Name: 細菌におけるタンパク質-RNA結合を定量するためのアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: 学ぶ 細菌細胞内でRNA結合タンパク質とRNAの結合親和性を定量化する生細胞アッセイ法。レポーター遺伝子阻害を利用し、in vivoでのタンパク質-RNA相互作用を解析する。プラスミド設計の最適化により、高信頼性の測定が可能となる。

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このプロジェクトは、計画予算委員会のI-COREプログラムとイスラエル科学財団(助成金第152/11)、マリー・キュリー再統合助成金第1号から資金を受け取りました。PCIG11-GA- 2012-321675、および補助金契約第664918号の下で欧州連合のホライズン2020研究革新プログラムから - MRG-文法。

1. システムの準備
<ol><li>結合部位プラスミドの設計
	<ol>
<li>図 1に示すように、バインディング サイト カセットを設計します。各ミニ遺伝子は、以下の部分(5'〜3'):Eagl制限部位、カナマイシン(Kan)耐性遺伝子の5'末端の40塩基、pLac-Araプロモーター、リボソーム結合部位(RBS)、mCherry遺伝子のAUG、スペーサー(δ)、RBP結合部位、5'末端の80塩基を含むmCherry遺伝子、およびApaLI制限部位の。 注:アッセイの成功率を高めるために、各結合部位に対して3つの結合部位カセットを設計し、スペーサーは少なくとも1つ、2つ、および3つのベースで構成される。その他のガイドラインについては、「代表的な結果」セクションを参照してください。</li>
	</ol></li>
	<li>結合部位プラスミドのクローニング
	<ol>
<li>結合部位カセットを二本鎖DNA(dsDNA)ミニ遺伝子として注文します。各ミニ遺伝子は500bpの長さで、それぞれ5'と3'の端にEagl制限部位とApaLI制限部位が含まれています(ステップ1.1.1を参照)。 注:本実験では、カナマイシン遺伝子の半分を含むミニ遺伝子を、陽性コロニーのスクリーニングを容易にするよう命じた。しかしながら、ギブソンアセンブリ17もまた、ここで適しており、その場合、結合部位は2つのより短い相補的な一本鎖DNAオリゴとして発注することができる。</li>
		<li>制限プロトコル18によりEagl-HFおよびApaLIを用いてミニ遺伝子と標的ベクターの両方を二重消化し、カラム精製19.</li>
		<li>消化されたミニ遺伝子を、残りのmCherryレポーター遺伝子、ターミネーター、およびカナマイシン耐性遺伝子20を含む結合部位バックボーンにライゲートする。</li>
		<li>ライゲーション溶液を大腸菌TOP10細胞21に変換する。</li>
		<li>サンガーシーケンスを使用して正の形質転換体を識別します。<ol>
<li>対象地域に上流のプライマー 100 基を設計します (プライマー シーケンスについては、表 1を参照してください)。</li>
			<li>ミニプレップいくつかの細菌のコロニー22.</li>
			<li>プライマーの5 mM溶液の5 μLと80 ng/μL濃度でDNAの10 μLを調出します。</li>
			<li>2 つのソリューションをサンガー シーケンシング23の便利な施設に送信します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>精製プラスミドを-20°Cで貯蔵し、グリセロールストック24として細菌株を、いずれも96ウェル形式で保存する。DNAは、4つの融合RBPプラスミドのいずれかを含む大腸菌TOP10細胞への形質転換に使用されます(ステップ1.3.5参照)。</li>
	</ol></li>
	<li>RBPプラスミドの設計と建設 注:本研究で用いられるコートタンパク質のアミノ酸およびヌクレオチド配列は表2に記載されている。<ol>
<li>制限部位を持つストップコドンを欠くカスタムオーダーdsDNAミニジーンとしてストップコドンを欠いている必要なRBP配列を注文します(図1)。</li>
