Name: 好中球系統細胞の質量細胞法解析に対する全骨髄の調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 学ぶ全骨髄の質量細胞法解析プロトコル。マウスまたはヒト由来の骨髄から短命な骨髄系細胞の健全性を保持し、希少な好中球系細胞集団の解析を可能にします。免疫細胞研究に有用です。

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LJIフローサイトメトリーコアに対して、質量サイトメトリー手順の支援を賜りますようお礼申し上げます。この作業は、NIH助成金R01HL134236、P01HL136275、およびR01CA202987(すべてC.C.H)およびADA7-12-MN-31(04)(C.C.H.およびY.P.Z)によってサポートされました。

すべての実験は、アレルギーと免疫学動物のケアと使用委員会のためのラホヤ研究所の承認されたガイドラインに従って、げっ歯類の使用のための承認は、アレルギーと免疫学のためのラホヤ研究所から記載された基準に従って得られました国立衛生研究所の実験動物のケアと使用に関するガイド。
1. 収穫マウス骨髄(BM)
<ol><li>商用ベンダーから C57BL/6J マウスを購入します。病原体のない施設で、標準的なげっ歯類のチョウダイエットと家をミクロイソレーターケージで養います。</li>
	<li>実験目的で、生後6~10週の雄マウスを使用する。CO2吸入によって安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を起ます。</li>
	<li>マウスを腹部側を上にして無菌手術パッドの上に置きます。70%エタノールを噴霧することにより、腹部および後肢領域の皮膚を殺菌する。解剖外科はさみを使用して腹腔を開きます。</li>
	<li>後肢を露出させるために皮膚を取り除きます。鈍い先端のドレッシング鉗子のペアを使用して、足首のすぐ下にマウス脛痛を保持します。別の湾曲したドレッシング鉗子を使用して、鈍い先端のドレッシング鉗子の下の脛間を安定させます。脛骨を壊し、鈍い先端のドレッシング鉗子で筋肉を引き裂くことによって骨を露出させる。 注:脛科は膝関節にゆるやかに取り付けられ、鈍い先端のドレッシング鉗子を使用して容易に選ぶことができる。</li>
	<li>脛間を冷たい1x PBSに置く。</li>
	<li>次に、安定した湾曲したドレッシング鉗子を大腿骨に下方に動かす。鈍い先端のドレッシング鉗子を膝関節の下にスライドさせ、膝蓋骨を保持します。膝蓋骨をそっと引き上げて脱臼します。膝蓋骨に取り付けられた筋肉を引き裂いて大腿骨を露出させる。湾曲したドレッシング鉗子によって露出した大腿骨を保持し、解剖外科はさみを使用して骨の底から大腿骨を切り取ります。</li>
	<li>大腿骨を冷たい1x PBSに置く。</li>
	<li>18 G 針で 0.5 mL マイクロ遠心管に穴を開けます。</li>
	<li>脛骨と大腿骨の両方を同じ0.5 mLマイクロ遠心管に入れ、骨の開いた端を穴に向けます。</li>
	<li>脛骨と大腿骨の両方を含む0.5 mLチューブを1.7mLマイクロ遠心管に入れます。</li>
	<li>脛骨と大腿骨の両方を含む二重層チューブをマイクロ遠心分離機で30秒の5,510 x gで回転させます。</li>
	<li>BMが骨から抽出され、チューブの下部にペレットが付いていることを確認します。神聖な骨を含む0.5 mLチューブを50.5 mLを与えます。マウス BM は次のステップの準備ができています。 注:ヒトBMは、前述の11として臨床資源で収穫される。</li>
</ol>2. CyTOF用染色BM細胞
<ol><li>1 mL 1x 赤血球(RBC)リシスバッファーでBMを再中断します。ヒトBMの場合、BM全体を1x赤血球(RBC)の10倍の体積で再中断する。室温(RT)で10分間インキュベートします。</li>
