好中球系統細胞の質量細胞法解析に対する全骨髄の調製

ここでは、好中球系統細胞の高次元質量細胞法(Time-Of-Flight、CyTOFによるサイトメトリー)分析のために、マウスまたはヒトから単離された新鮮な骨髄(BM)を処理するプロトコルを提示する。

この質量サイトメトリープロトコルは、骨髄全体の完全性を維持し、研究対象細胞の分析のための従来のサンプル調製中に失われた情報を救出することを可能にする。この迅速で楽な骨髄分離プロトコルは、まれな好中球系のサブセットのような生存可能な短命骨髄細胞集団の獲得を促進する。質量サイトメトリーを使用して、好中球系細胞などの免疫細胞の下で以前に同定することは、多種多様な疾患に対して広範な意味を持つ可能性がある。

このプロトコルは、骨髄に存在する短命骨髄細胞の完全性を維持し、固形腫瘍などの他の組織タイプに容易に適用することができる。私たちは、可能な限りユーザーフレンドリーにするためにプロトコルに簡素化しましたが、すべての生物学的研究と同様に、管理するためにいくつかの練習実行が必要な場合があります。初めてこれを行うときは、最初にすべての試薬を準備してから、厳密にプロトコルに従うことができます。

問題が発生した場合は、CyTOForum に接続して、トラブルシューティングに役立つ他の CyTOF ユーザーと話すことができます。生物学的サンプル調製の場合、簡単なトリックは最終的な結果と大きな違いを生み出すことができます。視覚的なデモンストレーションは、新しいユーザーがプロトコルを把握する方がはるかに簡単です。

初めてこれを行う場合は、最初に試薬を準備してから、プロトコルに厳密に従うことができます。骨髄の収穫のために、無菌外科用パッドの上の位置に6〜10週齢のC57黒6マウスを置き、腹部および後肢を殺菌するために70%エタノールを使用する。麻酔用のハサミを使って腹腔を開き、皮膚を取り除いて後肢を露出させます。

鈍い先端のドレッシング鉗子のペアを使用して、足首のすぐ下にマウス脛知を保持し、鈍い先端ドレッシング鉗子の下の脛を安定させるために湾曲したドレッシング鉗子のペアを使用しています。鈍い先端のドレッシング鉗子を使用して脛骨を壊し、骨を露出させるために筋肉を取り除きます。冷たいPBSに脛骨を置く前に、安定した湾曲したドレッシング鉗子を大腿骨に動かし、膝関節の下に鈍い先端のドレッシング鉗子をスライドさせて膝蓋骨を保持します。

膝蓋骨を脱臼し、膝蓋骨から筋肉を取り除いて大腿骨を露出させる。湾曲したドレッシング鉗子で露出した大腿骨を保持し、手術用はさみを使用して骨の底から大腿骨を切断する。次に大腿骨をPBSに入れる。

次に、18ゲージの針を使用して0.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに穴を開け、骨の開いた端が穴に下向きのチューブに両方の骨を置きます。0.5ミリリットルチューブを1.7ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに入れ、二重層チューブをマイクロ遠心分離機で回転させます。遠心分離の終わりに、骨髄がチューブの底部に抽出されたことを確認します。

細胞量測定のために骨髄細胞を染色するには、骨髄を1ミリリットルの赤血球のリシスバッファーに室温で10分間再懸濁させる。インキュベーションの終了時に、遠心分離によって細胞を収集し、冷たいPBSの1ミリリットルでペレットを再懸濁する。70マイクロメートルのストレーナーを通して15ミリリットルの円錐形チューブに細胞をフィルターし、新鮮で冷たいPBSの9ミリリットルで細胞を洗います。

骨髄細胞ペレットを10ミリリットルの新鮮な冷たいPBSで再び中断し、新しい15ミリリットルチューブに6番目の細胞アリコートに5回10を移す。遠心分離によって細胞を収集し、1ミリリットルの質量サイトメトリー染色バッファーで細胞を再懸濁し、125ナノモルシスプラチンを補う。室温で5分後、新鮮な質量サイトメトリーバッファーの4ミリリットルで細胞を洗浄します。

FC受容体遮断溶液の50マイクロリットルでペレットを再懸濁する。摂氏4度で10分後、対象となる抗体カクテル50マイクロリットルを細胞に加え、穏やかにピペットを加えて混合します。異なるインキュベーションステップの温度は、骨髄細胞の生存率を維持する上で非常に重要です。

摂氏4度で30分後、1回の洗浄ごとに新鮮な質量サイトメトリーバッファーの2ミリリットルで細胞を2回洗浄してから、室温で1.6%ホルムアルデヒドを1ミリリットルで再懸濁します。インキュベーションの終了時に、遠心分離によって細胞を収集し、125ナノモルインターカレーション溶液を補った固定パーマバッファーの1ミリリットルでペレットを再び摂氏4度でインキュベーションします。細胞を質量細胞量計で分析する前に、細胞懸濁液を穏やかに渦液と遠心分離してから、2ミリリットルの新鮮な質量サイトメトリー染色バッファーで細胞を洗浄する。

次に、細胞を1回の洗浄につき蒸留水1ミリリットルで2回洗浄し、2回目の洗浄後に上澄み剤を慎重に吸引してから、細胞を質量細胞質計バッファー濃度のミリリットル当たり10倍の6細胞に再懸濁させる。このT分布ストカシス隣接埋め込みプロットでは、複数のマウス組織にわたる細胞を、33パラメータ質量サイトメトリーパネルで測定した表面マーカー発現プロファイルの類似性に基づいてサブセットにクラスタ化した。類似した特性を持つセルは、各セル上のこれらのマーカーの式に基づいて自動的に一緒にクラスタ化されました。

この方法を用いて、骨髄全体の完全性が維持され、好中球および造血幹細胞および造血細胞のシグネチャー表面マーカーを同時に共発現させる未知の細胞集団の発見につながった。この細胞集団は、以前に骨髄系前駆細胞研究で省略されたが、Ly6G陽性細胞枯渇のために、表面マーカー発現の明確なパターンを示す。さらに重要なことに、これらのデータは、Ly6Gを発現しないLy6G陽性細胞クラスターの小さなサブセットの発見につながったが、CD117陽性Ly6G陽性細胞に密接にクラスター化され、この質量細胞細胞測定実験で使用された33表面マーカーの発現に基づく好中球系統との類似性を示唆した。

その後、13色の蛍光活性化細胞選別パネルを構築することができ、下流機能アッセイのフローサイトメトリーによる好中球前駆物質の分離を可能にする。骨髄の分離手順をできるだけ早く行い、染色手順中に細胞を摂氏4度に保つことが重要です。