		<li>試験済みのRBPを、誘導性プロモーターの直下流に停止コドンを欠き、開始コドンを欠く蛍光タンパク質の上流(図1)を、ステップ1.2.2-1.2.4と同様にクローンする。RBPプラスミドに結合部位プラスミドとは異なる抗生物質耐性遺伝子が含まれていることを確認してください。</li>
		<li>ステップ 1.2.5 と同様に、Sanger シーケンスを使用して正の変換体を識別します (プライマー シーケンスについては表 1を参照)。</li>
		<li>1つの正の形質転換剤を選択し、それを化学的に有能な25にする。グリセロール精製プラスミドを-20°C、96ウェルプレートで-80°Cで-80°Cの細菌株24のグリセロールストックとして保存する。</li>
		<li>96ウェルプレートに保存された結合部位プラスミド(ステップ1.2.6から)を、RBP-mCeruleanプラスミド21を既に含む化学的に有能な細菌細胞に変換する。時間を節約するために、ペトリ皿に細胞をめっきする代わりに、ルリア・ベルタニ(LB)26寒天を含む8レーンプレートに8チャンネルのピペッターを使用して、関連する抗生物質(カンとアンプ)を使用してプレートを付けます。コロニーは16時間で現れるはずです。</li>
		<li>各二重形質転換剤に対して単一のコロニーを選択し、関連する抗生物質(カンおよびアンプ)とLB培地で一晩成長し、96ウェルプレートで-80°Cでグリセロールストック24として保存します。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 実験設定
注:ここで提示されるプロトコルは、インキュベーターおよびプレートリーダーと組み合わせて液体処理ロボットシステムを用いて行った。各測定は、24のインデューサー濃度について行い、各株+インデューサーの組み合わせに対して2つの複製を用いて行った。このロボットシステムを用いて、24のインデューサー濃度を有する1日あたり16株のデータを収集した。しかし、このようなデバイスが利用できない場合、または必要な実験が少ない場合は、8チャンネルのマルチピペットを使用して、それに応じてプロトコルを適応させることが容易に行えます。例えば、12インデューサー濃度と4つのタイムポイントを有する1日あたり4株の予備結果は、このように取得された。
<ol><li>調製は、予め、0.5gのトリプトン、0.3mLのグリセロール、5.8gのナクル、1M MgSO4の50mL、10倍リン酸緩衝生理食生(PBS)バッファーpH7.4、および950mLの二重蒸し水(DL)を混合して、1Lのバイオアッセイバッファー(BA)を調製する。オートクレーブまたは無菌フィルタBAバッファ。</li>
	<li>適切な抗生物質(25μg/mLの最終濃度でカナマイシン、最終濃度100μg/mLでアンピシリン)を1.5mL LBで振る37°Cおよび250rpmで二重形質菌株を48ウェルプレートで、18時間(一晩)に成長させます。</li>
	<li>
午前中は、以下の準備をしてください。
	<ol>
<li></li><li><li><li><li></ol></li><li></li></ol><ol><li> </li><li><ol><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq1.jpg"> </li><li> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq2.jpg"> </li><li> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq3.jpg"> </li></ol></li><li></li></ol><ol><li> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq4.jpg"> </li><li> </li><li> <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq5.jpg"> </li></ol>