	<li>チューブを350 x gで5分間4°Cで回転させます。人間の BM の場合は、ステップ 2.3 に進む前にステップ 2.1 と 2.2 を繰り返します。</li>
	<li>慎重に上清を吸引し、ペレットを中断しないままにします。1 mLの冷たい1x PBSでペレットを再中断します。70 μm セル ストレーナーを通して 15 mL 円錐管にペレットをろ過します。BM細胞は現在、筋肉や骨の破片からチューブに完全に分離されています。チューブに9 mLの冷たい1x PBSを加えて細胞を洗浄します。</li>
	<li>15 mL チューブを 350 x gで 5 分間 4 °C で回転させます。</li>
	<li>上清を注意深く吸引し、10 mLの冷たいPBSでBM細胞を再中断する。カウントするセルのアリコートを取ります。ヘモサイトメーターを使用して細胞を数えます。</li>
	<li>CyTOF染色のための新しい15 mL管にアリコート5 x 106 BM細胞。</li>
	<li>15 mL チューブ アリコートを 350 x gで 5 分間 4 °C で回転させます。</li>
	<li>上清を注意深く吸引し、サンプルの生存率指標としてCyTOF染色バッファーの1mLで125 nMシスプラチンでBM細胞を再中断します。RTで5分間インキュベートします。</li>
	<li>インキュベーション後、チューブに4mLのCyTOF染色バッファーを添加する。チューブを350 x gで5分間4°Cで回転させます。ヒトBMの場合、CyTOF染色バッファーに10%のヒトAB血清を添加する。</li>
	<li>上清を注意深く吸引し、50 μLのFc受容体遮断液でBM細胞を再中断する。4°Cで10分間インキュベートします。人間の BM の場合は、この手順をスキップします。</li>
	<li>自家製CyTOF抗体カクテル5の50μLをサンプルに加え、総染色量が100μLに達するようにする。ミックスする穏やかなピペット。4°Cで30分間インキュベートします。抗体カクテルの最終容積は、マウスBMおよびヒトBMサンプルの両方に対して100μLである。</li>
	<li>細胞を洗浄するためにインキュベーション後の各チューブにCyTOF染色バッファーの2 mLを追加し、4°Cで5分間350 x gでチューブを回転させます。</li>
	<li>合計 2 回の洗い流しについて、手順 2.12 を繰り返します。</li>
	<li>16%のストックアンプルから新鮮な1.6%ホルムアルデヒド溶液を準備します。ストックホルムアルデヒドの1部を1x PBSの9部で希釈します。</li>
	<li>慎重に上清を吸引し、1 mL新鮮な1.6%FA溶液でペレットを再中断します。RTで15分間インキュベートします。</li>
	<li>チューブを800 x gで5分間4°Cで回転させます。</li>
	<li>上清を注意深く吸引し、1mL固定/パーマバッファ内の125 nMインターカレーション溶液でセルペレットを再中断します。</li>
	<li>4°Cで一晩インターカレーション溶液でサンプルをインキュベートします。</li>
</ol>3. CyTOF取得のための細胞の準備
<ol><li>4°Cで5分間800 x gで穏やかに渦および紡錘細胞。</li>
	<li>CyTOF染色バッファーの2mLを添加して細胞を洗浄し、4°Cで5分間800xgで細胞をスピンし、吸引により上清を除去する。</li>
	<li>diH2O の 1 mL で細胞を再中断し、各チューブから少量 (約 10 μL) を予約して細胞を数えます。</li>
	<li>4°Cで5分間800 x gで細胞を回転させます。</li>
	<li>手順 3.3 と 3.4 を繰り返します。</li>
	<li>慎重に上清を吸引し、ペレットに細胞を残します。BM細胞は、CyTOF取得のための1 x 106細胞/mLの濃度に再懸濁する準備が整いました。</li>
</ol>

