OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>ベタイン</td><td>シグマ</td><td>61962</td><td>0.5 &mu;g/&mu;OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>L-システイン</td><td>シグマ</td><td>168149-2.5G</td><td>0.5 &mu;g/&mu;OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>リノール酸</td><td>Sigma</td><td>L1376-10MG</td><td>6.8 の L &mu;OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>タウリン</td><td>シグマ</td><td>T0625-10MG</td><td>0.5 &mu;g/&mu;OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>ブロッキングバッファー(免疫蛍光染色用)のL </td><td>&nbsp;</強い></td><td><強い>&nbsp;</td><td>最終濃度</td></tr><tr><td>ロバ/ヤギ血清</td><td>Bio-Rad</td><td>C06SB</td><td>2%</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo-Fisher</td><td>70011044</td><td>Make up to 100 mL</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Merck</td><td>P1379</td><td>0.1%</td></tr><tr><td>List of Antibodies used </td><td>&nbsp;</強い></td><td><強い>&nbsp;</強い></td><td><強い>&nbsp;</strong</td></tr><tr><td>>Alexa 568ヤギ抗ウサギ</td><td>Invitrogen</td><td>A-11011</td><td>希釈-1:500;RRID: AB_143157</td></tr><tr><td>Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- フルオレセイン標識抗体 Crypto-Glo</td><td>Waterborne, Inc</td><td>A400FLK</td><td>希釈率 - 1:200</td></tr><tr><td>Crypta-Grab IMS ビーズ - モノクローナル抗体反応性</td><td>Waterborne, Inc</td><td>IMS400-20</td><td>希釈液-1:500</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>D1306</td><td>希釈液-1:1,000;RRID:AB_2629482</td></tr>ファ<tr><td>ロイジン-アレクサ674</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>希釈-1:1,000;RRID:</td></tr><tr><td>R. M. O'が作製したAB_2620155ウサギ抗gp15抗体コナー(共著者)。</td><td>ご要望に応じて</td> ご要望<td>に応じて</td><td>希釈液-1:500</td></tr><tr><td>Sporo-Glo</td><td>Waterborne, Inc</td><td>A600FLR-1X</td><td>希釈液 - 1:200</td></tr></tbody></table>

マイクロインジェクションによる3d組織由来ヒトオルガノイド培養システムにおけるクリプトスポリジウム感染の研究

Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection

クリプトスポリジウムパルバムは、ヒト下痢症の主な原因の一つである。寄生虫の病理を理解し、効率的な薬剤を開発するためには、宿主の状態を要約するインビトロ培養システムが必要である。オルガノイドは、その起源の組織によく似ており、宿主と寄生虫の相互作用を研究するのに理想的です。オルガノイドは、成体幹細胞に由来し、遺伝的収差や形質転換を受けることなく長期間培養中に増殖する三次元(3D)組織由来構造である。それらは頂点および浴盤の表面との極性をよく定義した。オルガノイドは、薬物検査、バイオバンキング、疾患モデリングおよび宿主微生物相互作用研究において様々な用途を有する。ここでは、ヒトの腸および気道オルガノイドに感染するためのクリプトスポリジウムの卵胞およびスポロゾイツを調製する方法のステップバイステップのプロトコルを提示する。次に、マイクロインジェクションを使用して微生物をオルガノイド内膜に注入する方法を示します。オルガノイドを宿主微生物相互作用研究に使用できる主な方法は、マイクロインジェクション、機械的せん断、めっき、単層の作り方の3つがあります。マイクロインジェクションは3D構造の維持を可能にし、寄生虫の容積および微生物のための直接頂点の側面接触の精密な制御を可能にする。イメージングまたは卵嚢胞産生のためのオルガノイドの最適な成長のための詳細を提供します。最後に、新たに生成された卵胞をオルガノイドから単離して、さらに下流の処理と解析を行う方法も示します。

ここで提示されるプロトコルは、マイクロインジェクションの準備ができて卵母細胞およびスポロゾイツ(図1A)の効率的な精製をもたらす。排泄プロトコルは、約70~80%の卵胞からスポロゾイツを放出するので、残りの卵胞および貝殻を3μmフィルターを通してフィルタリングすることが不可欠である。濾過は、ほぼ100%のスポロゾイテ精製をもたらす(図1B)。さらに、緑色色素の添加は、すべてのオルガノイドの注入を確実にするのに役立ち、注射後少なくとも24時間の注入されたオルガノイドの可視化を可能にする(図2B)。
卵胞子およびスポロゾイツの調製のためのこれらのプロトコルは簡単で、長年にわたり使用されてきたので、処理された卵胞子および精製されたスポロゾイトは生存可能で感染性であることが期待される。しかし、我々の研究では、排泄プロセスがスポロゾイトまたは卵胞子に損傷を与えないことを確認するために、走査型電子顕微鏡を使用しました...