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<li>Luria-Bertani (LB) Medium Preparation · Benchling. , Available from:
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</ol>

著者は何も開示していない。

本稿に記載の方法は、大腸菌細胞におけるRBP-RNA結合親和性の生体内測定を容易にする。プロトコルは比較的簡単で、高度な機械を使用せずに行うことができ、データ分析は簡単です。さらに、結果は、次世代シーケンシング(NGS)結果に関連する比較的長い待ち時間なしで、すぐに生成されます。
この方法の 1 つの制限は、細菌細胞でのみ動作することです。.しかしながら、以前の研究12は、哺乳動物細胞におけるL7AE RBPに対する同様のアプローチを用いて抑圧効果を実証している。この方法の追加の制限は、mCherry開始領域における結合部位の挿入が基底mCherryレベルを抑圧しうる点である。結合部位の構造的複雑さまたは高い安定性は、RBPが存在しない場合でもリボソーム開始を妨げることができ、その結果mCherry基底レベルが低下する。基底レベルが低すぎる場合、RBPの濃度を増加させることによってもたらされる追加の抑圧は観察できません。このような場合には、開始領域にまだ結合部位を持つ結合部位カセットを設計するのが最善であるが、開始領...

RNA結合タンパク質(RBP)ベースの転写後調節、特にRBPとRNAとの相互作用の特徴付けは、ここ数十年で広範囲に研究されている。RbP阻害に起因する細菌における翻訳下調節の複数の例があり、または直接競合する、リボソーム結合1、2、3。合成生物学の分野では、RBP-RNA相互作用は転写ベースの遺伝回路4、5の設計のための重要なツールとして出現している。従って、このようなRBP-RNA相互作用の特性化に対する需要が細胞コンテキスト内で増加している。
タンパク質-RNA相互作用を研究するための最も一般的な方法は、インビトロ設定に限定される電気泳動シフトアッセイ(EMSA)6、およびCLIP法8、9を含む様々なプルダウンアッセイ7である。.このような方法は、デノボRNA結合部位の発見を可能にする一方で、労働集約的なプロトコルや高価な深いシーケンシング反応などの欠点に苦しんでおり、RBPプルダウンに対する特定の抗体を必要とする場合があります。RNAがその環境に対して感受性を持つため、多くの因子がRBP-RNA相互作用に影響を与える可能性があり、細胞コンテキストにおけるRBP-RNA結合を調知することの重要性を強調する。例えば、我々と他の人は、インビボとインビトロ10、11におけるRNA構造の間に有意な差を示した。
以前の研究12のアプローチに基づいて、我々は最近、バクテリオファージGA 13、MS214、PP715、およびQβ16からカプシドRBP用に事前に設計された結合部位を配置する際に10を実証した。レポーターmRNAの翻訳開始領域は、レポーター表現が強く抑圧されている。この抑圧現象に基づいて比較的単純で定量的な方法を提示し、生体内のRBPと対応するRNA結合部位との間の親和性を測定する。

<table><tbody><tr><td>アンピシリンナトリウム塩</td><td>SIGMA</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム (MgSO4)</td><td>ALFA AESAR</td><td>33337</td><td></td></tr><tr><td>48 プレート</td><td>Axygen</td><td>P-5ML-48-C-S</td><td></td></tr><tr><td>8 レーンプレート</td><td>Axygen</td><td>RESMW8I</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェルプレート</td><td>Axygen</td><td>P-DW-20-C</td><td></td></tr><tr><td>プレートリーダー用 96 ウェルプレート</td><td>Perkin Elmer</td><td>6005029</td><td></td></tr><tr><td>ApaLI</td><td>NEB</td><td>R0507</td><td></td></tr><tr><td>結合部位配列</td><td>Gen9 Inc. および Twist Bioscience</td><td></td><td>表 1</td></tr><tr><td>E. coli TOP10 細胞</td><td>Invitrogen</td><td>C404006</td><td></td></tr><tr><td>Eagl-HF</td><td>NEB</td><td>R3505</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>BIO LAB</td><td>071205</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>TECAN</td><td>liconicインキュベーター</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin solfate</td><td>SIGMA</td><td>K4000</td><td></td></tr><tr><td>KpnI- HF</td><td>NEB</td><td>R0142</td><td></td></tr><tr><td>Ligase</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>液体処理ロボットシステム</td><td>TECAN</td><td>EVO 100, MCA 96チャンネル</td><td></td></tr><tr><td>Matlab分析ソフトウェア</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multi- pipette 8レーン</td><td>Axygen</td><td>BR703710</td><td></td></tr><tr><td>N-ブタノイル-L-ホモセリンラクトン (C4-HSL)</td> <td>cayman</td><td>K40982552 019</td><td></td></tr><tr><td>PBS buffer</td><td>Biological Industries</td><td>020235A</td><td></td></tr><tr><td>Platereader</td><td>TECAN</td><td>Infinite F200 PRO</td><td></td></tr><tr><td>Q5 HotStart Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0493</td><td></td></tr><tr><td>RBP seqeunces</td><td>Addgene</td><td>27121 &40650</td><td>表 2</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCL)</td><td>BIO LAB</td><td>190305</td><td></td></tr><tr><td>SV ゲルおよび PCR クリーンアップ システム</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>トリプトン</td><td>BD</td><td>211705</td><td></td></tr></tbody></table> を参照してください。