<ol><li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404, 193-197 (2000).</li>
<li>Iwasaki, H., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+lineage+commitment+from+the+hematopoietic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell.</a> Immunity. 26, 726-740 (2007).</li>
<li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).</li>
<li>Becher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+analysis+of+the+murine+myeloid+cell+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system.</a> Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).</li>
<li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li>
<li>Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+mapping+of+phenotype+space+with+single-cell+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated mapping of phenotype space with single-cell data.</a> Nature Methods. 13, 493-496 (2016).</li>
<li>Zhu, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+Early+Unipotent+Neutrophil+Progenitor+with+Pro-tumoral+Activity+in+Mouse+and+Human+Bone+Marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow.</a> Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).</li>
<li>Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+High-Dimensional+Data+Using+t-SNE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Machine+Learning+Research%22%5BJournal%5D)">Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).</li>
<li>Amir, E. A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).</li>
<li>van der Maaten, L., Hinton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+data+using+t-SNE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Machine+Learning+Research%22%5BJournal%5D)">Visualizing data using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9 (85), 2579-2065 (2008).</li>
<li>Cloos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Protocol+to+Sample+and+Process+Bone+Marrow+for+Measuring+Measurable+Residual+Disease+and+Leukemic+Stem+Cells+in+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia.</a> Journal of Visualized Experiment. 133, 56386(2018).</li>
<li>Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deep+profiler%E2%80%99s+guide+to+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">A deep profiler’s guide to cytometry.</a> Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).</li>
<li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%3A+New+insights+and+open+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils: New insights and open questions.</a> Science Immunology. 3 (30), 4579(2018).</li>
<li>Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of neutrophils.</a> Nature Reviews in Immunology. , (2019).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

過去数十年にわたり、蛍光ベースのフローサイトメトリーは、細胞系統および不均一性1、2、3を研究する主な方法として使用された。フローサイトメトリーは多次元データを提供していますが、この方法はパラメータとスペクトルの重なりの選択によって制限されます。フローサイトメトリーの弱点を克服するために、蛍光体の代わりに重金属同位体を使用して、検出器チャネル間のクロストークや細胞の自己蛍光を排除する抗体を標識するCyTOFを利用し、多くの測定を行うことができます。単一細胞レベルで同時により多くのパラメータを生成し、細胞多様性12のより深い評価を生成します。枯渇またはゲーティングプロセス中に過去に省略された細胞集団、特に好中球系統細胞のような重要な免疫細胞は、長い間均質であると考えられていた13、14、CyTOF</s...