我々は、クリプトスポリジウムパルバムによるヒト腸および気道オルガノイドの感染を研究するための卵胞を調造し、スポロゾイツを精製するためのプロトコルを説明する。腸内臓器内膜への寄生虫のマイクロインジェクションとオルガノイドの免疫染色の手順を示す.最後に、オルガノイドから発生した卵胞の単離について述べた。

マイクロインジェクションによる3D組織由来ヒトオルガノイド培養システムにおけるクリプトスポリジウム感染の研究

Cryptosporidium parvum is one of the major causes of human diarrheal disease. To understand the pathology of the parasite and develop efficient drugs, an ...

このスポロゾアイト精製およびマイクロインジェクション手順を用いて、本質的に任意の宿主微生物が、任意の組織由来臓器系で研究され得る。この技術を用いて、オルガノイドの内腔またはオルガノイドの尖体側に注入される純粋なスポロゾイトの量を制御することができます。C.parvum sporozoitesを精製するには、ウーストシットを15ミリリットルチューブに移し、ミリリットル剥離培地濃度あたり10回から7番目のウーストシットで細胞を再懸濁する。摂氏37度で60~90分後、適切な洗浄液をウーシストと14ミリリットル混合し、遠心分離により細胞を沈下する。上清を慎重に吸引して、ウーストシストを失うことを避け、SporozoicペレットをDMEM濃度の1〜2ミリリットルあたり3倍の10〜7番目のウースト胞で再懸濁させる。残りのウーシストとシェルを取り除くために、3マイクロメートルの孔サイズのポリカーボネートフィルターを取り付けた47ミリリットルのフィルターホルダー装置を装備した10ミリリットルのシリンジバレルを摂氏4度の15ミリリットルチューブに入れる。7.5ミリリットルのスポロゾアイト懸濁液をフィルターアセンブリに加えます。全体のボリュームが重力によってストレーナーを通過したら、DMEMの別の7.5ミリリットルでストレーナーを通して残りの細胞を洗います。すべての洗浄がストレーナーを通過したら、濾過したスポロゾイト懸濁液を10分間遠心分離して回収し、適切なオルガノイド培地の50〜100マイクロリットルにペレットをラベル付けし、0.05%速緑色染料、L-グルタチオン、ベタイン、L-システイン、リノール酸、およびtola酸を含む。3Dオルガノイドの補助側に寄生虫をマイクロインジェクトするには、まずマイクロピペットプーラーを使用してガラス注入毛細血管を調製する。鉗子を使用して毛細管の先端を9〜12マイクロメートルの直径に切断し、胞子またはウーストシストの流れが容易に可能にし、マイクロローダーの先端を使用して、ウーストシストまたはスポロゾアイト懸濁液とラベル付けされた速い緑色の染料で各毛細管を満たします。次に、最初のスポロゾイト充填毛細管をマイクロインジェクターにロードし、5倍の倍率で反転した顕微鏡を使用し、各オルガノイドに懸濁液の100〜200ナノリットルをマイクロ注入するために一定の圧力を使用します。この排泄プロトコルは、胞子の約70〜80%からスポロゾイトの放出をもたらす。したがって、残りのウーシストシェルを3マイクロメートルのろ過によって除外することが不可欠です。全く100%の無嚢胞を取り除く。さらに、緑色の色素の添加は、オルガノイドの全ての注入を確実にするのに役立ち、注射後少なくとも24時間は注入されたオルガノイドの可視化を可能にする。これはよく実践された方法ですが、走査電子顕微鏡を使用して、除菌プロセスが胞子やうっ子嚢胞に損傷を与えないようにすることができます。オルガノイド内腔への同量のウーシストの注入は、単純な顕微鏡イメージングによって視覚的に確認することができる。免疫蛍光アッセイは、クリプトスポリジウムに感染している細胞の種類を探索するためにも使用できます。分化されたオルガノイドが5日間感染した後、ウーシスト内のスポロゾイトの存在は、オーシスストの一部を粘着スライドに乾燥させ、卵嚢をメタノールで固定し、DAPI染色を適切な卵嚢特異的抗体と組み合わせることによって確認することができる。最大の結果を得るには、新鮮なウースト胞を使用し、すべての注射に同じ毛細血管を使用し、注射後毎日培地を交換します。この技術を用いて、様々な研究室がホストと微生物の相互作用を研究するためにオルガノイドを使用し始めています。私たちは、同様のオルガノイド微小培養の設定で、コメンサルだけでなく、他の病原体を研究しています。クリプトスポリジウムはヒト寄生虫であるため、レベル2の安全規則に従ってこれらの実験を行うことが重要です。

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Immunology and Infection

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