細菌におけるタンパク質-rna結合を定量するためのアッセイ

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

タンパク質翻訳の開始ステップでは、リボソームはmRNAの開始領域に結合する。翻訳開始は、リボソーム結合を妨げるmRNAの開始領域へのRNA結合タンパク質(RBP)の結合によって遮断されうる。提示された方法では、このブロッキング現象を利用して、その認知部位および非認知結合部位に対するRBPの結合親和性を定量化する。これを行うには、レポーターmRNAの開始領域に試験結合部位を挿入し、試験RBPの発現を誘導する。RBP-RNA結合の場合、RBP濃度の関数としてレポーター発現のシグモイド式の抑圧を観察した。結合部位とRBPとの間に親和性がないか、または非常に低い親和性の場合、有意な抑圧は認められなかった。この方法は、生きた細菌細胞で行われ、高価な機械や洗練された機械を必要としません。これは、細菌で機能する異なるBRBの結合親和性を、設計された結合部位のセットと定量化し、比較するのに有用である。この方法は、構造の複雑度が高い部位をバインドする場合には不適切な場合があります。これは、RBPが存在しない場合に複雑なmRNA構造によるリボソーム開始の抑圧の可能性に起因し、これは基底レポーター遺伝子発現を低下させ、したがってRBP結合時に観察可能なレポーターの抑圧をもたらす。

提示された方法は、mRNA分子に結合するためのRBPとリボソームとの間の競争を利用する(図1)。この競争は、インデューサーの濃度の増加に起因するRBP-mCeruleanの生産増加の関数としてmCherryレベルを減少させることによって反映されます。mCerulean蛍光を増加させる場合、mCherryに有意な変化はなく、RBP結合の欠如が推測される。正と負のひずみの両方の代表的な結果を図 2に示します。図 2Aでは、OD チャネル、mCherry チャネル、および mCerulean チャネルは、T0 = 1 h および Tファイナル= 3.5 h で、4 時間の範囲にわたって時間とインデューサーの関数として表示されます。図2Bにおいて、平均mCerulean蛍光(上)およびmCherryの...

この方法では、細菌細胞における簡潔な生きたレポーターアッセイを用いて、RNA結合タンパク質(RBP)の結合親和性を、簡潔で生きたレポーターアッセイを用いて認知および非認知結合部位に定量する。アッセイはレポーター遺伝子の抑圧に基づいています。