過去数十年の間に、サイトメトリー法はBMの人工システムを調査するための強力なツールとなっています。これらの方法には、蛍光活性化フローサイトメトリーおよび重金属標識抗体を用いたCyTOFの新しい方法が含まれる。彼らは、独自の表面マーカー発現プロファイルを同定することにより、異種生物標本における多くの細胞型の発見につながった。より多くのチャネルに関連するスペクトルの重複が増加すると、蛍光活性化フローサイトメトリーアプリケーションのデータ不正確性が高くなります。したがって、蛍光活性化フローサイトメトリー分析のために目的の細胞集団を濃縮するために、不要な細胞を日常的に除去する。例えば、Ly6G(またはGr-1)およびCD11bは成熟した骨髄細胞マーカーと見なされ、Ly6G+(またはGr-1+)およびCD11b+細胞は、フローサイトメトリー分析の前に磁気濃縮キットを使用してBMサンプルから定期的に除去される。造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)または1つのダンプカクテルチャネル1、2、3でこれらのマーカーを組み合わせることによって。もう一つの例は、好中球がヒト血液試料から日常的に除去され、免疫学的研究のために末梢血単核細胞(PBMC)を濃縮することである。しかし、マウスまたはヒトから分離された全骨髄は、サイトメトリー分析のために無傷で調査されることはめったにない。
最近、CyTOFは、ヘマトポエティックシステム4、5、6を調査するための画期的なツールとなっています。CyTOFでは、フルオロフォ標識抗体は、重元素レポーター標識抗体に置き換えられます。この方法は、スペクトルの重なりを気にすることなく、同時に40以上のマーカーの測定を可能にします。それは前の枯渇のステップかダンプチャネルなしで無傷の生物標本の分析を可能にした。そのため、従来の2次元フローサイトメトリープロットから高含有量の次元性を持つヘマトポエティックシステムを総合的に見ることができます。枯渇またはゲーティングプロセス中に過去に省略された細胞集団は、CyTOF4,5によって生成された高次元データを用いて明らかになるようになりました。我々は、骨髄リネージ7に焦点を当てた血統系の39のパラメータを同時に測定する抗体パネルを設計した。従来のフローサイトメトリーデータと比較して、CyTOFによって生成された前例のない単一細胞高次元データの解釈と可視化は困難です。計算科学者は、高次元データセットの可視化のための次元低減技術を開発しました。本稿では、T分散確率的近傍埋め込み(t-SNE)技術を用いてCyTOFデータを解析し、高次元構造を保存しながら2次元地図上で高次元結果を提示するアルゴリズムviSNEを用いた。データの8,9,10.tSNE プロットでは、同様のセルがサブセットにクラスタ化され、色を使用してセルのフィーチャが強調表示されます。例えば、図1では、ミエロイド細胞は、CyTOF(図1)4に起因する33の表面マーカーの発現パターンの類似性に基づいて、複数の細胞サブセットに分布している。ここでは、viSNE分析7により、以前に報告された39マーカーCyTOFパネルを用いてマウス骨髄を調べた。CyTOFデータのviSNE分析は、HSPC(CD117+)と好中球(Ly6G+)特性(図2)7の両方を示した未確認細胞集団を明らかにした。
結論として、我々はCyTOF分析のための新鮮な全骨髄を処理するためのプロトコルを提示する。この記事では、マウスの骨髄を例に、このプロトコルはヒト骨髄サンプルの処理にも使用できます。ヒト骨髄サンプルに特異的な詳細は、プロトコルにも記載されています。このプロトコルの利点は、インキュベーション時間や温度などの詳細が含まれており、骨髄全体の好中球系統細胞を維持し、無傷の骨髄全体の調査を可能にする。このプロトコルは、蛍光活性化フローサイトメトリーアプリケーションに対しても容易に改変されてもよい。

<table><tbody><tr><td>CyTOF抗体 (マウス)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD45 (クローン 30-F11) -89Y</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3089005B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3176002B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 120402;RRID:AB_961070</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD115 (CSF-1R) (クローン AFS98)-精製</td><td>バイオレジェンド</td><td>ネコ# 135502;RRID:AB_1937293</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3166004B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 101101;RRID:AB_312774</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3148003B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3142003B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD127 (IL-7R&alpha;) (Clone A7R34)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 133919;RRID:AB_2565433</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3167004B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD16.2 (Fc&gamma;RIV) (クローン 9E9) - 精製</td><td>されたバイオレジェンド</td><td>ネコ # 149502;RRID:AB_2565302</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD162(クローン4RA10(RUO))-精製</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>Cat# 557787;RRID:AB_647340</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD169(Siglec-1)(クローン3D6.112)-精製</td><td>バイオレジェンド</td><td>猫#142402;RRID:AB_10916523</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD182(CXCR2)(クローンSA044G4)-精製</td><td>バイオレジェンド</td><td>猫#149302;RRID:AB_2565277</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD183(クローンCXCR3-173)-精製</td><td>バイオレジェンド</td><td>猫#126502;RRID:AB_1027635</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 137625;RRID:AB_2563744</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD34(クローンMEC14.7)-精製</td><td>バイオレジェンド</td><td>猫#119302;RRID:AB_345280</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 133919;RRID:AB_2565433</td><td></td></tr><tr><td>アンチマウス CD43 (クローン S11)-146Nd</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3146009B</td><td></td></tr><tr><td>アンチマウス CD48 (クローン HM48.1)-156Gd</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3156012B</td><td></td></tr><tr><td>アンチマウス CD62L (クローン MEL-14)-MaxPar Ready</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# 14-1351-82;RRID:AB_467481</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD71(クローンRI7217)-精製</td><td>バイオレジェンド</td><td>猫#113802;RRID:AB_313563</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD90(クローンG7)-精製</td><td>バイオレジェンド</td><td>猫#105202;RRID:AB_313169</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3159009B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Fc&epsilon;RI&alpha;(クローンMAR-1)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 134321;RRID:AB_2563768</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスGM-CSF(MP1-22E9(RUO))-精製</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>Cat#554404;RRID:AB_395370</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3174003B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 556003;RRID:AB_396287</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Ly-6A/E (SCA-1) (Clone D7)-169Tm</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3169015B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified</td><td>abcam</td><td>Cat# ab53457;RRID:AB_881409</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 127637;RRID:AB_2563784</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス NK1.1 (クローン PK136)-165Ho</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3165018B</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス Siglec-F (クローン E50-2440 (RUO))-精製</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 552125;RRID:AB_394340</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスTCR&β;(クローンH57-597)-143Nd</td><td>Fluidigm</td><td>(クローンH57-597)-143Nd</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells(クローンTER-119)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 116241;RRID:AB_2563789</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibody Stabilizer</td><td>CANDOR Bioscience</td><td>Cat# 130050</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# A4503</td><td></td></tr><tr><td>Cisplatin-194Pt</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 201194</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience 1x RBC Lysis Buffer</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# 00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Foxp3 / 転写因子染色バッファーセット</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# 00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>EQ Four Element Calibration Beads</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 201078</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Omega Scientific</td><td>Cat# FB-02</td><td></td></tr><tr><td>HyClone リン酸緩衝生理食塩水</td><td>GE Lifesciences</td><td>Cat#SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Intercalator-IR</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 201192B</td><td></td></tr><tr><td>MAXPAR 抗体ラベリングキット</td><td>Fluidigm</td><td>http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# 158127</td><td></td></tr><tr><td>アジ</td><td>化ナトリウムシグマ・アルドリッチ</td><td>Cat# S2002</td><td></td></tr><tr><td>トリトン&nbsp;X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# X100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 1x</td><td>Corning</td><td>Cat# 25-053-CL</td><td></td></tr><tr><td>実験モデル: Organism/Stockins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse: C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Stock No: 000664</td><td></td></tr><tr><td>Software Alogrithm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bead-based Normalizer</td><td>Finck et al., 2013</td><td>https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf</td><td></td></tr><tr><td>Cytobank</td><td></td> <td>Cytobank</td> https://www.cytobank.org/ <td></td></tr><tr><td>Cytofkit v1.r.0</td><td>Chen et al., 2016</td><td>https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html</td><td></td></tr><tr><td>t-SNE</td><td>van der Maaten andヒントン, 2008</td><td>https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

好中球系統細胞の質量細胞法解析に対する全骨髄の調製

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

本稿では、BM CyTOF分析全体のために新しいBMで好中球系統細胞を保存するように最適化されたプロトコルを紹介する。このプロトコルを用いて、好中球系統細胞に焦点を当てた血統系を評価するために、骨髄バイアス39抗体CyTOFパネルを用いた。CyTOFの結果は、オープンリソースの次元低減アルゴリズムviSNEで分析され、データがこのプロトコルの結果を実証するために提示された。我々は、このプロトコルに基づいて新しい好中球系統細胞集団を発見した。新鮮な全BM調製のこのプロトコルは、1)、CyTOF分析を用いて、BM全体から未確認の細胞集団を発見し、2、白血病などの血液疾患を有する患者に対する全BM欠陥を調査し、3)の最適化を支援する。新鮮な全体BMを利用する蛍光活性化フローサイトメトリープロトコル。

図1は、CyTOF実験の結果として示す。このtSNEプロットでは、複数のマウス組織にまたがる細胞を、33パラメータCyTOFパネルによって測定された表面マーカー発現プロファイルの類似性に基づいてサブセットにクラスタ化した。より類似した特性を有する細胞は、各細胞の33マーカーの発現に基づいて、好中球、マクロファージ、またはDCなどの細胞を自動的に集積させた。
図2は、本研究で提示したプロトコルを用いてマウスBM CyTOF実験の実施例として提示される。プロトコルはBM全体の完全性を維持し、好中球(Ly6G +、図2A)とHSPC(CD117+、図2B)シグネチャ表面マーカーを共発現する未知の細胞集団の発見につながる。同時。この細胞集団は、当社のCyTOFパネル(図...