細菌におけるタンパク質-RNA結合を定量するためのアッセイ

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

RNAの複雑な性質とタンパク質との相互作用に影響を与える多くの要因により、生体内でのRNAに結合するタンパク質の特性評価は依然として大きな課題です。RNA結合タンパク質またはRBP-RNAアフィニティーは、生きた細菌細胞の内部で測定される。細胞環境はRNAとRBP-RNA結合の両方の構造に影響を与えるので、生体内の親和性を測定することは、自然界におけるそのような相互作用を理解するために重要です。成功の秘訣はプラスミドのデザインにある。設計はデルタのいくつかの波を使用し、停止コドンおよびフレームシフト突然変異の挿入を避けるべきである。バインド サイト カセットを設計して、このプロトコルを開始します。各ミニ遺伝子には、EagI制限部位、カナマイシン耐性遺伝子の5つの素端から40塩基、pLac/Araプロモーター、リボソーム結合部位、mCherry遺伝子のAUG、スペーサー、RBP結合部位、mCherry遺伝子の5つの素端から80塩基、およびApaLI制限部位が含まれている。アッセイの成功率を高めるために、少なくとも1つ、2つおよび3つの塩基からなるスペーサーを備えた結合部位ごとに3つの結合部位カセットを設計する。小遺伝子と標的ベクターの両方をEagI HFおよびApaLIで二重消化してから、消化器のカラム精製を行う。消化したミニ遺伝子を、mCherryレポーター遺伝子の残りの部分、ターミネーターおよびカナマイシン耐性遺伝子を含む結合部位バックボーンにリゲートする。次に、ライゲーション溶液を、大腸菌トップ10細胞に変換する。サンガーシーケンシングを介して正の形質転換体を同定した後、精製プラスミドをマイナス20°Cで96ウェル形式で保存します。また、マイナス80°Cで96ウェル形式でグリセロールストックとして細菌株を保存します。エンドに制限部位を有する二本鎖DNAミニ遺伝子としてストップコドンを欠いた必要なRBP配列をカスタムオーダーする。調製したプラスミドを、RBP mCeruleanプラスミドを既に含む化学的に有能な細菌細胞に変換します。時間を節約するために、関連する抗生物質とルリア・ベルタニ寒天を含む8レーンプレートに8チャネルピペッタを使用して細胞をプレートします。コロニーは摂氏37度で16時間で表示する必要があります。各二重変性剤のための単一のコロニーを選択し、適切な抗生物質とLBの1.5ミリリットルを含む48ウェルプレートに移す。250 RPMで摂氏37度で18時間の期間にわたって細胞を成長させます。96ウェルプレートでマイナス80°Cのグリセロール在庫として一晩保存します。午前中には、96ウェルプレートで180マイクロリットルの半細孔媒体またはSPMを暖かくするようにロボットをプログラムします。インデューサープレートを準備するロボットをプログラムします。きれいな96の井戸の版で、95%BAおよび5%LBから成るSPMと井戸を準備する。ウェルの数は、誘導体濃度の所望の数に対応します。最高のインデューサー濃度を含むインデューサプレートのウェルにC4-HSLを加えます。次に、最高濃度の井戸のそれぞれから、ゼロから218ナノモルまでの23の低濃度に培地を連続的に希釈するようにロボットをプログラムします。各誘導体希釈の体積は、すべての株に対して十分であるべきである。一晩の株を希釈するには、48ウェルプレートに180マイクロリットルのSPMと20マイクロリットルの細菌を混合することによって、ロボットを10倍に希釈するようにプログラムします。次に、希釈溶液から20マイクロリットルを蛍光測定に適した事前調製された歪みプレートに取り込んで、10の倍率で再び希釈する。次に、最終的な濃度に応じて希釈された歪みで、インデューサプレートから96ウェルプレートに希釈されたインデューサーを追加するようにロボットをプログラムします。摂氏37度で96のウェルプレートを6時間振ります。その間、595ナノメートルの光学密度またはODの測定を行い、30分ごとにプレートリーダーを介してmCherryとmCerulean蛍光を測定します。正規化のために、細胞を加えたものなしでSPMの成長を測定する。ここに示されているのは、正の歪みの3次元プロットです。プロットは、時間および誘導体濃度の関数として生のODレベル、mCerulean蛍光、およびmCherry蛍光を描いている。mCerulean定常式レベルは、正および負の両方の株に対する各誘導体濃度について計算した。mCherryの生産速度は、正と負の両方の株の各誘導体濃度についても計算した。mCherryの生産速度は、2株に対して2つの生物学的重複を平均した平均mCerulean蛍光の関数としてプロットした。フィッティング式を用いたフィットKRBPは、特定の結合応答を示す正のひずみについて示される。負のひずみについては、KRBP値は抽出されなかった。正規化された用量応答曲線は、異なる場所で10の結合部位として2つのRMPに基づいて30の異なる株について決定した。3種類の応答が観察され、高い親和性、低親和性、および親和性がない。ここに示されているのは、2つのRBP、MS2コートタンパク質およびPP7コートタンパク質と10の異なる結合部位カセットの定量的KRBP結果である。4つの異なる場所で変異結合部位を有するMS2コートタンパク質の用量応答曲線は、mCherry産生に対する変異間隔の影響を示すためにここに示されている。テストされた変異結合部位のシーケンスが表示されます。タンパク質RNA複合体の構造を化学的にプローブし、RNA結合によって影響を受けるmRNA領域を可視化するために、形状シークなどの構造技術を使用することが重要です。最近、この手法を高スループット方式で使用して、RPSの結合部位を10,000個に同時に測定しました。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