ここでは、好中球系統細胞の高次元質量細胞法(Time-Of-Flight、CyTOFによるサイトメトリー)分析のために、マウスまたはヒトから単離された新鮮な骨髄(BM)を処理するプロトコルを提示する。

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

この質量サイトメトリープロトコルは、骨髄全体の完全性を維持し、研究対象細胞の分析のための従来のサンプル調製中に失われた情報を救出することを可能にする。この迅速で楽な骨髄分離プロトコルは、まれな好中球系のサブセットのような生存可能な短命骨髄細胞集団の獲得を促進する。質量サイトメトリーを使用して、好中球系細胞などの免疫細胞の下で以前に同定することは、多種多様な疾患に対して広範な意味を持つ可能性がある。このプロトコルは、骨髄に存在する短命骨髄細胞の完全性を維持し、固形腫瘍などの他の組織タイプに容易に適用することができる。私たちは、可能な限りユーザーフレンドリーにするためにプロトコルに簡素化しましたが、すべての生物学的研究と同様に、管理するためにいくつかの練習実行が必要な場合があります。初めてこれを行うときは、最初にすべての試薬を準備してから、厳密にプロトコルに従うことができます。問題が発生した場合は、CyTOForum に接続して、トラブルシューティングに役立つ他の CyTOF ユーザーと話すことができます。生物学的サンプル調製の場合、簡単なトリックは最終的な結果と大きな違いを生み出すことができます。視覚的なデモンストレーションは、新しいユーザーがプロトコルを把握する方がはるかに簡単です。初めてこれを行う場合は、最初に試薬を準備してから、プロトコルに厳密に従うことができます。骨髄の収穫のために、無菌外科用パッドの上の位置に6〜10週齢のC57黒6マウスを置き、腹部および後肢を殺菌するために70%エタノールを使用する。麻酔用のハサミを使って腹腔を開き、皮膚を取り除いて後肢を露出させます。鈍い先端のドレッシング鉗子のペアを使用して、足首のすぐ下にマウス脛知を保持し、鈍い先端ドレッシング鉗子の下の脛を安定させるために湾曲したドレッシング鉗子のペアを使用しています。鈍い先端のドレッシング鉗子を使用して脛骨を壊し、骨を露出させるために筋肉を取り除きます。冷たいPBSに脛骨を置く前に、安定した湾曲したドレッシング鉗子を大腿骨に動かし、膝関節の下に鈍い先端のドレッシング鉗子をスライドさせて膝蓋骨を保持します。膝蓋骨を脱臼し、膝蓋骨から筋肉を取り除いて大腿骨を露出させる。湾曲したドレッシング鉗子で露出した大腿骨を保持し、手術用はさみを使用して骨の底から大腿骨を切断する。次に大腿骨をPBSに入れる。次に、18ゲージの針を使用して0.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに穴を開け、骨の開いた端が穴に下向きのチューブに両方の骨を置きます。0.5ミリリットルチューブを1.7ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに入れ、二重層チューブをマイクロ遠心分離機で回転させます。遠心分離の終わりに、骨髄がチューブの底部に抽出されたことを確認します。細胞量測定のために骨髄細胞を染色するには、骨髄を1ミリリットルの赤血球のリシスバッファーに室温で10分間再懸濁させる。インキュベーションの終了時に、遠心分離によって細胞を収集し、冷たいPBSの1ミリリットルでペレットを再懸濁する。70マイクロメートルのストレーナーを通して15ミリリットルの円錐形チューブに細胞をフィルターし、新鮮で冷たいPBSの9ミリリットルで細胞を洗います。骨髄細胞ペレットを10ミリリットルの新鮮な冷たいPBSで再び中断し、新しい15ミリリットルチューブに6番目の細胞アリコートに5回10を移す。遠心分離によって細胞を収集し、1ミリリットルの質量サイトメトリー染色バッファーで細胞を再懸濁し、125ナノモルシスプラチンを補う。室温で5分後、新鮮な質量サイトメトリーバッファーの4ミリリットルで細胞を洗浄します。