このビデオは、リガンドアッセイの差動放射状毛細血管作用を示しています。これは、細胞内ヌクレオチドのセカンドメッセンジャー結合タンパク質の体系的なハイスループットスクリーニングの技術です。この技術により、細胞溶解物中の過剰発現した標的タンパク質にメッセンジャーを直接結合させることができ、タンパク質精製の必要性を回避できます。...

リガンドアッセイの差動放射状毛細管作用:細菌ヌクレオチドセカンドメッセンジャー結合細胞内タンパク質を同定するためのハイスループット技術

このビデオでは、RNA結合タンパク質(RBP)とRNAの相互作用を研究するための細菌のin...

標的遺伝子の翻訳制御を研究するためのレポーター遺伝子抑制アッセイ

このビデオでは、mRNAのアデニル酸ウリジル酸リッチエレメント(ARE)配列と相互作用するRNA結合タンパク質(RBP)を同定するためのin vitro...

アフィニティー抽出による RNA-Binding Protein の単離のための RNA-Protein プルダウンアッセイ

このビデオでは、目的の標的タンパク質の特定のRNA結合配列を特定するための指数関数的濃縮(SELEX)法によるリガンドの系統的な進化について説明します。タンパク質は、ランダム化されたRNA配列の大規模なプールとインキュベートされ、タンパク質結合RNA配列は単離され、PCR増幅され、それらのタンパク質結合部位を同定するために配列決定されます。...

RNA-タンパク質相互作用を同定するためのSELEXベースのIn Vitro結合アッセイ

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定性的には生体試料中のRNAおよびDNAを区別するために迅速比色アッセイ

我々は、DNAと転写因子との相互作用を測定するための定量的なDNA結合性、ELISAベースのアッセイを開発した。 RUNX2タンパク質に対して高い特異性は、コンセンサスDNA認識オリゴヌクレオチドと特異的モノクローナル抗体を用いて達成された。酵素結合抗体基質反応と比色検出をリアルタイムでモニターした。...

遺伝子発現のDNA相互作用、ディスカバー転写レギュレータ、および新規抗腫瘍剤を同定：タンパク質を研究するために、定量的アッセイ

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特定の RNA シーケンスを結合するタンパク質は、遺伝子発現の重要な役割を果たします。これらの結合部位の詳細な特性解析は遺伝子の規則の私達の理解にとって重要です。ここでは、RNA タンパク質結合部位の飽和突然変異導入のシングル ステップ アプローチを説明しています。このアプローチは、RNA...

ホスホロチオエートを使用して RNA の結合蛋白質の新規飽和突然変異誘発方法: シングル ステップの特性

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リガンドアッセイの微小径毛管作用による小リガンドの結合タンパク質の同定(DRaCALA)

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ここでは、ヒト細胞からの総タンパク質抽出物、ビオチン化RNAでコーティングされたストレプトアビジンビーズ、および質量分析を使用して、特定のRNA配列のタンパク質相互作用因子を発見、定量、および検証するための最適化された in vitro メソッドを紹介します。...

短いビオチン化RNAを用いたRNA結合タンパク質の最適化された定量的プルダウン解析(英語)

学ぶ 細菌細胞内でRNA結合タンパク質とRNAの結合親和性を定量化する生細胞アッセイ法。レポーター遺伝子阻害を利用し、in vivoでのタンパク質-RNA相互作用を解析する。プラスミド設計の最適化により、高信頼性の測定が可能となる。

細菌におけるタンパク質-RNA結合を定量するためのアッセイ

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