FC受容体遮断溶液の50マイクロリットルでペレットを再懸濁する。摂氏4度で10分後、対象となる抗体カクテル50マイクロリットルを細胞に加え、穏やかにピペットを加えて混合します。異なるインキュベーションステップの温度は、骨髄細胞の生存率を維持する上で非常に重要です。摂氏4度で30分後、1回の洗浄ごとに新鮮な質量サイトメトリーバッファーの2ミリリットルで細胞を2回洗浄してから、室温で1.6%ホルムアルデヒドを1ミリリットルで再懸濁します。インキュベーションの終了時に、遠心分離によって細胞を収集し、125ナノモルインターカレーション溶液を補った固定パーマバッファーの1ミリリットルでペレットを再び摂氏4度でインキュベーションします。細胞を質量細胞量計で分析する前に、細胞懸濁液を穏やかに渦液と遠心分離してから、2ミリリットルの新鮮な質量サイトメトリー染色バッファーで細胞を洗浄する。次に、細胞を1回の洗浄につき蒸留水1ミリリットルで2回洗浄し、2回目の洗浄後に上澄み剤を慎重に吸引してから、細胞を質量細胞質計バッファー濃度のミリリットル当たり10倍の6細胞に再懸濁させる。このT分布ストカシス隣接埋め込みプロットでは、複数のマウス組織にわたる細胞を、33パラメータ質量サイトメトリーパネルで測定した表面マーカー発現プロファイルの類似性に基づいてサブセットにクラスタ化した。類似した特性を持つセルは、各セル上のこれらのマーカーの式に基づいて自動的に一緒にクラスタ化されました。この方法を用いて、骨髄全体の完全性が維持され、好中球および造血幹細胞および造血細胞のシグネチャー表面マーカーを同時に共発現させる未知の細胞集団の発見につながった。この細胞集団は、以前に骨髄系前駆細胞研究で省略されたが、Ly6G陽性細胞枯渇のために、表面マーカー発現の明確なパターンを示す。さらに重要なことに、これらのデータは、Ly6Gを発現しないLy6G陽性細胞クラスターの小さなサブセットの発見につながったが、CD117陽性Ly6G陽性細胞に密接にクラスター化され、この質量細胞細胞測定実験で使用された33表面マーカーの発現に基づく好中球系統との類似性を示唆した。その後、13色の蛍光活性化細胞選別パネルを構築することができ、下流機能アッセイのフローサイトメトリーによる好中球前駆物質の分離を可能にする。骨髄の分離手順をできるだけ早く行い、染色手順中に細胞を摂氏4度に保つことが重要です。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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データベース ガイド-フローサイトメトリー評価骨髄骨髄細胞の成熟のため

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単一核マルチオームアッセイのための高品質脳および骨髄核調製(英語)

ここでは、骨髄異形成症候群および急性骨髄性白血病のマウスモデルから骨髄微小環境集団を分離および特徴付けるための詳細なプロトコルが提示されます。この技術は、疾患の進行に伴う内皮細胞や間葉系間質細胞を含む非造血骨髄ニッチの変化を特定します。...

骨髄異形成症候群および急性骨髄性白血病における骨髄微小環境集団の同定

この原稿では、マウスの骨髄から好中球のATAC-seqライブラリーを調製するためのプロトコルを概説し、最適な好中球の生存率と高いライブラリー品質を保証することを目的としています。BMCの調製、免疫磁気ソーティング、およびライブラリ構築に関するステップバイステップの説明を提供し、特に好中球の研究に新規参入する人にとって貴重なガイドとして機能します。...

マウス骨髄由来好中球のATAC-Seqライブラリー調製

学ぶ全骨髄の質量細胞法解析プロトコル。マウスまたはヒト由来の骨髄から短命な骨髄系細胞の健全性を保持し、希少な好中球系細胞集団の解析を可能にします。免疫細胞研究に有用です。

好中球系統細胞の質量細胞法解析に対する全骨髄の調製

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